Summary
Denne protokol har til formål at beskrive en ny metode til måling af iboende hjertefyringshastighed ved hjælp af mikroelektrode array registrering af hele sinoatrial node væv til at identificere pacemaking defekter i mus. Farmakologiske agenser kan også indføres i denne metode for at undersøge deres virkninger på iboende pacemaking.
Abstract
Den sinoatriale knude (SAN), der ligger i højre atrium, indeholder pacemakercellerne i hjertet, og dysfunktion i denne region kan forårsage takykardi eller bradykardi. Pålidelig identifikation af hjerte pacemaking defekter kræver måling af iboende hjertefrekvenser ved i vid udstrækning at forhindre indflydelsen af det autonome nervesystem, som kan maskere sats underskud. Traditionelle metoder til at analysere iboende hjerte pacemaker funktion omfatter narkotika-induceret autonom blokade til at måle in vivo hjertefrekvenser, isolerede hjerteoptagelser til at måle iboende hjertefrekvenser, og sinoatrial strimmel eller encellet patch-clamp optagelser af sinoatrial pacemaker celler til at måle spontan handling potentielle fyring satser. Men disse mere traditionelle teknikker kan være teknisk udfordrende og vanskelige at udføre. Her præsenterer vi en ny metode til måling af iboende hjertefyringshastighed ved at udføre mikroelektrode array (MEA) optagelser af hele mount sinoatrial node præparater fra mus. MeAs består af flere mikroelektroder arrangeret i et gitterlignende mønster til optagelse af in vitro ekstracellulære feltpotentialer. Den metode, der er beskrevet heri, har den kombinerede fordel, at den er relativt hurtigere, enklere og mere præcis end tidligere tilgange til registrering af iboende hjertefrekvenser, samtidig med at det giver mulighed for nem farmakologisk forhør.
Introduction
Hjertet er et komplekst organ styret af både hjerte-iboende og ydre påvirkninger som dem, der stammer fra hjernen. Den sinoatriale knude (SAN) er en defineret region i hjertet, der huser pacemakercellerne (også kaldet sinoatriale celler eller SA-celler), der er ansvarlige for indledningen og forevælelse af pattedyrets hjerteslag1,2. Den iboende puls er den hastighed, der drives af pacemakercellerne uden indflydelse fra andre hjerte- eller neuro-humoristiske påvirkninger, men traditionelle mål for puls hos mennesker og levende dyr, såsom elektrokardiogrammer, afspejler både pacemakeren og neurale påvirkninger på hjertet. Den mest bemærkelsesværdige neurale indflydelse på SA-celler er fra det autonome nervesystem, som konstant modulerer fyringsmønstre for at opfylde kroppens fysiologiske krav3. Støtte denne idé, både sympatiske og parasympatiske fremskrivninger kan findes i nærheden af SAN4. Det iboende hjertenervesystem (ICNS) er en anden vigtig neural indflydelse, hvor ganglioneret plexi, specielt i højre forkamre, innerver og regulere aktiviteten af SAN5,6.
Forståelse pacemaking underskud er klinisk vigtigt, som dysfunktion kan ligge til grund for mange hjertesygdomme, samt bidrage til risikoen for andre komplikationer. Syg sinus syndrom (SSS) er en kategori af sygdomme karakteriseret ved dysfunktion af den sinoatriale knude, som hindrer korrekt pacemaking7,8. SSS kan præsentere med sinus bradycardia, sinus pauser, sinus anholdelse, sinoatrial exit blok, og vekslende bradyarrytmier og tachyarrhytmier9 og kan føre til komplikationer, herunder øget risiko for embolisk slagtilfælde og pludselig død8,10. Personer med Brugada syndrom, en hjertesygdom præget af ventrikelflimmer med en øget risiko for pludselig hjertedød, har større risiko for arytmogenic hændelser, hvis de også har comorbid SAN dysfunktion11,12. Sinoatrial dysfunktion kan også have fysiologiske konsekvenser ud over hjertet. For eksempel er SSS blevet observeret for at udløse anfald hos en patient på grund af cerebral hypoperfusion13.
For at identificere sinoatrial pacemaking underskud, iboende hjertefrekvenser skal bestemmes ved at måle aktiviteten af SAN uden indflydelse af det autonome nervesystem eller humoristiske faktorer. Klinisk kan dette tilnærmes ved farmakologisk autonom blokade14, men den samme teknik kan også anvendes i pattedyrsmodeller for at studere iboende hjertefunktion15,16. Mens denne tilgang blokerer en stor del af bidragende neurale påvirkninger og giver mulighed for in vivo hjerteundersøgelse, det ikke helt fjerne alle ydre påvirkninger på hjertet. En anden forskningsteknik, der anvendes til at studere iboende hjertefunktion i dyremodeller er isolerede hjerte optagelser ved hjælp af Langendorff-perfused hjerter, som typisk involverer målinger ved hjælp af elektrogram, pacing, eller epicardial multielectrode arrays17,18,19,20. Mens denne teknik er mere specifik for hjertefunktion, da det indebærer at fjerne hjertet fra kroppen, kan målingerne stadig påvirkes af mechano-elektriske autoreguleringsmekanismer, der kan påvirke iboende pulsmålinger21. De isolerede hjerteoptagelser kan også stadig påvirkes af autonom regulering gennem ICNS5,6,22,23. Desuden kan det være svært at opretholde en fysiologisk relevant temperatur i hjertet, som er kritisk for hjertefunktionsmålinger, i isolerede hjertetilgange20. En mere direkte metode til at studere SAN-funktionen er specifikt at isolere SAN-væv og måle dets aktivitet. Dette kan opnås gennem SAN strips (isoleret SAN væv) eller isolerede SAN pacemaker celler24,25. Begge kræver en høj grad af teknisk uddannelse, da SAN er en meget lille og højt defineret region, og celleisolation udgør en endnu større udfordring, da afstand kan skade cellens generelle sundhed, hvis den ikke udføres korrekt. Desuden kræver disse teknikker ekspert elektrofysiologiske færdigheder for at kunne registrere fra væv eller celler ved hjælp af individuelle registrering mikroelektroder.
