Isolering af aktiv caenorhabditis elegans nukleare ekstrakt og rekonstitution for In Vitro Transskription

Summary

Her beskriver vi en detaljeret protokol til isolering af aktivt nukleart ekstrakt fra larvestadiet 4 C. elegans og visualisering af transskriptionsaktivitet i et in vitro-system .

Abstract

Caenorhabditis elegans har været et vigtigt modelsystem for biologisk forskning, siden det blev indført i 1963. C. elegans er imidlertid ikke blevet udnyttet fuldt ud i den biokemiske undersøgelse af biologiske reaktioner ved hjælp af sine nukleare ekstrakter som in vitro transskription og DNA-replikation. En betydelig forhindring for brug af C. elegans i biokemiske undersøgelser forstyrrer nematodens tykke ydre neglebånd uden at ofre aktiviteten af det nukleare ekstrakt. Mens flere metoder bruges til at bryde neglebånd, såsom Dounce homogenisering eller sonikering, de ofte fører til protein ustabilitet. Der findes ingen fastlagte protokoller for isolering af aktive nukleare proteiner fra larve eller voksne C. eleganer til in vitro-reaktioner . Her beskriver protokollen i detaljer homogeniseringen af larvestadiet 4 C. eleganer ved hjælp af en Balch homogenizer. Balch homogenisatoren bruger tryk til langsomt at tvinge dyrene gennem et smalt hul, der bryder neglebånd i processen. Balch homogenisatorens ensartede design og præcise bearbejdning giver mulighed for ensartet slibning af dyr mellem forsøg. Fraktionering af homogenatet fra Balch homogenisatoren giver funktionelt aktivt nukleart ekstrakt, der kan anvendes i en in vitro-metode til analyse af transskription af C. elegans.

Introduction

Den lille, fritlevende nematode Caenorhabditis elegans er en enkel, men kraftfuld modelorganisme til at løse en lang række biologiske spørgsmål. Siden indførelsen i 1963 har nematoderne været uvurderlige for at besvare spørgsmål inden for neurobiologi, metabolisme, aldring, udvikling, immunitet og ^genetik1. Nogle af dyrets mange egenskaber, der gør det til en ideel modelorganisme, omfatter kort generationstid, effektiviteten af RNA-interferens, gennemsigtig krop og de færdige kort over både dets cellulære afstamning og nervesystem.

Mens nematodens bidrag til videnskaben er enorme, er de blevet underudnyttet til at belyse det eukaryote transskriptionssystem, hvor det meste af vores forståelse af disse mekanismer kommer fra undersøgelser ved hjælp af nukleart ekstrakt fra gær, frugtflue og ^{pattedyrcellekultur2}. Den største forhindring, der afskrækker forskere fra at udvinde funktionelle nukleare ekstrakt er nematoden hårde ydre kutikula. Dette exoskelet omfatter krydsbundne kollagen, cuticlins, glycoproteiner og lipider, hvilket gør C. elegans fra larvestadiet til voksenalderen resistente over for proteinudvinding via kemiske eller mekaniske ^kræfter3. Et in vitro transskriptionssystem ved hjælp af C. elegans nukleare ekstrakt blev engang udviklet, men ikke bredt vedtaget på grund af systemets begrænsede omfang, og brugen af Dounce homogenisator til fremstilling af ekstraktet kan føre til protein ^{ustabilitet4,5}.

I modsætning til den tidligere protokol for nuklear ekstrakt isolation, som udnyttede en Dounce homogenizer til at bryde C. elegans, denne protokol bruger en Balch homogenizer. Balch homogenisatoren består af to hovedkomponenter: en wolframcarbidkugle og en blok i rustfrit stål med en kanal, der keder sig igennem fra den ene ende til den anden. Balch homogenisatoren er fyldt med wolframcarbidkuglen og udjævnes på begge sider for at forsegle slibekammeret. Sprøjter kan lastes på de to lodrette porte, der fører ind i slibekammeret. Da materialet overføres fra den ene sprøjte til den anden gennem slibekammeret, tvinger trykket fra sprøjterne materialet gennem et smalt mellemrum mellem bolden og væggen i kammeret. Dette langsomme og konstante tryk bryder materialet, indtil det når en ensartet størrelse, der er i stand til at passere gennem det smalle hul let. Tvinger C. elegans gennem det smalle hul via et konstant, men blidt tryk bryder dyrene åbne og frigiver deres indhold i den omgivende buffer. Skift af kuglestørrelser strammer yderligere hullet, bryder de nyligt frigivne celler og frigør kernerne i bufferen. Flere tilfælde af centrifugering adskiller kernerne fra resten af celleaffaldet, hvilket giver mulighed for indsamling af et rent nukleart ekstrakt. Balch homogenisatoren foretrækkes frem for Dounce homogenisatoren af flere grunde: systemet kan håndtere et stort antal dyr, hvilket gør det muligt at udtrække en høj mængde aktive proteiner i et enkelt forsøg; den præcise bearbejdning af kuglerne og stålblokken giver mulighed for ensartet slibning mellem flere prøver; den tunge stålblok fungerer som en køleplade, der ensartet trækker varme væk fra slibekammeret, hvilket forhindrer denaturering.

