Isolering av aktiv caenorhabditt elegans kjernefysisk ekstrakt og rekonstituering for in vitro transkripsjon

Summary

Her beskriver vi en detaljert protokoll for å isolere aktivt atomekstrakt fra larvaltrinn 4 C. elegans og visualisere transkripsjonsaktivitet i et in vitro-system .

Abstract

Caenorhabditis elegans har vært et viktig modellsystem for biologisk forskning siden det ble introdusert i 1963. Imidlertid har C. elegans ikke blitt fullt utnyttet i den biokjemiske studien av biologiske reaksjoner ved hjelp av sine kjernefysiske ekstrakter som in vitro transkripsjon og DNA-replikasjon. Et betydelig hinder for å bruke C. elegans i biokjemiske studier forstyrrer nematodens tykke ytre kutikal uten å ofre aktiviteten til atomekstraktet. Mens flere metoder brukes til å bryte kutiklet, for eksempel Dounce homogenisering eller sonikering, fører de ofte til protein ustabilitet. Det er ingen etablerte protokoller for å isolere aktive atomproteiner fra larve eller voksne C. elegans for in vitro-reaksjoner . Her beskriver protokollen i detalj homogeniseringen av larvetrinn 4 C. elegans ved hjelp av en Balch homogenisator. Balch homogenisator bruker trykk for å sakte tvinge dyrene gjennom et smalt gap som bryter kutiklet i prosessen. Den ensartede designen og presis maskinering av Balch homogenisator muliggjør konsekvent sliping av dyr mellom eksperimenter. Fraksjonering av homogenatet oppnådd fra Balch homogenisator gir funksjonelt aktiv kjernefysisk ekstrakt som kan brukes i en in vitro-metode for analyse av transkripsjonsaktivitet av C. elegans.

Introduction

Den lille, frittlevende nematoden Caenorhabditis elegans er en enkel, men kraftig modellorganisme for å adressere et bredt spekter av biologiske spørsmål. Siden introduksjonen i 1963 har nematodene vært uvurderlige for å svare på spørsmål innen nevrobiologi, metabolisme, aldring, utvikling, immunitet og ^genetikk1. Noen av dyrets mange egenskaper som gjør det til en ideell modellorganisme inkluderer kort generasjonstid, effektiviteten av RNA-interferens, gjennomsiktig kropp og de ferdige kartene over både cellulær avstamning og nervesystem.

Mens nematodens bidrag til vitenskapen er enorme, har de blitt underbrukt for å belyse det eukaryote transkripsjonssystemet, med det meste av vår forståelse om disse mekanismene som kommer fra studier som bruker atomekstrakt fra gjær, fruktflue og ^{pattedyrcellekultur2}. Det største hinderet som fraråder forskere å trekke ut funksjonell atomekstrakt er nematodens tøffe ytre kutikal. Dette eksoskjelettet består av krysskoblede kollagener, cuticlins, glykoproteiner og lipider, noe som gjør C. elegans fra larvalstadium til voksen alder motstandsdyktig mot proteinutvinning via kjemiske eller mekaniske ^krefter3. Et in vitro transkripsjonssystem ved hjelp av C. elegans kjernefysisk ekstrakt ble en gang utviklet, men ikke allment vedtatt på grunn av systemets begrensede omfang, og bruken av Dounce homogenisator for å forberede ekstraktet kan føre til protein ^{ustabilitet4,5}.

I motsetning til den forrige protokollen for kjernefysisk ekstraktisolasjon som brukte en Dounce homogenisator for å bryte C. elegans, bruker denne protokollen en Balch homogenisator. Balch homogenisator består av to hovedkomponenter: en wolframkarbidkule og en blokk i rustfritt stål med en kanal som kjeder seg gjennom fra den ene enden til den andre. Balch homogenisator er lastet med wolframkarbidkulen og avkortet på hver side for å forsegle slipekammeret. Sprøyter kan lastes på de to vertikale portene som fører inn i slipekammeret. Når materialet overføres fra den ene sprøyten til den andre gjennom slipekammeret, tvinger trykket fra sprøytene materialet gjennom et smalt gap mellom ballen og veggen av kammeret. Dette langsomme og konstante trykket bryter materialet til det når en konsistent størrelse som lett kan passere gjennom det smale gapet. Å tvinge C. elegans gjennom det smale gapet via et konstant, men mildt trykk bryter dyrene åpne, og frigjør innholdet i den omkringliggende bufferen. Veksling av kulestørrelser strammer gapet ytterligere, bryter de nylig utgitte cellene og frigjør kjernene i bufferen. Flere tilfeller av sentrifugering skiller kjernene fra resten av celleavfallet, noe som muliggjør innsamling av et rent atomekstrakt. Balch homogenisator er foretrukket fremfor Dounce homogenisator av flere grunner: systemet kan håndtere et stort antall dyr, noe som gjør det mulig å trekke ut en høy mengde aktive proteiner i et enkelt forsøk; den nøyaktige maskineringen av ballene og stålblokken gir konsistent sliping mellom flere prøver; Den tunge stålblokken fungerer som en kjøleribbe, og trekker ensartet varme bort fra slipekammeret, og forhindrer denaturering.