I denne protokol beskriver vi en teknik til at registrere SAN in vitro ved hjælp af et mikroelektrodesystem (MEA) for at opnå iboende pulsmålinger. Denne tilgang har den fordel, at meget specifikke elektrofysiologiske optagelser er tilgængelige for forskere, der mangler intensive elektrofysiologiske færdigheder. MeAs har tidligere været brugt til at studere kardiomyocyt funktion i primære kardiomyocyt kulturer26,27,28,29,30,31,32,hjerteplader33,34,35,36,37,38,39, og hele væv monterer40, 41,42,43,44,45,46,47. Tidligere arbejde er også blevet gjort for at undersøge feltpotentialer i SAN væv41,42. Her leverer vi en metode til at bruge MEA til at registrere og analysere murine iboende SAN fyring satser. Vi beskriver også, hvordan denne teknik kan bruges til at teste farmakologiske virkninger af lægemidler på SAN iboende fyring satser ved at give en prøve eksperiment, der viser virkningerne af 4-aminopyridin (4-AP), en spænding-gated K+ kanal blocker. Ved hjælp af definerede anatomiske landemærker kan vi nøjagtigt registrere SAN uden at skulle udføre de omfattende vævsdektioner eller celleisolationer, der kræves i andre metoder. Mens MEA kan være omkostningsoverkommelige, giver optagelserne meget specifikke og pålidelige målinger af pacemaking, der kan bruges i en lang række kliniske og fysiologiske forskningsapplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøgsprocedurer, der er beskrevet her, er blevet udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra National Institutes of Health (NIH), som godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på Southern Methodist University.
1. Belægning af multielektrodesystemet (MEA) til optagelse
- Lav 25 mM boratbuffer.
- 0,953 g af Na2B4O7,10H2O opløses i 80 mL destilleret vand.
- PH-pH-tallet justeres til 8,4 med HCl, og tilsæt derefter destilleret vand til et endeligt volumen på 100 mL.
- Lav en 0,1% lageropløsning af polyethylenimin (PEI).
- Der tilsættes 100 μL på 50% (w/v) PEI til 4,9 mL destilleret vand for at lave en 1% PEI-opløsning.
- Fortynd 1% PEI-opløsningen til 0,1% i boratbuffer ved at tilsætte 1 mL af 1% PEI-opløsningen til 9 mL af 25 mM boratbufferen.
- Pipette ~1 mL af 0,1% PEI-opløsningen i mea-fadet (microelectrode array), så elektroderne er helt dækket (Figur 1A og 1B).
BEMÆRK: MEA's mikroelektroder består typisk af platinsort eller carbon nanorør og isoleres med polyimid (eller akryl); begge materialer er hydrofobiske. Ved at overlægge MEA med en kationisk polymer som PEI, den hydrofobiske MEA overflade er gjort mere hydrofil, så vævsprøver til at gøre bedre kontakt med MEA overflade (Figur 1A1). - Dæk MEA-fadet med termoplastisk film for at reducere fordampningen, og lad MEA natten over ved stuetemperatur (Figur 1C).
- Aspirere PEI opløsning fra MEA parabol ved hjælp af en pipette, være omhyggelig med ikke at røre elektrode gitter, som kan beskadige elektroderne, og derefter skylles ≥4 gange med destilleret vand (Figur 1D).
- Opbevar den PEI-coatede MEA under 1-2 mL ultrapurt vand og forsegles med termoplastisk film ved 4 °C, indtil det er nødvendigt. Alternativt kan du opbevare den coatede MEA ved at nedsænke den i et bæger fyldt med ultrapurt vand (Figur 1E).
BEMÆRK: PEI-belægningsprocessen skal kun udføres én gang for MEA før dens første brug, og efter hver optagelsessession skal MEA opbevares nedsænket i ultrapurt vand.
2. Klargøring af komplet Tyroders opløsning til vævs dissektion
- Lav 1.000 mL komplet Tyrodes opløsning til dissektion; først tilsættes 8.1816 g NaCl til 800 mL ultrapure vand.
- Opløsningen tilføjes følgende mængde kemikalier: 0,4025 g KCl; 0,1633 g af KH2PO4; 1.1915 g HEPES; 0,9999 g glukose; 0,0952 g MgCl2; 0,2646 g ca.2,2H2O.
- Juster pH-skærmen til 7,4 med NaOH, og tilsæt derefter ultrapurt vand, indtil det samlede volumen er 1.000 mL.
BEMÆRK: Den endelige sammensætning af Complete Tyrodes opløsning vil være følgende (i mM): 140 NaCl, 5,4 KCl, 1,2 KH2PO4, 5 HEPES, 5,55 glukose, 1 MgCl2, 1,8 CaCl2.
3. Forberedelse af iltet Tyroders opløsning til optagelse
- Lav 500 mL tyroders løsning; tilsæt 4,003 g NaCl til 400 mL ultrapure vand.
- Opløsningen: 0,651 g NaHCO3; 0,042 g af NaH2PO4; 0,132 g ca.2,2H2O; 0,149 g KCl; 0,0476 g MgCl2; 0,999 g glukose.
- Juster pH-skærmen til 7,4 med HCl, og tilsæt derefter ultrapurt vand, indtil det samlede volumen er 500 mL.
- Oxygener opløsningen med carbogen i mindst 30 min ved stuetemperatur, før optagelsen påbegyndes.
BEMÆRK: Tyroderens endelige sammensætning vil være følgende (i mM): 137 NaCl, 15,5 NaHCO3, 0,7 NaH2PO4, 1,8 CaCl2, 4 KCl, 1 MgCl2, 11,1 glukose. Denne Tyroders løsning har en lidt anden sammensætning end Complete Tyrodes opløsning, der anvendes til dissektion.
4. Forberedelse af 4-aminopyridinopløsning (4-AP) til farmakologisk graduering
- Lav en 1 mM arbejdsløsning af 4-AP; 18,82 mg 4-AP til 200 mL af Tyroders opløsning fra trin 3.
- Ilt 4-AP-opløsningen i mindst 30 minutter før forsøget.
5. Forberedelse af petriskålen til dissektion
- Bland silikone elastomer komponenter i en 10:1 forhold (efter vægt) af basen til hærdningsmiddel.
- Hæld ~ 15 mL silikone elastomer blanding i en 60 mm diameter Petri fad.
- Lad elastomer hærde ved stuetemperatur i 48 timer før brug.
BEMÆRK: Den silikone petriskål kan genbruges til fremtidige dissektioner.
6. Dissekere sinoatrial node (SAN)
- Forbered heparinized Complete Tyrode's løsning til SAN dissektion.
- Der tilsættes 400 μL heparin (1.000 USP/mL) til 40 mL Complete Tyrodes opløsning og varm i et 37 °C vandbad.
- Indsprøjt musen intraperitonealt med 200-300 μL heparin (1000 USP/mL) og lad dyret sidde i 10 min.
- Aflive den hepariniserede mus ved isoflurane overdosis.
- Placer musen i et lille glaskammer, der indeholder isofluranedampe, der genereres ved at tilføje 200-300 μL flydende isoflurane til et filterpapir inde i et perforeret plastrør.