Efter isolering skal det nukleare ekstrakts transskriptionsaktivitet verificeres, før den anvendes i biokemiske eksperimenter. Traditionelt blev transskription aktivitet målt ved hjælp af radiomærkede nukleotider til at spore og visualisere den nyligt syntetiserede RNA. Radioaktiv mærkning kan dog være byrdefuld, da det kræver forsigtighed under brug og ^{bortskaffelse6}. Teknologiske fremskridt gør det muligt for forskere i dag at bruge langt mindre skadelige eller besværlige metoder til at måle selv små RNA-mængder ved hjælp af teknikker som kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR)⁷. Her beskriver protokollen en metode til at isolere aktivt nukleart ekstrakt fra larvestadiet 4 (L4) C. elegans og visualisere transskription aktivitet i et in vitro-system.

Protocol

1. Medieforberedelser

1. Forbered sterile lysogeny bouillon (LB) agarplader og flydende medier efter producentens anvisninger.
2. Streak Escherichia coli (E. coli) stamme OP50 på en LB agar plade. Inkuberes bakteriestriben ved 37 °C natten over.
3. Stimepladen E. coli OP50 opbevares ved 4 °C efter inkubation. E. coli OP50-pladen kan opbevares sikkert ved 4 °C i 2 uger, hvis den er pakket ind i parafilm for at forhindre fugttab.
4. Forbered 2 L Nematode Growth Media (NGM) ved hjælp af opskriften i tabel 1.
   BEMÆRK: Nystatin er valgfri. Nystatin hjælper med at forhindre skimmelsvamp, og andre svampeforurenende stoffer vokser på NGM plader. De store plader med en diameter på 150 mm har større chance for at fange svampesporer, når låget fjernes til hældning og såning af E. coli OP50. Nystatin kan købes forblandet i steril opløsning fra leverandører på 10.000 enheder / mL eller kan købes som et sterilt pulver og blandes med sterilt vand. Nystatin kan ikke autoklavers, og det kan heller ikke filtreres effektivt steriliseret. Opmærksomhed på den aseptiske teknik er afgørende, mens du blander en opløsning af nystatin i laboratoriet. Autoklave 1 M _CaCl2, 1 M _KPO4 pH 6,0 og 1 M _MgSO4 ved 121 °C i 15 min. Filtrer sterilisere kolesterol gennem et 0,22 μm filter efter at være blevet opløst i 95% ethanol.
5. Efter tilsætning af reagenser til medierne, hæld NGM i fyrre 150 mm Petri retter. Hver 150 mm skål kræver 50 mL at fylde. Lad NGM-pladerne køle af natten over ved stuetemperatur.
6. Pod to 50 mL koniske rør indeholdende 25 mL steril LB med E. coli OP50 fra den tidligere streak plade. Bouillon inkuberes ved 37 °C i 24 timer i en rystende inkubator, der holdes ved 200 omdr./min.
   BEMÆRK: For konsistens, pode begge rør med den samme enkelt koloni fra streak plade. Hvis dette viser sig vanskeligt, podes 5 mL steril LB med en enkelt koloni i et 50 mL konisk rør og inkuberes kulturen i 16 timer ved 37 °C i en rystende inkubator, der opretholdes ved 200 rpm dagen før tilberedningen af NGM-pladerne. Opbevar den friske væskekultur ved 4 °C i op til to dage. Pod de to 25 mL bouillon med 25 μL flydende kultur og inkubere under de samme betingelser som nævnt ovenfor.
7. Frø friske NGM plader med 1 mL frisk E. coli OP50 flydende kultur og spredes med en flamme steriliseret spreder jævnt over overfladen af pladen aseptisk at skabe en stor bakterie græsplæne, der dækker størstedelen af pladen, passe på ikke at sprede bakterier fra kant til kant. Lad E. coli OP50 vokse ved stuetemperatur i 72-96 timer, eller indtil der vises en synligt tyk græsplæne.
   BEMÆRK: Efter 24 timer skal du flytte de nysåede NGM-plader til en overdækket beholder for at reducere fugttabet og forlænge pladernes levetid.