Etter isolasjon må den kjernefysiske ekstrakttranskripsjonsaktiviteten verifiseres før den brukes i biokjemiske eksperimenter. Tradisjonelt ble transkripsjonsaktivitet målt ved hjelp av radiomerkede nukleotider for å spore og visualisere den nylig syntetiserte RNA. Radioaktiv merking kan imidlertid være belastende, da det krever forsiktighet under bruk og ^avhending6. Teknologiske fremskritt gjør det mulig for forskere i dag å bruke mye mindre skadelige eller plagsomme metoder for å måle selv små RNA-mengder ved hjelp av teknikker som kvantitativ sanntids PCR (qRT-PCR)⁷. Her beskriver protokollen en metode for å isolere aktivt kjernefysisk ekstrakt fra larvaltrinn 4 (L4) C. elegans og visualisere transkripsjonsaktivitet i et in vitro-system.

Protocol

1. Medieforberedelser

1. Forbered steril lysogenibuljong (LB) agarplater og flytende medier i henhold til produsentens instruksjoner.
2. Streak Escherichia coli (E. coli) strekker OP50 på en LB agar plate. Inkuber bakteriene ved 37 °C over natten.
3. Oppbevar E. coli OP50-strekplaten ved 4 °C etter inkubasjon. E. coli OP50-platen kan trygt oppbevares ved 4 °C i 2 uker hvis den pakkes inn i parafilm for å forhindre fuktighetstap.
4. Forbered 2 L av Nematode Growth Media (NGM) ved hjelp av oppskriften i tabell 1.
   MERK: Nystatin er valgfritt. Nystatin bidrar til å forhindre mugg, og andre soppkontaminerer vokser på NGM-platene. De store platene med en diameter på 150 mm har større sjanse for å fange soppsporer når lokket fjernes for helling og såing av E. coli OP50. Nystatin kan kjøpes forblanding i steril oppløsning fra leverandører ved 10.000 enheter/ml eller kan kjøpes som et sterilt pulver og blandes med sterilt vann. Nystatin kan ikke autoklaveres, og det kan heller ikke effektivt filtreres sterilisert. Oppmerksomhet til aseptisk teknikk er avgjørende mens du blander en løsning av nystatin i laboratoriet. Autoklav 1 M _CaCl2, 1 M _KPO4 pH 6,0 og 1 M _MgSO4 ved 121 °C i 15 minutter. Filtrer steriliser kolesterol gjennom et 0,22 μm filter etter å ha blitt oppløst i 95% etanol.
5. Etter å ha lagt reagensene til media, hell NGM i førti 150 mm Petri-retter. Hver 150 mm tallerken krever 50 ml for å fylle. La NGM-platene avkjøles over natten ved romtemperatur.
6. Inokuler to koniske rør på 50 ml som inneholder 25 ml steril LB med E. coli OP50 fra den forrige strekplaten. Inkuber buljongen ved 37 °C i 24 timer i en ristende inkubator opprettholdt ved 200 o/min.
   MERK: For konsistens inokulerer du begge rørene med samme enkeltkoloni fra strekplaten. Hvis dette viser seg vanskelig, inokuler 5 ml steril LB med en enkelt koloni i et 50 ml konisk rør og inkuber kulturen i 16 timer ved 37 °C i en ristende inkubator opprettholdt ved 200 o/min dagen før du forbereder NGM-platene. Oppbevar den friske flytende kulturen ved 4 °C i opptil to dager. Inokuler de to 25 ml kjøttkraft med 25 μL flytende kultur og inkuber under de samme forholdene som nevnt ovenfor.
7. Frø ferske NGM-plater med 1 ml fersk E. coli OP50 flytende kultur og spredt med en flammesterilisert spreder jevnt over overflaten av platen aseptisk for å skape en stor bakterie plen som dekker mesteparten av platen, pass på å ikke spre bakteriene fra kant til kant. La E. coli OP50 vokse ved romtemperatur i 72-96 timer eller til en synlig tykk plen vises.
   MERK: Etter 24 timer flytter du de nyseedede NGM-platene til en tildekket beholder for å redusere fukttapet og forlenge platenes levetid.