BEMÆRK: Da isofluran kan forårsage hudirritation og også kan absorberes gennem huden, bør væsken ikke kontakte musen direkte. Derfor placeres den isoflurane-gennemblødte aftørring i et perforeret rør til administration. - Kontroller døden ved ophør af bevægelse og vejrtrækning indsats og ved fraværet af en tå knivspids refleks. Døden tager normalt ca. 1-2 min efter placering i kammeret.
BEMÆRK: Døden ledsages normalt af vandladning.
- Placer musen i et lille glaskammer, der indeholder isofluranedampe, der genereres ved at tilføje 200-300 μL flydende isoflurane til et filterpapir inde i et perforeret plastrør.
- Placer musen i en liggende position på en dissektion bord med poter udstrakte og fastsætte poter til brættet ved hjælp af 1 tommer lange, 23-gauge sprøjtenåle. Fjern derefter pelsen i nærheden af bunden af brystkassen ved hjælp af kirurgisk saks og skære pelsen ved rødderne.
BEMÆRK: Til et dissektionsbræt kan der anvendes polystyrenkølerllåg. - Mens du holder huden med en hæmostat, skal du bruge kirurgisk saks til at lave et tværgående snit i huden lige under bunden af brystkassen fra omkring venstre costalbue til højre costalbue (Figur 3A).
- Skær bughinden op med kirurgisk saks, og adskil forsigtigt leveren fra mellemgulvet, idet du passer på ikke at hakke leveren, hvilket vil forårsage overdreven blødning (Figur 3B). Opbragt mellemgulvet langs brystkassen for at eksponere brysthulen (Figur 3C-D).
- Ved hjælp af kirurgisk saks skæres de laterale vægge i brystkassen fra kanterne af costal buerne op til kraveben for at udsætte hjertet, idet du er omhyggelig med at undgå at beskadige hjertet (Figur 3D). Brug derefter en 23-gauge sprøjtenål til at fastgøre brystkassen over skulderen og holde den på plads og ud af vejen for det kirurgiske felt.
- Brug en overførselspipette til at dryppe varm (37 °C) hepariniseret Complete Tyroders opløsning på hjertet for at holde den fugtig.
BEMÆRK: Lad ikke hjertet tørre ud. - Fjern lungerne ved at holde dem med ekstra fine Graefe-sammentrækninger og afskære luftrøret med kirurgisk saks (Figur 3E).
- Hold toppen af hjertet med ekstra fine Graefe-sammenkrøpper og fjern det ved at skære aorta og venae cavae med kirurgisk saks. Overfør hjertet til en petriskål, der indeholder hærdet silikoneelastomer (Figur 4A), og brug en overførselspipette til at bade hjertet med 2-3 mL varm (37 °C) hepariniseret Complete Tyroders opløsning.
BEMÆRK: Pas på ikke at beskadige den sarte bageste væg i højre forkamre, som indeholder SAN, og de tilsluttede højre atrieårer. Badning af hjertet med Complete Tyroders opløsning forhindrer hjertet i at tørre ud, men nedsænker ikke hjertet helt i opløsning, da det vil forringe synligheden under dissektion. - Orient hjertet med højre atrium til højre og venstre atrium til venstre.
BEMÆRK: Dissektion af SAN-vævet skal ske hurtigt for at forhindre iskæmirelateret skade. - Fastgør hjertets spids til fadet med en dissektionsstift. Derefter, mens du holder ringere vena cava med Dumont #2 laminectomy sammenklapper, indsætte en 22 G sprøjte nål gennem ringere og overlegen vena cava at finde deres position i højre atrium, som også identificerer den omtrentlige position af SAN (placeret i plasteret af væv mellem ringere og overlegen vena cava (Figur 4B).
- Ved hjælp af små dissektionsnåle fastgøres venstre og højre atrie vedhæng til skålen.
- Mens du holder venstre atrie vedhæng med Dumont #2 laminectomy pinps, sætte en dissektion pin gennem venstre atrie vedhæng til at holde det på plads.
- Mens du holder den rigtige atrie vedhæng med Dumont #55 pinps, sætte en dissektion pin gennem højre atrie vedhæng til at holde det på plads.
BEMÆRK: Den samme type sammentak kan bruges til at holde venstre og højre atrie vedhæng, hvis det ønskes.
- Fjern sprøjtenålen, der spænder over venae cavae.
- For at frigøre blod fra hjertet skal du bruge Castroviejo saks til at fjerne toppen af hjertet (dvs. den nederste halvdel) ved at lave et tværgående snit over hjertekamrene (Figur 4C). Vask derefter hjertet ved at tilføje varm (37 °C) hepariniseret Complete Tyrodes opløsning med en overførselspipette.
- Brug Castroviejo saks til at skære langs atrioventrikulær septum holde snit tættere på ventrikel end forkamrene. Fortsæt med at skære langs atrioventrikulær septum, indtil forkamrene er adskilt fra hjertekamrene.
- Skær langs den interatriale septum for at fjerne venstre atrium.
- Placer dissektionsnåle i periferien af det højre atrium for at få det til at lægge sig fladt ned (Figur 4D). Fjern eventuelt resterende fedt, fartøjer eller væv fra atriummet ved hjælp af Castroviejo-saksen.
- Find SAN i højre atrium, som i denne orientering er omtrent omgivet af den overlegne vena cava (på toppen), ringere vena cava (på bunden) og cristae terminalis (til venstre) (Figur 4D).
BEMÆRK: Crista terminalis fremstår som en mørk muskuløs højderyg mellem højre atrie vedhæng og SAN. Ofte san arterie kan også ses løbe gennem SAN (Figur 4D).
7. Forberedelse af MEA-systemet til optagelse
- Tyroders opløsning (fra trin 3) til inputopløsningsflasken (Figur 5C) og ilt den ved at tænde for strømmen af carbogengas (Figur 5A) til systemet.
BEMÆRK: Tyroderens opløsning, der anvendes til optagelsen, er lidt anderledes i sammensætning end Complete Tyrodes opløsning, der anvendes til dissektionen. - Kontroller carbogens strøm ved at observere bobler i den koniske kolbe, som bruges til at befugte gassen (Figur 5B) og inputopløsningsflasken (Figur 5C) .
- Sæt den peristaltiske pumpeindløbsslange (Figur 5D) i Tyroders optagelsesopløsning (Figur 5C). Sæt derefter den peristaltiske pumpeudløbsslange i opsamlingsflasken (Figur 5I).
- Indstil den peristaltiske pumpe til 25 rpm, hvilket giver en strømningshastighed på 2 mL/min og start pumpen. Kontroller, om der er bufferlækage eller overløb i systemet.
- Indstil temperaturregulatoren til 37 °C, musenes fysiologiske temperatur (Figur 5E).
8. Placering af hjertevævet på MEA-gitteret
- Overfør det dissekerede SAN-væv ved hjælp af en pensel (figur 6A) fra dissekeringsgælden til MEA-gitteret (figur 1A1).