2. Animalske præparater og blegemiddelsynkronisering

1. Overfør 5 velfodrede, vilde, gravide voksne C. elegans til hver af de 10 friske NGM plader sået med E. coli OP50, for i alt 50 dyr.
2. Lad dyrene lægge æg. Lad afkommet vokse ved 20 °C, indtil de når det gravide voksenstadium.
3. Brug 15 mL M9 buffer (tabel 2) til at indsamle de nye velfodrede vilde typer, gravide voksne fra de ti vedligeholdelsesplader og overfør dyrene til et mærket 15 mL konisk rør.
4. Centrifuge dyrene på 1.000 x g i 3 min at pellet alle dyr i bunden af røret.
5. I et separat, mærket 15 mL konisk rør blandes 2 ML blegemiddel med 5 mL 1 N NaOH til blegemiddelsynkronisering. Vortex løsningen til at blande grundigt.
   BEMÆRK: Brug blegemidlet + NaOH opløsningen samme dag, som det er parat til at være effektivt.
6. Fjern forsigtigt supernatanten fra de centrifugerede dyr ved hjælp af en 10 mL steril pipette. Forsøg på at fjerne så meget M9 buffer som muligt for at forbedre brud på dyr.
7. Tilsæt 500 μL af blegemidlet + NaOH opløsning til dyret pellet og starte en timer i 4 min.
8. Enten i hånden eller ved hjælp af en rocker, forsigtigt rock røret til at bryde dyret pellet helt og lad dyrene bevæge sig frit i blegemiddel + NaOH opløsning. Fortsæt med at vugge røret i hele 4 minutters varighed.
   BEMÆRK: Mængden af blegemiddel + NaOH-opløsning, der er nødvendig, kan variere afhængigt af størrelsen af den dyrepille, der synkroniseres. Optimer denne teknik på forhånd med varierende mængder af dyr og blegemiddel + NaOH løsning.
9. Efter 4 min skal du kontrollere brudeffektiviteten under et dissektionsmikroskop. Sørg for, at størstedelen af de gravide voksne dyr brydes, og deres indre indhold frigives, herunder æggene.
10. Hvis dyrene ikke er opdelt åbne, kortvarigt vortex røret ved maksimal hastighed, så tjek igen under mikroskopet.
    BEMÆRK: Mens æggene er resistente over for blegemiddel + NaOH opløsning, de er ikke uigennemtrængelige. Æg må ikke udsættes for blegemidlet + NaOH opløsning længere end nødvendigt. Stalling for længe under dyret bryde skridt kan føre til udviklingsmæssige problemer for afkommet.
11. Tilsæt 10 mL af M9-bufferen til den ødelagte dyreopløsning.
12. Centrifuge æggene og resterne på 1.000 x g i 3 min.
13. Pipette supernatant væk, og sørg for ikke at røre ved den nye pellet, der indeholder alle æggene i bunden af røret.
14. Tilsæt yderligere 10 mL af M9 buffer og centrifuge igen i 3 min ved 1.000 x g.
15. Gentag trin 2.13-2.14 to gange mere for at sikre, at ingen af blegemiddel + NaOH opløsning forbliver.
16. Efter den tredje M9 buffer vask, fjerne supernatant og tilsæt 10 mL af S-basal buffer (Tabel 2).
17. Vend røret for at bryde pelleten i bunden for at suspendere æggene ligeligt i bufferen.
18. Placer røret på en rocker og forsigtigt rock røret i 22 timer på 20 °C for at tillade æggene at klække og nå larve fase 1 (L1) anholdelse.
19. Efter 22 timer centrifugere røret indeholder synkroniserede L1 dyr i 3 min ved 1000 x g.
20. Pipette og kassere supernatant forlader ca 1 mL af buffer i røret.
21. Ved hjælp af en mikropipette forstyrres dyrepillen for at lave en homogen suspension af L1-dyr i den resterende buffer.
22. Overfør en enkelt dråbe af den homogene suspension af L1-dyr til en mærket 150 mm NGM-plade sået med E. coli OP50.
23. Beregn dyretætheden pr. dråbe ved visuelt at tælle antallet af L1-dyr pr. dråbe ved hjælp af et dissektionsmikroskop. En 150 mm NGM plade med en fuldvoksen græsplæne af E. coli OP50 kan støtte op til 500 dyr i L1-scenen for at nå det gravide voksenstadium.
24. L1-dyrene overføres til seks 150 mm NGM-plader med E. coli OP50. Sørg for ikke at overbelaste pladen.
    BEMÆRK: Hvis det er uklart, om dyrene vil have mad nok til udvikling mellem L1 og gravid voksen, skal du tilføje færre dyr til hver plade og bruge flere plader.
25. Lad dyrene vokse i 72 timer ved 20 °C, indtil de når det gravide voksne stadium og begynder at lægge æg.
26. Udfør en anden runde af blegemiddel synkronisering på synkroniserede, godt fodret vilde-type gravid voksne dyr.
27. Placer de synkroniserede L1-dyr på ti 150 mm NGM-plader sået med E. coli OP50 med ca. 1.000 dyr pr. plade.
28. Lad de nye synkroniserede L1-dyr vokse i 48 timer ved 20 °C, indtil de når L4-stadiet.
    BEMÆRK: Målet er at opnå en ca. 700 - 800 μL pellet af L4 dyr. For mange dyr kan gøre det vanskeligt at bruge Balch homogenisatoren; Dette kan føre til muskelbelastning under brug af homogenisatoren og mulig lækage fra sprøjterne på grund af det øgede tryk.

3. Balch homogenizer forberedelse

1. Forbered både hypotoniske og hypertoniske buffere som nævnt i tabel 3 og tabel 4.
   BEMÆRK: Hypotoniske og hypertoniske buffere kan tilberedes på forhånd og opbevares sikkert ved 4 °C.
2. Rengør Balch homogenisatoren ved at oversvømme slibekammeret med 70% ethanol, og skyl derefter kammeret med deioniseret vand for at fjerne overskydende ethanol.
   BEMÆRK: Undgå at bruge ætsende midler til at rengøre Balch homogenisatoren. Grundig skylning med ethanol og deioniseret vand bør være tilstrækkelig til at rense det.
3. Sæt 7,9820 mm (18 μm mellemrum clearance) wolfram hårdmetal kugle i slibekammeret.
4. Cap hver ende af tønden af Balch homogenisator og sikre hætter med de medfølgende thumbscrews.
5. Der fremstilles 5 mL 'komplet hypotonisk buffer' pr. prøve: Tilsæt 5 μL 1 M DTT (endelig koncentration: 1 mM DTT) og 100 μL 100x proteasehæmmer, engangscocktail (endelig koncentration: 2x). Hold bufferen på is.
6. Der fremstilles 5 mL 'komplet hypertonisk buffer' pr. prøve: Tilsæt 5 μL 1 M DTT (endelig koncentration: 1 mM DTT) og 100 μL 100x proteasehæmmer, engangscocktail (endelig koncentration: 2x). Hold bufferen på is.
   BEMÆRK: Brug den komplette hypotoniske og hypertoniske buffer samme forberedelsesdag. Opbevar den ikke til senere brug. Opbevar 1 M DTT som engangs aliquots ved -20 °C. Proteasehæmmeren ved 4 °C.
7. Fyld en steril 2 mL sprøjte med 1 mL 'komplet hypotonisk buffer' og skyl forsigtigt slibekammeret på Balch-homogenisatoren. Lad ca. 500 μL 'komplet hypotonisk buffer' stå i kammeret.
8. Opbevar den skyllede homogenisator på is og lad den køle af i 30 min.
   BEMÆRK: Homogenisatoren skal være iskold, før dyrene slibes. Slibningsprocessen kan producere varme på grund af friktion og denaturere de nukleare proteiner. Sørg for, at metal homogenisatoren er iskold for at forhindre, at dette sker. Sørg for at undgå, at vand fra den omgivende is kommer ind i homogenisatoren. Brug to sterile sprøjter til at sætte hullerne i homogenisatoren og blokere eventuelle utilsigtede væsker i at komme ind i slibekammeret.