2. Dyreforberedelser og blekemiddelsynkronisering

1. Overfør 5 velfødde, villtype, gravid voksne C. elegans til hver av de 10 ferske NGM-platene som er sådd med E. coli OP50, for totalt 50 dyr.
2. La dyrene legge egg. La avkommet vokse ved 20 °C til de når voksenstadiet.
3. Bruk 15 ml M9 buffer (tabell 2) for å samle den nye godt matede villtypen, gravide voksne fra de ti vedlikeholdsplatene og overfør dyrene til et merket konisk rør på 15 ml.
4. Sentrifuger dyrene på 1000 x g i 3 min for å pellet alle dyr på bunnen av røret.
5. Bland 2 ml blekemiddel med 5 ml 1 N NaOH for blekemiddelsynkronisering i et separat, merket konisk rør på 15 ml. Virvel løsningen for å blande grundig.
   MERK: Bruk blekemiddelet + NaOH-oppløsningen samme dag som den er forberedt på å være effektiv.
6. Fjern forsiktig supernatanten fra de sentrifugede dyrene ved hjelp av en 10 ml steril pipette. Forsøk å fjerne så mye M9-buffer som mulig for å forbedre dyrebruddet.
7. Tilsett 500 μL blekemiddel + NaOH-løsning til dyrepelleten og start en timer i 4 min.
8. Enten for hånd eller ved hjelp av en rocker, rock forsiktig røret for å bryte dyrepellet helt og la dyrene bevege seg fritt i blekemiddelet + NaOH-løsningen. Fortsett å gynge røret i hele 4 min varighet.
   MERK: Mengden blekemiddel + NaOH-løsning som trengs, kan variere avhengig av størrelsen på dyrepelleten som synkroniseres. Optimaliser denne teknikken på forhånd med varierende mengder dyr og blekemiddel + NaOH-løsning.
9. Etter 4 min, kontroller bruddeffektiviteten under et disseksjonsmikroskop. Forsikre deg om at et flertall av de voksne dyrene er ødelagt, og deres indre innhold frigjøres, inkludert eggene.
10. Hvis dyrene ikke er delt åpne, virveler røret kort med maksimal hastighet, og kontroller deretter igjen under mikroskopet.
    MERK: Mens eggene er motstandsdyktige mot blekemiddelet + NaOH-løsningen, er de ikke ugjennomtrengelige. Egg må ikke utsettes for blekemiddel + NaOH-oppløsning lenger enn nødvendig. Stalling for lenge under dyrebruddstrinnet kan føre til utviklingsproblemer for avkom.
11. Tilsett 10 ml av M9-bufferen til den ødelagte dyreløsningen.
12. Sentrifuger eggene og restene på 1000 x g i 3 min.
13. Pipette supernatanten bort, sørg for ikke å berøre den nye pelletsen som inneholder alle eggene på bunnen av røret.
14. Tilsett ytterligere 10 ml av M9-bufferen og sentrifugen igjen i 3 minutter ved 1000 x g.
15. Gjenta trinn 2.13-2.14 to ganger til for å sikre at ingen av blekemiddel + NaOH-løsningen forblir.
16. Etter den tredje M9-buffervasken fjerner du supernatanten og tilsetter 10 ml av S-basalbufferen (tabell 2).
17. Snu røret for å bryte pelletsen nederst for å suspendere eggene likt i bufferen.
18. Plasser røret på en rocker og rock forsiktig røret i 22 timer ved 20 °C for å la eggene klekkes og nå larvtrinn 1 (L1) arrest.
19. Etter 22 timer sentrifugerer du røret som inneholder synkroniserte L1-dyr i 3 min ved 1000 x g.
20. Pipette og kast supernatanten og la det være ca. 1 ml buffer i røret.
21. Bruk en mikropipette, forstyrr dyrepelleten for å lage en homogen suspensjon av L1-dyr i den gjenværende bufferen.
22. Overfør en enkelt dråpe av den homogene suspensjonen av L1 dyr til en merket 150 mm NGM-platefrø med E. coli OP50.
23. Beregn dyretettheten per dråpe ved å visuelt telle antall L1 dyr per dråpe ved hjelp av et disseksjonsmikroskop. En 150 mm NGM-plate med en fullvoksen plen av E. coli OP50 kan støtte opptil 500 dyr i L1-scenen for å nå gravid voksenstadiet.
24. Overfør L1-dyrene til seks 150 mm NGM-plater med E. coli OP50. Pass på at du ikke overbelaster platen.
    MERK: Hvis det er uklart om dyrene vil ha nok mat til utvikling mellom L1 og gravid voksen, legg til færre dyr til hver tallerken og bruk flere plater.
25. La dyrene vokse i 72 timer ved 20 °C til de når voksenstadiet og begynner å legge egg.
26. Utfør en andre runde med blekemiddelsynkronisering på de synkroniserte, godt matede villtype gravide voksne dyrene.
27. Plasser de synkroniserte L1-dyrene på ti 150 mm NGM-plater sådd med E. coli OP50, med ca. 1000 dyr per tallerken.
28. La de nye synkroniserte L1-dyrene vokse i 48 timer ved 20 °C til de når L4-stadiet.
    MERK: Målet er å oppnå en ca 700 - 800 μL pellet av L4 dyr. For mange dyr kan gjøre det vanskelig å bruke Balch homogenisator; Dette kan føre til muskelbelastning mens du bruker homogenisatoren og mulig lekkasje fra sprøytene på grunn av økt trykk.

3. Balch homogenisator forberedelse

1. Klargjør både hypotoniske og hypertoniske buffere som nevnt i tabell 3 og tabell 4.
   MERK: De hypotoniske og hypertoniske bufferne kan tilberedes på forhånd og oppbevares trygt ved 4 °C.
2. Rengjør Balch homogenisatoren ved å oversvømme slipekammeret med 70% etanol, skyll deretter kammeret med deionisert vann for å fjerne overflødig etanol.
   MERK: Unngå å bruke noen kaustiske midler til å rengjøre Balch homogenisatoren. Grundig skylling med etanol og deionisert vann bør være tilstrekkelig til å rengjøre det.
3. Sett den 7,9820 mm (18 μm gapklaringen) wolframkarbidkulen inn i slipekammeret.
4. Hetten hver ende av fatet på Balch homogenisator og fest hettene med de medfølgende tommelskruene.
5. Forbered 5 ml 'komplett hypotonisk buffer' per prøve: Tilsett 5 μL 1 M DTT (sluttkonsentrasjon: 1 mM DTT) og 100 μL 100x proteasehemmer, engangscocktail (sluttkonsentrasjon: 2x). Hold bufferen på is.
6. Forbered 5 ml 'komplett hypertonisk buffer' per prøve: Tilsett 5 μL 1 M DTT (sluttkonsentrasjon: 1 mM DTT) og 100 μL 100x proteasehemmer, engangscocktail (sluttkonsentrasjon: 2x). Hold bufferen på is.
   MERK: Bruk den komplette hypotoniske og hypertoniske bufferen samme forberedelsesdag. Ikke oppbevar den til senere bruk. Oppbevar 1 M DTT som engangs aliquots ved -20 °C. Oppbevar proteasehemmeren engangscocktail ved 4 °C.
7. Fyll en steril 2 ml sprøyte med 1 ml 'komplett hypotonisk buffer' og skyll forsiktig slipekammeret til Balch homogenisatoren. La det være ca. 500 μL 'fullstendig hypotonisk buffer' i kammeret.
8. Oppbevar den spylte homogenisatoren på isen og la den avkjøles i 30 minutter.
   MERK: Homogenisatoren må være iskald før sliping av dyrene. Slipeprosessen kan produsere varme på grunn av friksjon og tannprotese atomproteinene. Sørg for at metallhomogenisatoren er iskald for å forhindre at dette skjer. Pass på å unngå at vann fra den omkringliggende isen kommer inn i homogenisatoren. Bruk to sterile sprøyter til å plugge hullene i homogenisatoren og blokkere eventuelle utilsiktede væsker fra å komme inn i slipekammeret.