- Mens du ser under et omvendt mikroskop, skal du forsigtigt placere vævet med en blød pensel, så SAN-regionen overlejrer elektrodegitteret.
- Re-position vævet efter behov for at sikre, at det lægger fladt på elektrodegitteret, hvilket gør god kontakt med elektroderne.
BEMÆRK: Der kræves en blød pensel til at flytte vævet for at undgå at beskadige elektrodegitteret.
- Når vævet er korrekt placeret, skal du bruge knogletrakkerne (eller eventuelle buede sammentvingere) til at placere masken over vævet (figur 6A) . Brug derefter knogletr frem til at placere harpeankeret (figur 6A) på masken for at holde alt på plads (Figur 6B).
- Tag et billede af placeringen af vævet på MEA, så aktiviteten af de enkelte elektroder kan korreleres med deres anatomiske placering under optagelsen. Dette kan gøres ved at holde en smartphone op til det omvendte mikroskopmål eller ved hjælp af et vedhæftet mikroskopkamera.
BEMÆRK: Hvis mea'ens retning ikke ændres efter at have taget billedet, vises den øverste venstre elektrode som den første kanal (Ch1) under optagelsen. - Anbring MEA-fadet på stikpladen (Figur 5F og 6C), og placer forsigtigt perfusionshætten (Figur 6C) på MEA-fadet uden at forstyrre harpeskivens anker. Perfusionshætten kan sikres yderligere ved hjælp af et stykke laboratorietape (Figur 6C).
BEMÆRK: Ud over at have justerbare opløsningsrør og udstrømningsrør har hætten også en port til levering af gas (Figur 6C). Derudover løber referenceelektroderingen gennem hætten (Figur 6C). - Lad vævet komme sig efter håndtering og akklimatificere sig til kammeret i 15-20 minutter før optagelsen.
9. Angivelse af dataindsamlingsprotokollen til registrering
BEMÆRK: Følgende trin beskriver åbning af softwareprotokollen for spontan beatoptagelse og definition af optagelsesbetingelserne. Detaljerne i disse trin kan variere afhængigt af den specifikke software, der bruges, men den generelle disposition bør forblive den samme.
- Tænd for forstærkeren (Figur 5G), og konfigurer en arbejdsgang for optagelsen i softwaren på computeren (Figur 5H).
- Åbn softwaren , og klik på arbejdsgangen.
- Vælg Åbn ny mappe.
- Åbn mappen Fra skabeloner.
- Vælg 64MD1-1920X1080 (afhængigt af skrivebordets opløsning).
- Åbn mappen QT.
- Åbn mappen Spontan optagelse.
- Vælg Beat_recording.moflo-skabelonen, og åbn den (Figur 7A).
- Indstil registreringsparametrene for at angive antallet af spor, sporvarighed, sporinterval, indgangsspænding,prøveudtagningshastighed osv.
BEMÆRK: For beat frekvens og interspike dataindsamling, typisk bruge en indgangsområde spænding på 2,9 mV, en 1-Hz high pass filter, en 1000-Hz low pass filter, og en prøveudtagning sats på 20 kHz. - Hvis du vil markere forskellige faser eller betingelser for eksperimentet, f.eks. før og efter administration af lægemidler, skal du klikke på fanen Anmærkninger for at tilføje de ønskede notationer (Figur 7C).
- Hvis du vil angive fildestinationen for de data, der skal indsamles, skal du markere feltet Aktiver lagring og angive det ønskede filnavn i feltet Ændring af filnavn.
10. Udførelse af registrering og indsamling af data
- Klik på knappen Indspil og afspil på øverste menulinje i anskaffelsessoftwaren for at starte optagelsen. Indhent data for 10 spor af 1 min varighed med intervaller på 2 min mellem spor.
- Fra disse indledende spor skal du kontrollere, at de registrerede bølgeformer er i overensstemmelse med et sundt vævspræparat af høj kvalitet ved at bekræfte, at de fleste optagelseskanaler udviser signal amplituder på ≥ 0,5 mV og identiske inter-spike intervaller (Figur 8).
BEMÆRK: En indledende vurdering af de enkelte mikroelektroders aktivitet og bølgeforme svarende til deres anatomiske placeringer kan udføres ved at henvise til det billede, der er erhvervet efter positionering af vævet på MEA. - Hvis du vil måle virkningerne af lægemidler på vævet, skal du sætte optagelsen på pause efter at have indsamlet de første oprindelige data ved at klikke på pauseknappen på menulinjen øverst.
BEMÆRK: Eksperimentets lægemiddelresponsfase kan noteres i optagelsen ved at klikke på fanen Anmærkninger og tilføje den ønskede notation som beskrevet ovenfor (Figur 7C). - Sæt pumpen på pause, og skift pumpeindløbsslangen fra den normale optagelsesløsning til Tyroders opløsning, der indeholder det ønskede foretrukne lægemiddel.
BEMÆRK: I eksempelforsøget blev Tyroders opløsning brugt med 1 mM 4-aminopyridin (4-AP). - Genstart pumpen, og afbryd optagelsen midlertidigt for at begynde at indsamle data igen.
- Når den lægemiddelinfunderede Tyrodes opløsning har nået vævet, optager 10 spor på samme måde som tidligere for baselineoptagelserne.
BEMÆRK: Sporene vil tage lidt tid at stabilisere som stoffet infunderes i optagekammeret. Virkningsmekanismen af lægemidlet kan også påvirke registrering stabilitet. For lægemidler, der har reversible virkningsmekanismer, bør der også registreres en udvaskningsperiode for at bekræfte genoprettelsen af aktivitet til baselineniveauer, som er en indikator for sundt væv. - Klik på Stop for at afslutte optagelserne.
- Tag et endeligt billede af placeringen af vævet på MEA under mikroskopet, hvis vævet har ændret sig efter den indledende optagelse setup procedure.
11. Rengøring af opsætningen efter optagelsen
- Rengør MEA.
- Når optagelsen er afsluttet, skal du forsigtigt fjerne optageopløsningen fra MEA-fadet ved hjælp af en 1 mL mikropipette.
BEMÆRK: Pas på ikke at kontakte MEA-elektroderne, som kan beskadige dem. - Fjern masken og harpe anker med knogle tang (eller nogen buede tang). Brug derefter en pensel til at fjerne vævet fra MEA-overfladen, idet du altid er omhyggelig med ikke at røre ved de enkelte mikroelektroder.
- Brug en vaskeflaske, skyl forsigtigt MEA skålen med ultrapurt vand ca. 3 til 4 gange.
- Opbevar den rensede MEA nedsænket i ultrapurt vand ved 4 °C.