4. Indsamling af dyr

BEMÆRK: Der findes en hurtig referencevejledning, der markerer de vigtigste trin til indsamling, forstyrrelse og fraktionering af dyrene (figur 1).

1. Saml de velfodrede L4 dyr med M9 buffer i et 15 mL konisk rør og centrifuge dyrene ved 1000 x g i 3 min. Fjern supernatanten og fortsæt med at vaske dyrepillen, indtil supernatanten er klar.
2. Dyrene vaskes igen med 3 mL 4 °C hypotonisk stødpude og centrifuge igen ved 1000 x g i 3 min.
   BEMÆRK: Under den endelige vask med hypotonbufferen på 4 °C kan dyrene klæbe til siden af røret. Dette er normalt og kan resultere i et lille tab af dyr under fjernelsen af supernatanten.
3. Fjern hypotonbufferen, og tilsæt 1 mL "komplet hypotonisk buffer" til dyrepillen. Overfør dyreaffjedringen til en ny 2 mL steril sprøjte.
   BEMÆRK: Når dyrene overføres til sprøjten ved hjælp af en mikropipette, skal du forsigtigt pipette en steril 0,1% Tween20-opløsning til at belægge indersiden af pipettespidsen for at reducere antallet af dyr, der går tabt på grund af klæber til pipettespidsvæggene.

5. Fraktionering

1. På is homogeniseres dyrene ved forsigtigt at skubbe dyrene gennem balch homogenisatorens slibekammer, der er lastet med 7,9820 mm kuglen og ind i en ny steril sprøjte. Gentag at skubbe dyrene gennem slibekammeret i 30 komplette cyklusser.
   BEMÆRK: En 'komplet cyklus' defineres som den komplette op- og nedbevægelse af en sprøjtes stempel.
   Dette slibetrin bruger 7,9820 mm kugle (18 μm kugleleje).
2. Efter 30 cyklusser fjernes så meget af dyreaffjedringen som muligt fra Balch-homogenisatoren, og sprøjten opbevares, hældes ned i et 1,7 mL microtube.
3. Fjern 7,9820 mm kuglen fra slibekammeret og rengør den med deioniseret vand. Tør og vend bolden tilbage til dens mærkede rør.
4. Sæt kuglen 7,9880 mm (12 μm mellemrum) ind i slibekammeret, og homogenisatoren tages op igen.
5. Skyl slibekammeret igen med 1 mL iskold 'komplet hypotonisk buffer'.
6. Slib affjedringen i 25 hele cyklusser.
7. Efter 25 cyklusser fjernes dyreophænget fra Balch-homogenisatoren, suspensionen overføres til en ren 1,7 mL mikrotube og opbevares på is.
   BEMÆRK: Demontere og rengør Balch homogenisatoren med 70% ethanol og deioniseret vand. Sørg for at returnere 7.9880 mm bolden til det rigtige rør.
8. Befugtning af dyrekroppe og -affald ved at centrifugere suspensionen ved 500 x g, 4 °C i 5 min.
9. Pipette 40 μL af supernatanten til et rør mærket 'inputfraktion' og opbevares på is.
   BEMÆRK: Skriv alle etiketter med en alkoholsikker pen for at undgå at smøre dem senere.
10. Overfør den resterende supernatant til et nyt 1,7 mL rør, idet du sørger for at undgå at røre ved pelleten i bunden af røret og kassér derefter pelleten.
11. Centrifugere supernatanten til pellet kernerne ved 4.000 x g, 4 °C i 5 min.
12. Supernatanten overføres, pas på ikke at forstyrre de pelleterede kerner, til et nyt 1,7 mL rør og mærk røret som 'cytosolic brøk'.
    BEMÆRK: Centrifugere den cytosolic fraktion yderligere ved 17.000 x g, 4 °C i 30 min for at fjerne eventuelle resterende uopløselige materiale, og bruge det som en negativ kontrol for vestlige blots (specielt for nukleare proteiner).
13. Kernepillen vaskes med 500 μL 'komplet hypotonisk buffer' og pellet overføres til et nyt 1,7 mL rør. Centrifugere den ophængte pellet ved 4.000 x g, 4 °C i 5 min.
14. Supernatanten kasseres, og der tilsættes 500 μL frisk »fuldstændig hypotonisk stødpude« til atompillen, og suspensionen overføres til et nyt 1,7 mL rør. Centrifugere prøven igen ved 4.000 x g, 4 °C i 5 min.
15. Fjern supernatanten, og lad feltet opløses i 40 μL 'komplet hypertonisk buffer'. Overfør den nye atomaffjedring til et nyt 1,7 mL rør, mærk røret som 'atomfraktion', og opbevar det på is.
16. Bestem proteinkoncentrationen af de tre fraktioner ved hjælp af et fluorescerende kvantificeringssæt.
    BEMÆRK: Mængden af nukleart protein, der er erhvervet ved denne metode, kan variere fra 1-2 μg/μL.
17. Aliquot de nukleare fraktioner i engangsrør, der indeholder 6 μg af det nukleare protein og snap fryse i en tøris og ethanol bad. Opbevares ved -80 °C, indtil den er videre.