4. Innsamling av dyr

MERK: Det følger en hurtigreferanse som markerer de viktigste trinnene for innsamling, forstyrrelser og fraksjonering av dyrene (figur 1).

1. Samle de godt matede L4-dyrene med M9-buffer i et 15 ml konisk rør og sentrifuger dyrene på 1000 x g i 3 minutter. Fjern supernatanten og fortsett å vaske dyrepellet til supernatanten er klar.
2. Vask dyrene med 3 ml hypotonisk buffer og sentrifuger igjen ved 1000 x g i 3 min.
   MERK: Under den siste vasken med hypotonisk buffer på 4 °C kan dyrene holde seg til siden av røret. Dette er normalt og kan føre til et lite tap av dyr under fjerning av supernatanten.
3. Fjern den hypotoniske bufferen og tilsett 1 ml "fullstendig hypotonisk buffer" til dyrepelleten. Overfør dyreopphenget til en ny 2 ml steril sprøyte.
   MERK: Mens du overfører dyrene til sprøyten ved hjelp av en mikropipette, pipetter du forsiktig en steril 0,1% Tween20-løsning for å belegge innsiden av pipettespissen for å redusere antall dyr som går tapt på grunn av å holde seg til pipettespissveggene.

5. Fraksjonering

1. På is, homogeniser dyrene ved å forsiktig skyve dyrene gjennom slipekammeret til Balch homogenisator lastet med 7.9820 mm ballen og inn i en ny steril sprøyte. Gjenta å skyve dyrene gjennom slipekammeret i 30 komplette sykluser.
   MERK: En "komplett syklus" er definert som fullstendig opp- og nedbevegelse av en sprøytestempe.
   Dette slipetrinnet bruker 7,9820 mm kule (18 μm kulelager).
2. Etter 30 sykluser, fjern så mye av dyrets suspensjon som mulig fra Balch homogenisator og lagre sprøyten, tipp ned i en 1,7 ml mikrotube.
3. Fjern 7.9820 mm ballen fra slipekammeret og rengjør den med deionisert vann. Tørk og returner ballen til det merkede røret.
4. Sett ballen på 7,9880 mm (12 μm mellomromsklaring) inn i slipekammeret og sett homogenisatoren på nytt.
5. Skyll slipekammeret igjen med 1 ml iskald 'komplett hypotonisk buffer'.
6. Grind suspensjonen i 25 komplette sykluser.
7. Etter 25 sykluser, fjern dyrets suspensjon fra Balch homogenisator, overfør suspensjonen til et rent 1,7 ml mikrorør, og lagre det på is.
   MERK: Demonter og rengjør Balch homogenisatoren med 70 % etanol og deionisert vann. Pass på å returnere 7.9880 mm ballen til riktig rør.
8. Pellet dyrekroppene og ruskene ved å sentrifugere suspensjonen ved 500 x g, 4 °C i 5 minutter.
9. Pipette 40 μL av supernatanten til et rør merket 'inngangsfraksjon' og lagre den på is.
   MERK: Skriv alle etikettene med en alkoholsikker penn for å unngå å smøre dem senere.
10. Overfør den gjenværende supernatanten til et nytt 1,7 ml rør, pass på å unngå å berøre pelletsen nederst på røret og kast deretter pelletsen.
11. Sentrifuger supernatanten for å pellet kjernene ved 4000 x g, 4 °C i 5 minutter.
12. Overfør den supernatante, forsiktig så du ikke forstyrrer de pelleterte kjernene, til et nytt 1,7 ml rør og merk røret som 'cytosolic brøkdel'.
    MERK: Sentrifuger den cytosoliske fraksjonen ytterligere ved 17 000 x g, 4 °C i 30 minutter for å fjerne gjenværende uoppløselig materiale, og bruk den som en negativ kontroll for vestlige flekker (spesielt for kjerneproteiner).
13. Vask nukleipellet med 500 μL 'komplett hypotonisk buffer' og overfør pellet til et nytt 1,7 ml rør. Sentrifuger den suspenderte pelletsen ved 4000 x g, 4 °C i 5 minutter.
14. Kast supernatanten og tilsett 500 μL fersk 'komplett hypotonisk buffer' til kjernepelleten og overfør suspensjonen til et nytt 1,7 ml rør. Sentrifuger prøven igjen ved 4000 x g, 4 °C i 5 minutter.
15. Fjern supernatanten og løs opp pelletsen i 40 μL 'fullstendig hypertonisk buffer'. Overfør den nye kjernefysiske suspensjonen til et nytt 1,7 ml rør, merk røret som "kjernefysisk brøkdel", og lagre det på is.
16. Bestem proteinkonsentrasjonen av de tre fraksjonene ved hjelp av et fluorescerende kvantifiseringssett.
    MERK: Mengden kjerneprotein som er anskaffet fra denne metoden, kan variere fra 1-2 μg / μL.
17. Aliquot kjernefysiske fraksjoner i engangsrør som inneholder 6 μg av atomproteinet og snap fryse i tørris og etanol bad. Oppbevars ved -80 °C til videre bruk.