- Når optagelsen er afsluttet, skal du forsigtigt fjerne optageopløsningen fra MEA-fadet ved hjælp af en 1 mL mikropipette.
- Skyl systemet slange ved at køre ultrapure vand gennem det i mindst 5 min ved hjælp af den maksimale hastighed indstilling på peristaltic pumpen.
BEMÆRK: For at forhindre svampevækst må der ikke efterlades vand- eller bufferopløsning inde i slangen efter rengøring.
12. Analyse af MEA optagelser til måling SAN beat frekvens
- Åbn den gemte registrerede datafil i skabelonen "Beat_frequency_analysis" i analysesoftwaren (Figur 9) .
- Klik på knappen Afspil og lad hele optagelsen køre for at visualisere datasættet og tildele passende analyseparametre.
- Vælg placeringsvinduet for det ønskede visningsformat for dataene, uanset om det vises som et gennemsnit pr. sporing eller gennemsnit pr. gang (Figur 10A).
- Vælg de kanaler, der skal medtages i analysen, og angiv de ønskede amplitudmaksima- eller amplititude minimatærskelværdier for automatisk bølgeform peakidentifikation (Figur 10B).
BEMÆRK: En individuel kanal, en kombination af kanaler eller alle 64 kanaler kan vælges til analyse på dette trin (Figur 9). Hvis de valgte tærskelværdier er for tæt på bølgeformens maxima- og minimaværdier, identificeres nogle bølgeformtoppe muligvis ikke af analysesoftwaren. - Angiv mængden af tid før spike og post-spike, der skal medtages i analysen.
BEMÆRK: Indstillinger på 50 ms pre-spike og 100 ms post-spike fungerer normalt godt (Figur 10B).
- Når du har angivet analysebetingelserne, skal du klikke på knappen Afspil igen for at køre datasættet igen og bekræfte, at analyseparametrene er egnede til spikeudtræk.
- Til analyse identificeres de tre mest stabile på hinanden følgende spor, der udviser stabil slåhastighed for hvert spor på tværs af de fleste kanaler både i eksperimentets basisperiode og yderligere tre på hinanden følgende stabile spor i stofeksponeringsperioden (Figur 10A).
- Angiv start- og slutsporene til analyse, og angiv tidsvarigheden for hvert spor, der skal analyseres (Figur 9).
- Før analysen startes, skal du vælge aktiveringsboksene for både Gem gennemslag pr. minut og Gem interspikeinterval (Figur 10B).
- Angiv det ønskede filnavn i feltet Ændringsmodifikator filnavn (Figur 10B). De analyserede data for beatfrekvens og interspikeinterval gemmes i form af ASCII-format (tekst).
BEMÆRK: For at analysere forskellige tilstande (f.eks. baseline og lægemiddelrespons) skal analysen køres separat for hver tilstand. - Klik på knappen Afspil og optag på den øverste fanelinje for at starte analysen.
- Hvis du vil eksportere dataene til andre programmer, skal du markere felterne for Gem gennemslag pr. minut og Gem interspikeinterval (Figur 10B). Skriv det ønskede filnavn i feltet Ændring af filnavn ( Figur10B), og klik på Gem for at gemme de analyserede data i ASCII-tekstformat i den valgte mappe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter at have tilladt vævet at akklimatificer sig i fadet i 15 min, registreres 10 et-min spor. Vores nuværende protokol registrerer aktivitet i over en time, men vi har registreret stabile fyringsmønstre for ≥4 timer i ikke-offentliggjorte data, der ikke er vist her. Hvis et eksperimentelt præparat er godt til dataindsamling, skal hver optagelseskanal udvise ensartede og jævnt fordelte tilbagevendende bølgeformer (dvs. pigge) af ensartet form for en given kanal (Figur 11D). Disse bølgeformer svarer til individuelle hjerteslag, der afspejler iboende hjerte pacemaking aktivitet. Interspikeintervallerne bør være de samme for hver kanal, selvom de måske ikke er perfekt afstemt på tværs af kanaler på grund af små forskelle i deres placering i forhold til depolariseringsstedet (figur 8). Selvom bølgeformernes form for en given kanal skal være konsistent, vil bølgeformernes form variere på tværs af kanaler afhængigt af elektrodens placering i vævet (Figur 8). Graden af kontakt af vævet med elektroden kan også påvirke bølgeform egenskaber, såsom amplituden. Amplitudmaksimet bør dog være mindst 0,5 mV for de fleste kanaler, hvis præparatet er tilfredsstillende. Ud fra de 10 registrerede spor blev de tre kanaler i træk, der bedst opfylder de ovenfor beskrevne kvalitetskriterier, udvalgt til yderligere analyse, der er beskrevet nedenfor. Figur 10A viser en prøve af stabil beatfrekvens (øverste panel) og interspikeinterval (mellempanel) for tre på hinanden følgende spor. Væv, der ikke opfylder disse kriterier, bør ikke registreres, da der sandsynligvis er vævsskader, der vil hindre nøjagtig dataindsamling. Figur 11 viser eksempler på dårlige ekstraherede spike mønstre, som enten er fraværende (A), påvirket af støj (B) eller ustabil(C).
De prøvedata, der vises i tallene, blev indsamlet fra en 45 dage gammel mandlig vildtype Sort Schweizisk (Tac:N:NIHS-BC) mus. Analyseproceduren i figur 9 og figur 10 blev anvendt til at udtrække den iboende fyringshastighed og vise baseline spikes, der kan ses i figur 12A. Affyringshastigheden er den gennemsnitlige hastighed på tværs af 60.000 ms fra hvert af de tre spor, men spike mønsteret i figur 12A viser 5 s repræsentativ spiking fra et enkelt spor. Ved hjælp af automatiseret analysesoftware viste det sig, at den iboende fyringshastighed (dvs. slagfrekvens) for de udvalgte tre spor på tværs af alle 64 kanaler var ca. 320 bpm i vores prøvedata (Figur 12A). Generelt observerer vi en række værdier på omkring 290-340 bpm i vores optagelser til wildtype mus. Fyringshastigheden kan også bruges som en sekundær metode til at vurdere forberedelseskvaliteten. Priser, der enten er ustabile eller betydeligt lavere end 300 bpm, er mindre tilbøjelige til at være gode til analyse. Disse værdier kan sammenlignes med både isolerede hjerte- og enkeltcelleoptagelser,som rapporterer iboende hjertefrekvenser i intervallet ca. Derfor er MEA-optagelsesteknikken i stand til at generere pålidelige og nøjagtige mål for iboende puls.