6. Transskription assay

1. Tænd og forvarm en varmeblok til 30 °C.
2. Fjern følgende fra Nulcear Extract in vitro transskriptionssystem: 50 mM _MgCl2, Nuclear Extract 1x Transcription Buffer, 100 mM rATP, 100 mM rCTP, 100 mM rGTP, 100 mM rUTP og CMV promotoren positiv kontrol skabelon. Tø op på is.
   BEMÆRK: Forstærk den positive DNA-skabelon ved hjælp af en high-fidelity polymerase og opbevar den som normaliserede engangs aliquots.
3. Bland og centrifugere optøede rNTPs før du forbereder en 10 mM arbejdsløsning.
   BEMÆRK: Der tilsættes 2 μL af hver rATP, rCTP, rGTP og rUTP til 12 μL _H2O for at opnå 10 mM af hver rNTP. Denne sammensætning kan skaleres op, hvis det er nødvendigt.
4. Aliquot rNTP-blandingen til mærkede engangsrør og opbevares ved -20 °C til fremtidig brug.
5. I et friskt 1,5 mL rør mærket "Mastermix" tilsættes reagenserne pr. reaktion som nævnt i tabel 5
6. Mastermixens 14 μL overføres til hvert reaktionsrør
7. Der tilsættes 11 μL minus (volumen for 5 μg af atomekstraktet) af 1x Transskriptionsbuffer til hvert reaktionsrør.
8. Der tilsættes 5 μg af det nukleare ekstrakt til hvert reaktionsrør.
9. Tryk forsigtigt på reaktionsrøret for at blande indholdet inde og puls centrifuge rørene efter blanding for at sikre, at der ikke sidder reaktionsmateriale fast på rørenes væg.
10. Inkuberes ved 30 °C i 30 min.
11. Stop straks reaktionen ved at tilsætte 400 μL RLT-buffer fra RNA-ekstraktionssættet.
    BEMÆRK: På dette tidspunkt er det sikkert at stoppe. Prøverne kan opbevares ved -80 °C, indtil der ryddes yderligere op med RNA-ekstraktionssættet.

7. RNA oprydning

1. Forbered DNase I lagerløsning ved hjælp af RNase-Free DNase sæt leveres i RNA ekstraktion kit. Den lyophiliserede DNase I opløses i 550 μL RNasefrit vand. Bland forsigtigt opløsningen. Må ikke hvirvler . DNase I-opløsningen anvendes i 10 μL engangsrør og opbevares ved -20 °C.
2. Forbered 70% og 80% ethanol ved hjælp af molekylær kvalitet ethanol og RNase-fri vand.
3. Flyt prøverne og reagenserne til et RNase-fri arbejdsområde, før oprydningen påbegyndes.
4. Tilsæt 400 μL 70% ethanol til hver prøve og forsigtigt pipette til at blande godt.
5. Prøvens 400 μL overføres til en mærket RNA-ekstraktionsspinsøjle med et opsamlingsrør på 2 mL og centrifugprøven ved 8.500 x g for 30 s. Kassér gennemstrømningen.
6. Gentag trin 7.5 med den resterende prøve, og kassér strømmen igennem.
7. Der tilsættes 350 μL RW1-buffer (RNA-ekstraktionssæt) til hver kolonne. Centrifugere kolonnerne ved 8.500 x g for 30 s. Kassér gennemstrømningen.
8. Der tilsættes 70 μL RDD-buffer (RNA-ekstraktionssæt) til en enkelt 10 μL aliquot DNase I lageropløsning, og bland forsigtigt. Må ikke hvirvler.
9. DNase I inkubationsblandingen (80 μL) tilsættes direkte til spinsøjlemembranen. Inkuber kolonnerne ved stuetemperatur i 15 min.
   BEMÆRK: Sørg for at tilføje DNase I-opløsningen til membranen. Undgå at miste en del af opløsningen til søjlevæggen eller O-ringen.
10. Efter 15 min tilsættes 350 μL RW1 buffer til kolonnerne. Centrifuge i 30 s ved 8.500 x g. Kassér gennemstrømningen.
11. Placer kolonnerne i nye 2 ML opsamlingsrør. Der tilsættes 500 μL RPE-buffer (RNA-ekstraktionssæt) til spinkolonnen. Centrifugere kolonnerne ved 8.500 x g i 30 s til at vaske membranen. Kassér gennemstrømningen.
12. Der tilsættes 500 μL 80% ethanol til hver kolonne og centrifuger kolonnerne ved 8.500 x g for 30 s. Kassér gennemstrømningen.
13. Placer kolonnerne i nye 2 ML opsamlingsrør. Lad kolonnelåglerne være åbne, centrifugere kolonnerne ved 17.900 x g i 5 min. Kassér gennemstrømningen.
14. Sæt kolonnerne i mærket 1,7 mL rør. Tilsæt 17 μL RNasefrit vand direkte til midten af spinsøjlemembranen. Lad søjlerne hvile ved stuetemperatur i 1 min. Centrifugere kolonnerne ved 17.900 x g i 1 min.
15. Kassér kolonnen, og opbevar 1,7 mL-røret med den friskrensede RNA-prøve.