6. Transkripsjonsanalyse

1. Slå på og forvarm en varmeblokk til 30 °C.
2. Fjern følgende fra Nulcear Extract in vitro transkripsjonssystem: 50 mM _MgCl2, Kjernefysisk ekstrakt 1x transkripsjonsbuffer, 100 mM rATP, 100 mM rCTP, 100 mM rGTP, 100 mM rUTP og CMV-promotorens positive kontrollmal. Tin på isen.
   MERK: Forsterk DEN positive DNA-malen ved hjelp av en high-fidelity polymerase og lagre den som normaliserte engangs aliquots.
3. Bland og sentrifuger de opptinte rNTPene før du forbereder en 10 mM arbeidsløsning.
   MERK: Tilsett 2 μL av hver rATP, rCTP, rGTP og rUTP til 12 μL _H2O for å oppnå 10 mM av hver rNTP. Denne sammensetningen kan skaleres opp om nødvendig.
4. Aliquot rNTP-blandingen til merkede engangsrør og oppbevares ved -20 °C for fremtidig bruk.
5. I et friskt 1,5 ml rør merket "Mastermix" tilsett reagensene per reaksjon som nevnt i tabell 5
6. Overfør 14 μL av Mastermix til hvert reaksjonsrør
7. Tilsett 11 μL minus (volum for 5 μg av atomekstraktet) av 1x transkripsjonsbuffer til hvert reaksjonsrør.
8. Tilsett 5 μg av atomekstraktet til hvert reaksjonsrør.
9. Trykk forsiktig på reaksjonsrøret for å blande innholdet innvendig og puls sentrifuger rørene etter blanding for å sikre at det ikke sitter fast reaksjonsmaterialet på veggen på rørene.
10. Inkuber reaksjonene ved 30 °C i 30 minutter.
11. Stopp umiddelbart reaksjonen ved å tilsette 400 μL RLT-buffer levert av RNA-ekstraksjonssettet.
    MERK: På dette tidspunktet er det trygt å stoppe. Prøver kan oppbevares ved -80 °C inntil de rengjøres ytterligere med RNA-ekstraksjonssettet.

7. RNA rydde opp

1. Forbered DNase I lagerløsning ved hjelp av RNase-Free DNase-settet som følger med i RNA-ekstraksjonssettet. Løs opp den lyofiliserte DNase I i 550 μL RNase-fritt vann. Bland forsiktig løsningen. Ikke virvel . Aliquot DNase I-oppløsningen i 10 μL engangsrør og oppbevar aliquots ved -20 °C.
2. Forbered 70% og 80% etanol ved hjelp av molekylært etanol og RNase-fritt vann.
3. Flytt prøvene og reagensene til et RNase-fritt arbeidsområde før du starter oppryddingen.
4. Tilsett 400 μL 70% etanol i hver prøve og forsiktig pipette for å blande godt.
5. Overfør 400 μL av prøven til en merket RNA ekstraksjonsspinsøyle med et 2 ml oppsamlingsrør og sentrifuger prøven på 8500 x g i 30 s. Kast gjennomstrømningen.
6. Gjenta trinn 7.5 med den gjenværende prøven og kast gjennomstrømningen.
7. Tilsett 350 μL RW1-buffer (RNA ekstraksjonssett) i hver kolonne. Sentrifuger kolonnene på 8500 x g i 30 s. Kast gjennomstrømningen.
8. Tilsett 70 μL RDD-buffer (RNA ekstraksjonssett) i en enkelt 10 μL aliquot DNase I lagerløsning og bland forsiktig. Ikke virvel.
9. Tilsett DNase I inkubasjonsblandingen (80 μL) direkte i spinnkolonnemembranen. Inkuber søylene ved romtemperatur i 15 min.
   MERK: Sørg for å legge DNase I-oppløsningen til membranen. Unngå å miste en del av løsningen på søyleveggen eller O-ringen.
10. Etter 15 min legger du til 350 μL RW1-buffer i kolonnene. Sentrifuge i 30 s ved 8500 x g. Kast gjennomstrømningen.
11. Plasser kolonnene i nye 2 ml oppsamlingsrør. Tilsett 500 μL RPE-buffer (RNA ekstraksjonssett) i spinnkolonnen. Sentrifuger kolonnene på 8500 x g i 30 s for å vaske membranen. Kast gjennomstrømningen.
12. Tilsett 500 μL 80% etanol i hver kolonne og sentrifuger kolonnene ved 8500 x g i 30 s. Kast gjennomstrømningen.
13. Plasser kolonnene i nye 2 ml oppsamlingsrør. La kolonnelokkene stå åpne, sentrifuger kolonnene på 17 900 x g i 5 minutter. Kast gjennomstrømningen.
14. Plasser søylene i merkede 1,7 ml rør. Tilsett 17 μL RNase-fritt vann direkte i midten av spinnkolonnemembranen. La kolonnene hvile ved romtemperatur i 1 min. Sentrifuger kolonnene på 17 900 x g i 1 min.
15. Kast søylen og oppbevar 1,7 ml-røret med den nyrensede RNA-prøven.