En fordel ved MEA-systemet er, at det giver mulighed for nem anvendelse af lægemiddelmidler til at teste farmakologiske virkninger. I prøveeksperimentet testede vi virkningerne af 1 mM 4-AP på fyringshastighed, hvilket skulle bremse SAN-aktiviteten, da blokade af spændings-gated K+ kanaler er kendt for at forringe handlingspotentialet repolarisering i SA-celler24,50. Figur 12B viser, at indførelsen af 4-AP øgede interspikeintervallerne som forventet. Dette forlængede spike interval svarede til et fald i beatfrekvensen fra 320 bpm til 210 bpm. Denne fyringshastighed efter 4-AP-administration svarer til en tidligere undersøgelse, der undersøgte virkningerne af 4-AP på SAN-fyringshastigheden ved hjælp af enkeltelektrodeoptagelser af isoleret væv. Denne undersøgelse målte en fyringsrate på ca. 190 bpm i nærværelse af 4-AP50. Således kan MEA-systemet bruges som et praktisk og værdifuldt værktøj til test af farmakologiske virkninger af lægemiddelinterventioner på iboende hjertefunktion.
Figur 1: Belægning af mikroelektrodesystemet (MEA) før brug. (A) Mea består af en lille plastskål med et gitter array af 64 mikroelektroder i midten (som vist i panelet A1) og fire referenceelektroder omkring periferien i et firkantet mønster. (B) Tilsætning af 1 mL PEI buffer til pels mea. (C) Dækker MEA-fadet med termoplastisk film til inkubation natten over ved stuetemperatur. (D) Indsugning af PEI-bufferen fra MEA-fadet, som efterfølges af mindst fire skylninger med destilleret vand. (E) Opbevaring af den coatede MEA-sonde under ultrapurt vand for at forhindre, at den tørrer ud. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Værktøjer, der anvendes til sinoatrial node (SAN) dissektion. Følgende værktøjer anvendes under dissektionsdelen af protokollen: i) Petriskål med silikoneelastomer og små dissektionsnåle; ii) Plastoverførselspipette iii) Castroviejo saks, størrelse 4"; iv) Kirurgisk saks (lige) til opskæringsprocedurer — Dumont #2 Laminectomy-styrker — Dumont #55 forceps vii) Ekstra fine Graefe-sammentrøpper; viii) Hæmostater (buede). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Fjernelse af hjertet. (A) Tværgående snit i huden lige under bunden af brystkassen fra omkring venstre costalbue til højre costalbue. (B) Peritoneal snit. (C,D) Snittet af mellemgulvet langs brystkassen for at afsløre brysthulen. (E) Fjernelse af hjertet efter udskillelse af lungerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Dissektion af sinoatrial (SAN) node. (A) Udseendet af hjertet i Petriskålen efter fjernelse fra kroppen. (B) Indsættelse af sprøjtenålen gennem den ringere vena cava (IVC) og overlegne vena cava (SVC) i højre atrium. Stiften i toppen af hjertet er også vist. (C) Excision af toppen (dvs. den nederste halvdel) af hjertet til at frigive blodet. Stifterne i atrie vedhængene er også vist. (D) Det endelige udseende af SAN-regionen i højre atrium i slutningen af dissektionen. Det boksede område svarer til den omtrentlige placering af SAN. SAN arterie kan også svagt ses løbe gennem SAN i en lodret orientering. Forkortelserne: AO, aorta; CT, crista terminalis; IVC, ringere vena cava; LA, venstre atrium; RA, højre atrium; RAA, højre atrie vedhæng; SAN, sinoatrial node; SVC, overlegen vena cava. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Skematisk for mea-registreringssystemets opsætning (Microelectrode Array). Følgende komponenter omfatter systemet: (A) gasflaske (carbogen: 95% O2/ 5% CO2); b) koniske kolbe med destilleret vand for at befugte gassen (C) optagelse af Tyroders opløsningsflaske, der giver tilstrømning til MEA-fadet (D) peristaltisk pumpe til pumpning af opløsning til og fra MEA-fadet (E) temperaturregulator; (F) MEA-stikplade, der modtager signaler fra MEA-fadet (G) forstærker; (H) computer; (I) opsamlingsflaske til brugt affaldsopløsning fra MEA-fadet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Placering af SA-nodalvævet på MEA. (A) Redskaber, der anvendes til positionering af vævet: i) Maske med en gitterstørrelse på 1,5 mm, ii) harpeanker, iii) knogleklik, iv) pensel. (B) Placering af vævet på MEA. Den gule boks angiver det omtrentlige område af den sinoatriale noderegion under masken og ankeret i MEA-skålen. C) Arrangement af MEA-fadet med lukket væv på stikpladen til potentiel feltoptagelse: i) indløb til optagelsesopløsningen; — gasindtag (carbogen) iii) udløb for opløsningen iv) mikroelektrodestikplade v) perfusionsloft vi) referenceelektrodering, der er fastgjort til hætten vii) tape til at holde hætten. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Angivelse afdataindsamlingsprotokollen i softwaren. (A) Et eksempel på optagelsesskabelon, der viser placeringen af alle 64 kanaler. (B) Et eksempel på softwareinputegenskaberne for registreringsbetingelserne. (C) Et eksempel på menuen Anmærkninger, der viser, hvordan du tilføjer ny fase under optagelsen, f.eks. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Forskellige områder af vævene, der viser forskellige aktivitetsbølgeformer. Eksempel skærmskud, der viser bølgeformer med forskellige former og amplituder i forskellige kanaler. Men alle kanaler viser identiske interspike intervaller og fyring frekvenser. Kanalerne i den røde boks svarer omtrent til de elektroder, der er placeret i SAN-området af vævet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: Beat frekvens analyse skabelon. Eksempelskabelon, der viser placeringen af alle 64 kanaler i beatfrekvensanalyseskabelonen. Inplay Raw Data File inset viser et eksempel på inputegenskaberne for analysevinduet. I dette eksempel er spor 5 til 7 valgt til analyse, og varigheden af analysen for hvert spor er angivet som 60.000 ms. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: Definition af analyseparametre for spike extraction. (A) Repræsentative analyseskabelonresultater for 3 udvalgte spor af en enkelt kanal. Det øverste panel viser slagfrekvens for de tre valgte spor (tre definerede grupperinger af datapunkter), og hvert punkt repræsenterer et 10-s gennemsnit for slagfrekvens under det specifikke spor. Det midterste panel viser interval mellem spidser for de tre valgte spor (tre definerede grupper af datapunkter), og hvert datapunkt repræsenterer intervallet mellem to på hinanden følgende pigge. Det nederste venstre panel viser udvalgte repræsentative ekstraheret pigge for de sidste 5 s af den tredje spor, mens den nederste højre panel viser en ekstraheret bølgeform stammer fra 5-s gruppe af ekstraherede pigge i nederste venstre panel. (B) Udvidet visning af analysevinduet, der viser parametre, der anvendes til analyse af slåfrekvensen for de 3 spor. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11: Repræsentativt tal, der viser god kontra dårlig dataudtræk for en bestemt kanal. Forkert dataudtræk: (A) Fravær af ekstraherede pigge; (B) Udvundne pigge med støjsignaler; (C) Ustabile ekstraheret pigge. (D) Gode data, der viser stabile udtrukne pigge uden støjsignaler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 12: Optagelser ved baseline og efter administration af 1mM 4-Aminopyridin (4-AP). (A) Baseline optagelse fra en enkelt mikroelektrode viser bølgeformer med en stabil fyringsfrekvens på 320 bpm i et WT-hjerte. (B) Efter administration af 4-AP, affyring frekvensen aftager til en stabil hastighed på 210 bpm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er bydende nødvendigt at øve og mestre SAN dissektionsprocessen, da vævet er skrøbeligt, og sundt væv er nødvendigt for en vellykket optagelse. Under SAN dissektionen er korrekt orientering afgørende for at opnå den rette vævsregion. Men den oprindelige orientering af hjertet kan let gå tabt under dissektionsprocessen, hvilket komplicerer denne bestræbelse. For at sikre den korrekte venstre-højre orientering skal forkamrene derfor inspiceres visuelt. Typisk har højre atrium tendens til at være mere gennemsigtigt, mens det venstre atrium normalt er mørkere og mere rødt i farve25,48. Desuden er det vigtigt ikke at strække SAN-vævet, mens du arbejder med det eller monterer det på elektrodegitteret, da vævet let mekanisk beskadiges51. Et tip til at kontrollere sunde og korrekt dissekeret SAN væv er at undersøge det i Complete Tyrode opløsning under mikroskopet for at kontrollere, at vævet slår. Når teknikken er mestret, skal mindst 90% af vævspræparater være gode til optagelse.