8. DNA fordøjelse

1. Forvarm to varmeblokke ved 37 °C og 65 °C.
2. Hver prøve tilsættes 2 μL 10x reaktionsbuffer.
3. Der tilsættes 1 μL (1 MBU) DNase til hver prøve.
4. Sæt en pipette til 10 μL og pipette den nye opløsning op og ned for at blande forsigtigt. Må ikke hvirvler.
5. Inkuber RNA-prøverne ved 37 °C i 30 min for at fordøje eventuelle resterende DNA.
6. Inaktiver DNase ved at inkubere prøverne på varmeblokken ved 65 °C i 10 min.
   BEMÆRK: Det er sikkert at stoppe ved dette trin og opbevare RNA ved -80 °C for at udføre omvendt transskription senere.

9. Omvendt transskription

1. Ved programmering af termocyklussen tilsættes yderligere 1 time, 37 °C trin før inkubation for at forvarme termocyklussen. Kør programmet med 'forvarmningstrinnet', mens prøverne tilberedes, og lad termocyklussen nå op på 37 °C. Når prøverne til omvendt transskription er klar, skal du springe 37 °C-forvarmningstrinnet over og fortsætte til det faktiske inkubationstrin (tabel 6). Hvis termocyklussen ikke har en springfunktion, skal du tilføje et trin på 1 min. 37 °C før inkubation. Lad termocykelscyklen varme til den korrekte temperatur, før du sætter systemet på pause og tilføjer de forberedte prøver.
2. Forbered en 10 μM arbejdsløsning af transskription omvendt primer i RNase-fri _H2O og opbevar den på is.
3. Tø op på is, 10x buffer fra det omvendte transskriptionssæt, dNTP-mix (5 mM hver dNTP), RNase Inhibitor og den omvendte transskriptase.
4. Forbered en Mastermix (pr. reaktion) ved at tilføje de bestanddele, der er nævnt i tabel 7 , til et rent 0,2 mL PCR-rør.
5. Aliquot 18 μL af Mastermix i nye 0,2 mL PCR rør for hver prøve.
6. Der tilsættes 2 μL af det DNasebehandlede RNA for hver prøve i deres henholdsvis mærkede rør.
7. Prøverne inkuberes ved 37 °C i 1 time i en forvarmet termocykel.
8. Flyt prøverne til -20 °C til opbevaring efter omvendt transskription, eller fortsæt direkte til næste trin.
   BEMÆRK: Det er sikkert at stoppe ved dette trin; opbevares cDNA ved -20 °C til senere brug.

10. Specifik produktforstærkning

1. Tø op på is: cDNA, 10 μM transskription fremad og 10 μM transskription omvendte primere og PCR 2x Premix A.
   BEMÆRK: Aliquot PCR 2x Premix A i mindre mængder for at reducere optøningstiden.
2. Opret en Mastermix (pr. reaktion) ved at tilføje de bestanddele, der er nævnt i tabel 8 , til et rent 0,2 mL PCR-rør.
3. Aliquot 24 μL Mastermix for hver prøve til rene mærket 0,2 mL PCR rør.
4. Der tilsættes 1 μL cDNA af hver prøve i deres respektive rør.
5. Inkubere prøverne i termocyklussen ved hjælp af de programbetingelser, der er nævnt i tabel 9
6. Efter inkubationen opbevares PCR-produkterne ved 4 °C eller -20 °C til langtidsopbevaring.

11. Gelanalyse

1. Brug 1x TAE buffer til at forberede en gel, der indeholder 2% w / v af agarose og 1x gel plet.
2. Kør PCR-produkterne ved 50 V og 300 mA i 1 time, eller indtil der er en klar båndadskillelse.
3. Billede gelen ved hjælp af den automatiserede eksponering program forudindlæst i gel imager.

Representative Results

Efter de skitserede trin skal give funktionelt nukleart ekstrakt (figur 1), kan afvigelse i slibe- eller vasketrinene føre til dårlig aktivitet eller lavt udbytte. Hvis der opnås funktionelT C. elegans nukleart ekstrakt, vil det transskribere regionen nedstrøms cmv-promotoren på DNA-skabelonen, når den føjes til den tidligere beskrevne in vitro-analyse . Den resulterende RNA udskrift kan renses fra de nukleare proteiner og DNA skabelon ved hjælp af konventionelle metoder. Uden skabelonen DNA, omvendt transskription og efterfølgende PCR produkt kan kun være resultatet af RNA transskriberet af det nukleare ekstrakt. PCR-produkterne kan visualiseres på en agarosegel, intensiteten af DNA-båndet kan være tegn på kvaliteten af nukleart protein og RNA-isolering. En svag båndintensitet kan skyldes inaktivering af det nukleare ekstrakt enten ved varme eller dårlig bufferforberedelse. En alt for stærk båndintensitet kan være resultatet af DNA-forurening enten på grund af dårlig RNA-rensning eller forkert DNase fordøjelse. Konsekvente og vellykkede nukleare isolationer vil producere bånd af lignende intensiteter, og både transskriptionel og PCR negativ kontrol bør ikke have noget synligt PCR-produkt (figur 2).