8. DNA-fordøyelse

1. Forvarm to varmeblokker ved 37 °C og 65 °C.
2. Tilsett 2 μL 10x reaksjonsbuffer i hver prøve.
3. Tilsett 1 μL (1 MBU) DNase i hver prøve.
4. Sett en pipette til 10 μL og pipette den nye løsningen opp og ned for å blande forsiktig. Ikke virvel.
5. Inkuber RNA-prøvene ved 37 °C i 30 minutter for å fordøye eventuelt gjenværende DNA.
6. Inaktiver DNase ved å inkubere prøvene på varmeblokken ved 65 °C i 10 minutter.
   MERK: Det er trygt å stoppe på dette trinnet og oppbevare RNA ved -80 °C for å utføre omvendt transkripsjon senere.

9. Omvendt transkripsjon

1. Når du programmerer termosykleren, legg til et ekstra trinn på 1 t, 37 °C før inkubasjon for å forvarme termosykleren. Kjør programmet med "forvarmingstrinnet" mens du forbereder prøvene og la termosykleren nå 37 °C. Når prøvene for omvendt transkripsjon er klare, hopper du over forvarmingstrinnet på 37 °C og går videre til det faktiske inkubasjonstrinnet (tabell 6). Hvis termosykleren ikke har en hoppfunksjon, legg til et trinn på 1 min. 37 °C før inkubasjon. La termosykleren varme opp til riktig temperatur før du setter systemet på pause og legger til de forberedte prøvene.
2. Forbered en 10 μM arbeidsløsning av transkripsjon omvendt primer i RNase-fri _H2O og lagre den på is.
3. Tine på is, 10x buffer fra omvendt transkripsjonssett, dNTP-blanding (5 mM hver dNTP), RNase Inhibitor og omvendt transkripsjon.
4. Forbered en Mastermix (per reaksjon) ved å legge bestanddelene nevnt i tabell 7 i et rent 0,2 ml PCR-rør.
5. Aliquot 18 μL av Mastermix i nye 0,2 ml PCR-rør for hver prøve.
6. Tilsett 2 μL av DNase behandlet RNA for hver prøve i henholdsvis merkede rør.
7. Inkuber prøvene ved 37 °C i 1 time i en forvarmet termosykler.
8. Flytt prøvene til -20 °C for lagring etter omvendt transkripsjon, eller gå direkte til neste trinn.
   MERK: Det er trygt å stoppe på dette trinnet; oppbevar cDNA ved -20 °C for senere bruk.

10. Spesifikk produktforsterkning

1. Tine på is: cDNA, 10 μM transkripsjon fremover og 10 μM transkripsjon omvendt primere, og PCR 2x Premix A.
   MERK: Aliquot PCR 2x Premix A i mindre volumer for å redusere opptiningstiden.
2. Lag en Mastermix (per reaksjon) ved å legge bestanddelene nevnt i tabell 8 i et rent 0,2 ml PCR-rør.
3. Aliquot 24 μL Mastermix for hver prøve i rene merkede 0,2 ml PCR-rør.
4. Tilsett 1 μL cDNA av hver prøve i sine respektive rør.
5. Inkuber prøvene i termosykleren ved hjelp av programbetingelsene som er nevnt i tabell 9
6. Etter inkubasjonen, oppbevar PCR-produktene ved 4 °C eller -20 °C for lengre lagring.

11. Gel analyse

1. Bruk 1x TAE buffer til å lage en gel som inneholder 2% m/v agarose og 1x gel flekk.
2. Kjør PCR-produktene på 50 V og 300 mA i 1 t eller til det er en klar båndseparasjon.
3. Bilde gelen ved hjelp av det automatiserte eksponeringsprogrammet forhåndslastet i gele imager.

Representative Results

Ved å følge de skisserte trinnene skal gi funksjonell kjerneekstrakt (figur 1), kan avvik i slipe- eller vasketrinnene føre til dårlig aktivitet eller lave utbytter. Hvis funksjonell C. elegans kjernefysisk ekstrakt oppnås, vil det transkribere regionen nedstrøms CMV-promotoren på DNA-malen når den legges til den tidligere beskrevne in vitro-analysen . Den resulterende RNA-transkripsjonen kan renses fra atomproteiner og DNA-mal ved hjelp av konvensjonelle metoder. Uten mal-DNA kan omvendt transkripsjon og påfølgende PCR-produkt bare være et resultat av RNA transkribert av atomekstraktet. PCR-produktene kan visualiseres på en agarose gel, intensiteten av DNA-båndet kan være en indikasjon på kvaliteten på kjerneprotein og RNA-isolasjon. En svak båndintensitet kan skyldes inaktivering av atomekstraktet enten ved varme eller dårlig bufferforberedelse. En overdreven sterk båndintensitet kan være et resultat av DNA-forurensning enten på grunn av dårlig RNA-rensing eller feil DNase-fordøyelse. Konsistente og vellykkede kjernefysiske isolasjoner vil produsere bånd med lignende intensiteter, og både transkripsjons- og PCR-negative kontroller skal ikke ha noe synlig PCR-produkt (figur 2).