Flere overvejelser kan forbedre sandsynligheden for vellykkede optagelser og efterfølgende dataanalyse. For at sikre de bedste optagelser bør løsninger omhyggeligt forberedes og testes på øvelsesmusprøver forud for eksperimentelle optagelser. Vi arbejdede meget på at tilpasse og ændre optagelsesløsningen for at optimere SAN-vævets sundhed. Derudover skal du sikre dig, at den gas, der anvendes til optagelsen, er carbogen (dvs. 95% O2/5% CO2). Enkeltcelleoptagelser bruger ofte ren ilt på grund af den specifikke kemiske sammensætning af Tyroders opløsning, der anvendes til denne applikation, men den opløsning, der anvendes til optagelse på MEA, kræver carbogen for at opretholde en stabil pH. Brug af ren ilt med Tyroderens opløsning til MEA-optagelserne vil forårsage udsving i pH-virksomheden, hvilket kan føre til hurtig forringelse af vævet. Vurdering af amplitud maxima i kanalerne som tidligere beskrevet vil hjælpe med at afgøre, om vævet er af god optagelse kvalitet. Endelig, at støtte analyse efter optagelsen, tager et billede af den monterede SAN væv på MEA elektrode array efter optagelsen er færdig er meget nyttigt. Vævet kan skifte lidt under den oprindelige opsætning af MEA, og dette giver den mest nøjagtige vurdering af elektrodeplacering til analyse.
Vi foreslår MEA optagelser som en grundig og præcis måde at karakterisere SAN fyring sats. En fordel ved MEA-teknikken er, at det gør det muligt for eksperimentatoren at fange fyringshastigheder på niveau med enkeltcelleoptagelser uden at skulle have omfattende elektrofysiologisk ekspertise. MEA-teknikken har også den fordel at eliminere de potentielle forvirrende påvirkninger af neurohumoralske og mechano-elektriske mekanismer, som er iboende i isolerede hjerteoptagelser og in vivo autonome blokademålinger21. Ventrikulær sammentrækning og respiration er de vigtigste mechano-elektriske påvirkninger, der kan ændre SAN fyring, men de er elimineret i vores vævspræparat 52,53. Mens vores teknik eliminerer de fleste af de autonome påvirkninger på SAN, kan et begrænset antal resterende ICNS-fremskrivninger i højre forkamre potentielt påvirke SAN-fyring, en teoretisk begrænsning, der skal huskes under fortolkningen af resultater5,6,22,23. En anden fordel ved mea-teknikken, der er beskrevet her, er, at den kan tilpasses til mange andre typer hjertestudier. For eksempel, selv om denne protokol viste virkningerne af 4-AP på SAN aktivitet, fremtidige undersøgelser kunne se på et næsten ubegrænset antal farmakologiske agenser, samt virkningerne af genmutationer på SAN iboende fyring. For eksempel kan ivabradin, en bestemt blokker af SAN-specifikke Hcn4 kanal, bruges til at studere sjove nuværende bidrag til fyring sats54. MEA-systemet kan også bruges til at måle hjertefunktion i andre områder af hjertet, hvilket giver mulighed for detaljeret, regionsspecifik karakterisering. Men registrering fra andre hjerte regioner ville kræve forskellige dissektion tilgange og muligheden for tyndt væv sektion før optagelse. En potentielt væsentlig begrænsning af denne teknik er de høje omkostninger ved at købe et MEA-system, som kan være uoverkommeligt. Flere MEA-systemer er tilgængelige på markedet med lignende egenskaber og funktionalitet, men de høje omkostninger forbliver de samme. Men når det oprindelige udstyr og software er erhvervet, er omkostningerne til at vedligeholde og bruge MEA-systemet ret lave. En anden begrænsning er, at mea-systemet kun gør det muligt at registrere ekstracellulære feltpotentialer, som ikke er befordrende for præcise sammenligninger af handlingspotentialeegenskaber (f.eks. amplitud og form) mellem præparater, som kan opnås med intracellulære optagelser med enkeltcellet celle. Sammenfattende giver denne protokol en effektiv arbejdsgang til at måle og analysere iboende hjerteaffyringshastigheder i mus SAN-væv med evnen til at studere virkningerne af farmakologisk intervention på fyringshastigheden på en meget specifik måde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health, tilskud numre R01NS100954 og R01NS099188.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
| 22 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-5A | Used for dissection |
| 23 gauge syringe needle | Fisher Scientific | 14-826-6C | Used for dissection |
| 60mm Petri Dishes | Genesee Scientific | 32-105G | |
| 500mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Used to store solutions |
| 1000 mL Pyrex Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | Used to store solutions |
| Bone Forceps | Fine Science Tools | 16060-11 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | |||
| Castroviejo Scissors, 4" | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Data Acquisition PC | CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920x1080 | ||
| Dissection Microscope | Jenco | ||
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Glass Chamber | Grainger | 49WF30 | Used for mouse euthanization |
| Harp Anchor Kit | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
| HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | Used for pH balancing |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Inverted Microscope | Motic | AE2000 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Lab Tape | Fisher Scientific | 15-950 | |
| Light for Dissection Microscope | Dolan-Jenner | MI150DG 660000391014 | |
| Magesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
| MED64 Head Amplifier | MED64 | MED-A64HE1S | |
| MED64 Main Amplifier | MED64 | MED-A64MD1A | |
| MED64 Perfusion Cap | MED64 | MED-KCAP01 | |
| MED64 Perfusion Pipe Holder Kit | MED64 | MED-KPK02 | |
| MED64 ThermoConnector | MED64 | MED-CP04 | |
| Mesh | Warner Instruments | 640246 | |
| Microelectrode array (MEA) | Alpha Med Scientific | MED-R515A | |
| Mobius Software | WitWerx Inc. | Specific software for the MED64 | |
| NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | Used for pH balancing |
| Normal Saline | Ultigiene | NDC 50989-885-17 | |
| Paint Brush | Fisher Scientific | NC1751733 | |
| Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
| Peristaltic Pump | Gilson | F155009 | |
| Peristaltic Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-171-298 | 1/8'' Interior Diameter |
| Polyethyleneimine | Sigma | P3143 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sylgruard Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S6566 | |
| Sodium tetraborate | Sigma | S9640 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14074-09 | |
| Transfer Pipets (3mL graduated) | Samco Scientific | 225 |
References
- Marionneau, C., et al. Specific pattern of ionic channel gene expression associated with pacemaker activity in the mouse heart. Journal of Physiology. 562 (1), 223-234 (2005).