Figur 1. En skitse af nuklear ekstrakt isolation. Rutediagrammet skitserer de vigtigste skridt til isolering af nukleare ekstrakt fra C. elegans. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. C. elegans nukleare ekstrakt bevarer sin aktivitet. Gelbilledet viser transskriptionsprodukterne af C. elegans L4 larver atomekstrakt ved hjælp af CMV promotor DNA-skabelonen. Vellykket isolering af aktive nukleare proteiner vil resultere i et 132 bp PCR-produkt efter in vitro transskription, som det ses i vognbane 1 og 2. Mislykket isolering vil resultere i et svagt bånd eller fraværet af et PCR-produkt svarende til bane 3. Denne visualisering af transskriptionsaktiviteten via PCR-forstærkning er en enkel måde at vurdere kvaliteten af den nukleare udvindingsisolering på. Den positive PCR-kontrol produceres ved at tilføje CMV-promotorENS DNA-skabelon til PCR-reaktionen, og den negative kontrol mangler skabelonen DNA. Klik her for at se en større version af dette tal.

Nematode Vækst Media Plader
Agar	20,4 g
Natriumchlorid	2,8 g
Bacto peptone	2,3 g
dH2O	975 mL
Autoklave ved 121 °C i 30 min
Lad mediet køle af til 50 °C, før følgende
1 M CaCl2 (steril)	1 mL
1 M MgSO4 (steril)	1 mL
10.000 enheder/mL Nystatin (Steril)	3 mL
5 mg/mL-kolesterol i 95% ethanol (filtersteriliseret)	1 mL
1M KPO4 pH 6.0 (Steril)	25 mL

Tabel 1.

M9-buffer
KH2PO4	3 g
Na2HPO4	6 g
NaCl	5 g
dH2O	1.000 mL
Autoklave ved 121 °C i 15 min
1 M MgSO4 (steril)	1 mL (tilføj efter autoklavering)
S-basal Buffer
KH2PO4	6 g
K2HPO4	1 g
NaCl	5,85 g
dH2O	1.000 mL
Autoklave ved 121 °C i 15 min
Kolesterol 5 mg/mL (steril)	1 mL (tilføj efter autoklavering)

Tabel 2.

Hypotonisk buffer
Lagerløsning	Lydstyrke	Endelig koncentration
1 M HEPES KOH pH 7,6	7,5 mL	15 mM
1 M KCl	5,0 mL	10 mM
1 M MgCl2	2,5 mL	5 mM
0,5 M EDTA	0,1 mL	0,1 mM
1 M Saccharose	175 mL	350 mM
dH2O	309,9 mL
Filtrer steriliseres

Tabel 3.

Hypertonisk buffer
Lagerløsning	Lydstyrke	Endelig koncentration
1 M HEPES KOH pH 7,6	7,5 mL	15 mM
1 M KCl	200 mL	400 mM
1 M MgCl2	2,5 mL	5 mM
0,5 M EDTA	0,1 mL	0,1 mM
10% Mellem 20	5 mL	0.10%
50% Glycerol	100 mL	10%
dH2O	184,9 mL
Filtrer steriliseres

Tabel 4.

MgCl2, 50 mM	1,5 μL
rNTP mix, 10 mM hver	1,0 μL
Skabelon DNA, 25 ng/μL	4,0 μL
RNase-fri H2O	7,5 μL

Tabel 5.

Skridt	Vikar	Tidspunkt	Cyklusnummer
Forvarme	37 °C	60 min	1x
Omvendt transskription	37 °C	60 min	1x
Holde	10 °C		1x

Tabel 6.

10x omvendt transskriptionsbuffer	2,0 μL
dNTP Mix (5 mM hver dNTP)	2,0 μL
Transskription Omvendt Primer (10 μM)	2,0 μL
RNase-hæmmer	1,0 μL
Sensiscript Reverse Transcriptase	1,0 μL
RNase-fri H2O	10,0 μL

Tabel 7.

RNase-fri H2O	6.25 μL
Transskription Forward Primer (10 μM)	2,5 μL
Transskription Omvendt Primer (10 μM)	2,5 μL
PCR 2X Forblanding A	12,5 μL
PCR enzym mix	0,25 μL

Tabel 8.

Skridt	Vikar	Tidspunkt	Cyklusnummer
Indledende denatur	92 °C	60 s	1x
Denature	92 °C	30 s
Anneal	59 °C	30 s	35x
Forlængelse	72 °C	30 s
Holde	10 °C		1x

Tabel 9.

Discussion

C. elegans er en tiltalende modelorganisme til at studere det eukaryote transskriptionssystem på grund af dets billige vedligeholdelse og den lette genetiske manipulation. Her beskrives en protokol for konsekvent isolering af funktionelt aktivt nukleart ekstrakt fra L4 C. elegans . Selvom denne protokol fokuserede på visualisering af transskriptionsaktivitet, kan cDNA produceret post-transcriptionally kvantificeres ved hjælp af RT-qPCR for at opnå en mere præcis måling af ^{transskriptionsaktiviteten8}. Denne metode til isolering af nukleare proteiner fra C. elegans kan hjælpe med at udvide studiet af eukaryote transskription maskiner. Da C. elegans ikke er en kultur af celler i en skål eller en koloni af gær, men snarere en fri-roaming dyr, isolere og forske sin nukleare ekstrakt kan give et klarere indblik i, hvordan den transskriptionelle maskiner kan ændre sig over tid eller i forskellige miljøer. Dette gør det muligt for forskere at drage fordel af C. elegans lave omkostninger og modstandsdygtighed. C. elegans, i modsætning til andre model organismer eller cellekulturer, er langt mere tilgivende, når bakteriel eller gær forurening vises. En bestand af C. elegans kan let rengøres for forurening ved hjælp af etablerede protokoller, hvilket sparer tid og kræfter, når forureningen ^opstår9. Samlet set kan brug af nukleart ekstrakt fra C. elegans til biokemiske analyser være en mere overkommelig og fleksibel mulighed i forhold til at købe nukleart ekstrakt fra en leverandør eller beskæftiger sig med mindre tilgivende modelorganismer.