Figur 1. Et omriss av kjernefysisk ekstraktisolasjon. Flytskjemaet skisserer de viktigste trinnene for å isolere kjernefysisk ekstrakt fra C. elegans. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2. C. elegans kjernefysiske ekstrakt beholder sin aktivitet. Gelbildet viser transkripsjonsproduktene til C. elegans L4 larver kjernefysisk ekstrakt ved hjelp av CMV-promotorens DNA-mal. Vellykket isolering av aktive kjerneproteiner vil resultere i et 132 bp PCR-produkt etter in vitro transkripsjon, som vist i baner 1 og 2. Mislykket isolasjon vil resultere i et svakt bånd eller fravær av et PCR-produkt som ligner på bane 3. Denne visualiseringen av transkripsjonsaktiviteten via PCR-forsterkning er en enkel måte å vurdere kvaliteten på kjernefysisk ekstraksjonsisolasjon. Den positive PCR-kontrollen produseres ved å legge CMV-promotor-DNA-malen til PCR-reaksjonen, og den negative kontrollen mangler mal-DNA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Nematode vekst media plater
Agar	20,4 g
Natriumklorid	2,8 g
Bacto pepton	2,3 g
dH2O	975 ml
Autoklav ved 121 °C i 30 min
La mediet avkjøles til 50 °C før du legger til følgende
1 M CaCl2 (steril)	1 ml
1 M MgSO4 (steril)	1 ml
10 000 enheter/ml nystatin (steril)	3 ml
5 mg / ml kolesterol i 95% etanol (filter sterilisert)	1 ml
1M KPO4 pH 6.0 (Steril)	25 ml

Tabell 1.

M9-buffer
KH2PO4	3 g
Na2HPO4	6 g
NaCl	5 g
dH2O	1000 ml
Autoklav ved 121 °C i 15 min
1 M MgSO4 (steril)	1 ml (legg til etter autoklavering)
S-basal Buffer
KH2PO4	6 g
K2HPO4	1 g
NaCl	5,85 g
dH2O	1000 ml
Autoklav ved 121 °C i 15 min
Kolesterol 5 mg/ml (sterilt)	1 ml (legg til etter autoklavering)

Tabell 2.

Hypotonisk buffer
Lagerløsning	Volum	Endelig konsentrasjon
1 M HEPES KOH pH 7,6	7,5 ml	15 mM
1 M KCl	5,0 ml	10 mM
1 M MgCl2	2,5 ml	5 mM
0,5 M EDTA	0,1 ml	0,1 mM
1 M Sukrose	175 ml	350 mM
dH2O	309,9 ml
Steriliser filter

Tabell 3.

Hypertonisk buffer
Lagerløsning	Volum	Endelig konsentrasjon
1 M HEPES KOH pH 7,6	7,5 ml	15 mM
1 M KCl	200 ml	400 mM
1 M MgCl2	2,5 ml	5 mM
0,5 M EDTA	0,1 ml	0,1 mM
10% Tween 20	5 ml	0.10%
50% Glyserol	100 ml	10%
dH2O	184,9 ml
Steriliser filter

Tabell 4.

MgCl2, 50 mM	1,5 μL
rNTP-blanding, 10 mM hver	1,0 μL
Mal-DNA, 25 ng/μL	4,0 μL
RNase-fri H2O	7,5 μL

Tabell 5.

Skritt	Temp	Tid	Syklusnummer
Forvarm	37 °C	60 min	1x
Omvendt transkripsjon	37 °C	60 min	1x
Holde	10 °C		1x

Tabell 6.

10x omvendt transkripsjonsbuffer	2,0 μL
dNTP Mix (5 mM hver dNTP)	2,0 μL
Transkripsjon Omvendt Primer (10 μM)	2,0 μL
RNase-hemmer	1,0 μL
Sensiscript omvendt transkripsjon	1,0 μL
RNase-fri H2O	10,0 μL

Tabell 7.

RNase-Fri H2O	6,25 μL
Transkripsjon Fremover Primer (10 μM)	2,5 μL
Transkripsjon Omvendt Primer (10 μM)	2,5 μL
PCR 2X Forblanding A	12,5 μL
PCR enzym blanding	0,25 μL

Tabell 8.

Skritt	Temp	Tid	Syklusnummer
Første protese	92 °C	60 s	1x
Denatur	92 °C	30 s
Anneal	59 °C	30 s	35x
Forlengelse	72 °C	30 s
Holde	10 °C		1x

Tabell 9.

Discussion

C. elegans er en tiltalende modellorganisme for å studere det eukaryote transkripsjonssystemet på grunn av det rimelige vedlikeholdet og den enkle genetiske manipulasjonen. Her beskrives en protokoll for konsekvent isolering av funksjonelt aktivt atomekstrakt fra L4 C. elegans . Selv om denne protokollen fokuserte på å visualisere transkripsjonsaktivitet, kan cDNA produsert etter transkripsjonsmessig kvantifiseres ved hjelp av RT-qPCR for å oppnå en mer presis måling av ^{transkripsjonsaktiviteten8}. Denne metoden for å isolere kjerneproteiner fra C. elegans kan bidra til å utvide studiet av eukaryote transkripsjonsmaskiner. Siden C. elegans ikke er en kultur av celler i en tallerken eller en koloni av gjær, men snarere et frittgående dyr, kan isolering og forskning av atomekstraktet gi et klarere innblikk i hvordan transkripsjonsmaskineriet kan endres over tid eller i ulike miljøer. Dette gjør det mulig for forskere å dra nytte av C. elegans lave kostnader og motstandskraft. C. elegans, i motsetning til andre modellorganismer eller cellekulturer, er mye mer tilgivende når bakteriell eller gjærforurensning vises. En populasjon av C. elegans kan enkelt rengjøres av forurensning ved hjelp av etablerte protokoller, noe som sparer tid og krefter når forurensning ^oppstår9. Totalt sett kan bruk av kjernefysisk ekstrakt fra C. elegans for biokjemiske analyser være et rimeligere og mer fleksibelt alternativ sammenlignet med å kjøpe kjernefysisk ekstrakt fra en leverandør eller håndtere mindre tilgivende modellorganismer.

Selv om denne protokollen er relativt enkel, er det fortsatt kritiske trinn som krever spesiell oppmerksomhet for vellykket isolasjon av atomekstraktet. Det er viktig at under utarbeidelsen av de komplette hypotoniske og hypertoniske bufferne er de to løsningene tydelig merket og separert. Hvis bufferne byttes på noe tidspunkt under isolasjonen, kan dette føre til inaktivering av atomproteiner eller dårlig fraksjonering av de cytosoliske proteinene fra atomproteinene. Isolerte kjerneproteiner bør også, om nødvendig, fortynnes i hypertonisk buffer, ikke vann eller annen løsning. Den høye saltkonsentrasjonen bidrar til å bevare proteinenes aktivitet, og en hypotonisk løsning kan drepe denne ^{aktiviteten10}.

En annen utfordring som kan oppstå under slipedelen av denne protokollen kommer fra rusk som holder seg til overflaten av wolframkulene. Mens det er uttalt at ballene skal vaskes og tørkes etter hver slipesyklus, vil materialet feste seg til ballenes glatte overflate. Dette materialet vises vanligvis som rustfargede ringer rundt omkretsen av ballene og er tykk nok til å blokkere gapet mellom ballen og veggen av slipekammeret. Denne blokkeringen er merkbar ettersom det blir mer og vanskeligere å skyve dyrene gjennom kvernen, noe som til slutt kan føre til muskelskade eller brudd på sprøyten. Hvis wolframkulene begynner å vise misfarging, suge dem i varmt vann i 5 minutter, rengjør deretter overflaten med en ny skurepute. Unngå å bruke sure eller grunnleggende rengjøringsløsninger. Etter forsiktig polering skal wolframkulene gå tilbake til sin opprinnelige glans, og det vil være merkbart lettere å male prøver.

Denne protokollen er designet for å isolere hele atomekstraktet fra C. elegans. Den er ikke testet for bruk på andre modellorganismer. Kjernefysisk ekstrakt fra andre organismer kan kreve forskjellige buffere, og CMV-promotoren er kanskje ikke nok til å drive transkripsjon i andre ikke-pattedyrprøver. Det kjernefysiske ekstraktet som samles inn ved hjelp av denne metoden er heller ikke vevs- eller cellespesifikk; enhver transkripsjonsaktivitet målt ved hjelp av denne metoden ser på dyrene som helhet som kan skjule de subtile endringene mellom vev.

Fremtidig bruk av denne protokollen kan måle DNA-reparasjons- eller replikeringsmaskiner av C. elegans etter DNA-skade. Den cytosoliske fraksjonen som samles inn under isolasjonsprosessen, kan brukes til å måle mengden løselige proteiner og kvantifisere aktiviteten til disse proteinene på en måte som ligner på måling av transkripsjon.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables and reagents
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear	Genesee Scientific	24-706
0.2 mL Individual PCR tubes	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL sterile microtubes	Genesee Scientific	24-282S
100% absolute molecular grade ethanol	Fisher Scientific	BP2818
100% ethanol, Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL serological pipet	VWR international	89130-898
150 mm petri plates	Tritech Research	T3325
15 mL conical centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-103
20 mL plastic syringes	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject syringes	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 mL conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	339652
50 mL serological pipet	VWR international	89130-902
5 mL serological pipet	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarose	Denville Scientific	CA3510-6
Alcohol proof marker	VWR International	52877-310
Bacto peptone	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Calcium dichloride	Millipore Sigma	C4901
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’
Deionized water
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA gel stain, SYBR safe	Invitrogen	S33102
DNA ladder mix, O’gene ruler	Fisher Scientific	SM1173
DNA Loading Dye, 6x TriTrack	Fisher Scientific	FERR1161
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen	DB0715K
Dry ice
Escherichia coli OP50 strain	CGC	OP50
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38
Glycerol	Millipore Sigma	G6279
HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Hydrochloric acid 37%	Millipore Sigma	P0662
Hypochlorite bleach	Clorox
LB Broth	Millipore Sigma	L3022
Magnesium dichloride	Millipore Sigma	M8266
Magnesium Sulfate	Millipore Sigma	M7506
Medium weigh dishes	Fisher Scientific	02-202-101
microscope slides, Vista vision	VWR International	16004-368
molecular grade water, Hypure	Hyclone Laboratories	SH30538
Nystatin	Millipore Sigma	N1638
PCR system, FailSafe with premix A	Lucigen	FS99100
Potassium chloride	Millipore Sigma	P39111
Potassium phosphate dibasic	Millipore Sigma	P3786
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x	ThermoFisher Scientific	78430
protein assay kit, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
reverse transcription kit, Sensiscript	Qiagen	205211
RNA extraction kit RNeasy micro kit	Qiagen	74004
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sodium Chloride	VWR International	BDH9286-12KG
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	1-09137
Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane	VWR international	28145-501
Sucrose	VWR International	200-334-9
transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’
transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Equipment
-20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
37 °C incubator	Forma Scientific
4 °C refrigerator	ThermoFisher Scientific
-80 °C freezer	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer	Isobiotec
Benchtop Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Centrifuge, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Centrifuge, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Dissection microscope, Leica M80	Leica Microsystems
Fluorometer, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Gel imaging system, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Gel system	ThermoFisher Scientific
Heat block	VWR International	12621-048
Microcentrifuges, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
Rocking platform	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010