Selv om denne protokol er relativt enkel, er der stadig kritiske skridt, der kræver særlig opmærksomhed for en vellykket isolering af det nukleare ekstrakt. Det er vigtigt, at de to opløsninger under forberedelsen af de komplette hypotoniske og hypertoniske buffere er tydeligt mærket og adskilt. Hvis bufferne skiftes på et hvilket som helst tidspunkt under isolationen, kan dette føre til inaktivering af de nukleare proteiner eller dårlig fraktionering af de cytosolic proteiner fra de nukleare proteiner. Isolerede nukleare proteiner bør også om nødvendigt fortyndes i hypertonisk buffer, ikke vand eller anden opløsning. Den høje saltkoncentration hjælper med at bevare proteinernes aktivitet, og en hypotonisk opløsning kan dræbe denne ^aktivitet10.

En anden udfordring, der kan opstå under slibning del af denne protokol kommer fra vragrester klæber til overfladen af wolfram bolde. Mens det er angivet, at kuglerne skal vaskes og tørres efter hver slibning cyklus, materialet vil knytte til den glatte overflade af kuglerne. Dette materiale normalt vises som rust-farvede ringe omkring omkredsen af bolde og er tyk nok til at blokere kløften mellem bolden og væggen i slibekammeret. Denne blokering er mærkbar, da det bliver mere og mere vanskeligt at skubbe dyrene gennem kværnen, hvilket i sidste ende kan føre til muskelskade eller brud på sprøjten. Hvis wolfram bolde begynder at vise misfarvning, suge dem i varmt vand i 5 minutter derefter rense overfladen med en ny skurepude. Undgå at bruge sure eller grundlæggende rengøringsløsninger. Efter forsigtigt polering skal wolframkuglerne vende tilbage til deres oprindelige glans, og det vil være mærkbart lettere at male prøver.

Denne protokol er designet til at isolere hele nukleare ekstrakt fra C. elegans. Det er ikke blevet testet til brug på andre modelorganismer. Nukleart ekstrakt fra andre organismer kan kræve forskellige buffere, og CMV-promotoren er måske ikke nok til at drive transskription i andre ikke-pattedyrsprøver. Det nukleare ekstrakt, der indsamles ved hjælp af denne metode, er heller ikke vævs- eller cellespecifikt. enhver transskriptionsaktivitet målt ved hjælp af denne metode ser på dyrene som helhed, som kan skjule de subtile ændringer mellem væv.

Fremtidige anvendelser af denne protokol kunne måle DNA reparation eller replikation maskiner af C. elegans efter DNA-skader. Den cytosolic fraktion indsamlet under isolationsprocessen kunne udnyttes til at måle mængden af opløselige proteiner og kvantificere aktiviteten af disse proteiner på en måde, der svarer til måling transskription.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables and reagents
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear	Genesee Scientific	24-706
0.2 mL Individual PCR tubes	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL sterile microtubes	Genesee Scientific	24-282S
100% absolute molecular grade ethanol	Fisher Scientific	BP2818
100% ethanol, Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL serological pipet	VWR international	89130-898
150 mm petri plates	Tritech Research	T3325
15 mL conical centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-103
20 mL plastic syringes	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject syringes	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 mL conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	339652
50 mL serological pipet	VWR international	89130-902
5 mL serological pipet	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarose	Denville Scientific	CA3510-6
Alcohol proof marker	VWR International	52877-310
Bacto peptone	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Calcium dichloride	Millipore Sigma	C4901
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’
Deionized water
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA gel stain, SYBR safe	Invitrogen	S33102
DNA ladder mix, O’gene ruler	Fisher Scientific	SM1173
DNA Loading Dye, 6x TriTrack	Fisher Scientific	FERR1161
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen	DB0715K
Dry ice
Escherichia coli OP50 strain	CGC	OP50
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38
Glycerol	Millipore Sigma	G6279
HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Hydrochloric acid 37%	Millipore Sigma	P0662
Hypochlorite bleach	Clorox
LB Broth	Millipore Sigma	L3022
Magnesium dichloride	Millipore Sigma	M8266
Magnesium Sulfate	Millipore Sigma	M7506
Medium weigh dishes	Fisher Scientific	02-202-101
microscope slides, Vista vision	VWR International	16004-368
molecular grade water, Hypure	Hyclone Laboratories	SH30538
Nystatin	Millipore Sigma	N1638
PCR system, FailSafe with premix A	Lucigen	FS99100
Potassium chloride	Millipore Sigma	P39111
Potassium phosphate dibasic	Millipore Sigma	P3786
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x	ThermoFisher Scientific	78430
protein assay kit, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
reverse transcription kit, Sensiscript	Qiagen	205211
RNA extraction kit RNeasy micro kit	Qiagen	74004
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sodium Chloride	VWR International	BDH9286-12KG
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	1-09137
Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane	VWR international	28145-501
Sucrose	VWR International	200-334-9
transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’
transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Equipment
-20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
37 °C incubator	Forma Scientific
4 °C refrigerator	ThermoFisher Scientific
-80 °C freezer	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer	Isobiotec
Benchtop Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Centrifuge, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Centrifuge, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Dissection microscope, Leica M80	Leica Microsystems
Fluorometer, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Gel imaging system, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Gel system	ThermoFisher Scientific
Heat block	VWR International	12621-048
Microcentrifuges, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
Rocking platform	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010