- Josea, A. D., Collison, D. The normal range and determinants of the intrinsic heart rate in man. Cardiovascular Research. (4), 160-167 (1970).
- Peters, C. H., Sharpe, E. J., Proenza, C. Annual Review of Physiology Cardiac Pacemaker Activity and Aging. Annual Review of Physiology. 82, 21-43 (2019).
- Keith, A., Flack, M. The form and nature of the muscular connections between the primary divisions of the vertebrate heart. Journal of Anatomy and Physiology. 41 (3), 172-189 (1907).
- Wake, E., Brack, K. Characterization of the intrinsic cardiac nervous system. Autonomic Neuroscience. 199, (2016).
- Fedele, L., Brand, T. The intrinsic cardiac nervous system and its role in cardiac pacemaking and conduction. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 7 (4), 1-33 (2020).
- Mangrum, J. M., DiMarco, J. P. The evaluation and management of bradycardia. New England Journal of Medicine. 342 (10), 703-709 (2000).
- Adan, V., Crown, L. A. Diagnosis and treatment of Sick Sinus Syndrome. American Family Physician. 67 (8), 1725-1732 (2003).
- Semelka, M., Gera, J., Usman, S. Sick Sinus Syndrome: A Review. American Family Physician. 87 (10), 691-696 (2013).
- Zaragoza, M. V., et al. Exome sequencing identifies a novel LMNA splice-site mutation and multigenic heterozygosity of potential modifiers in a family with Sick Sinus Syndrome, dilated cardiomyopathy, and sudden cardiac death. PLoS ONE. 11 (5), 0155421 (2016).
- Brugada, J., Campuzano, O., Arbelo, E., Sarquella-Brugada, G., Brugada, R. Present status of Brugada Syndrome: JACC State-of-the-Art Review. Journal of the American College of Cardiology. 72 (9), 1046-1059 (2018).
- Rollin, A., et al. Prevalence, characteristics, and prognosis role of type 1 ST elevation in the peripheral ECG leads in patients with Brugada syndrome. Heart Rhythm. 10 (7), 1012-1018 (2013).
- Patel, N., Majeed, F., Sule, A. A. Seizure triggered by Sick Sinus Syndrome. BMJ case reports. 4, 2017222011 (2017).
- Knecht, S., et al. Impact of pharmacological autonomic blockade on complex fractionated atrial electrograms. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 21 (7), 766-772 (2010).
- Saba, S., London, B., Ganz, L. Autonomic blockade unmasks maturational differences in rate-dependent atrioventricular nodal conduction and facilitation in the mouse. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 14 (2), 191-195 (2003).
- Shusterman, V., et al. Strain-specific patterns of autonomic nervous system activity and heart failure susceptibility in mice. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), 51-56 (2002).
- Tse, G., Tse, V., Yeo, J. M., Sun, B. Atrial anti-arrhythmic effects of heptanol in Langendorff-perfused mouse hearts. PLoS ONE. 11 (2), 0148858 (2016).
- Tse, G., et al. Quantification of beat-to-beat variability of action potential durations in Langendorff-perfused mouse hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1578), 01578 (2018).
- Avula, U. M. R., et al. Heterogeneity of the action potential duration is required for sustained atrial fibrillation. JCI Insight. 5 (11), 128765 (2019).
- Jungen, C., et al. Impact of intracardiac neurons on cardiac electrophysiology and arrhythmogenesis in an ex vivo Langendorff system. Journal of Visualized Experiments. (135), e57617 (2018).
- Quinn, A. T., Kohl, P. Cardiac mechano-electric coupling: Acute effects of mechanical stimulation on heart rate and rhythm. Physiological Reviews. 101 (1), 37-92 (2021).
- Ripplinger, C. M., Noujaim, S. F., Linz, D.
- Pauza, D. H., Pauziene, N., Pakeltyte, G., Stropus, R. Comparative quantitative study of the intrinsic cardiac ganglia and neurons in the rat, guinea pig, dog and human as revealed by histochemical staining for acetylcholinesterase. Annals of Anatomy. 184, 125-136 (2002).
- Golovko, V., Gonotkov, M., Lebedeva, E. Effects of 4-aminopyridine on action potentials generation in mouse sinoauricular node strips. Physiological Reports. 3 (7), 12447 (2015).
- Sharpe, E. J., St. Clair, J. R., Proenza, C. Methods for the isolation, culture, and functional characterization of sinoatrial node myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (116), e54555 (2016).
- Doi, M., Ogawa, E., Arai, T. Effect of a photosensitization reaction performed during the first 3 min after exposure of rat myocardial cells to talaporfin sodium in vitro. Lasers in Medical Science. 32 (8), 1873-1878 (2017).
- Takanari, H., et al. A new in vitro co-culture model using magnetic force-based nanotechnology. Journal of Cellular Physiology. 231 (10), 2249-2256 (2016).
- Nakashima, T., et al. Rapid electrical stimulation causes alterations in cardiac intercellular junction proteins of cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (9), 1324-1333 (2014).
- Suzuki, S., et al. Effects of aldosterone on Cx43 gap junction expression in neonatal rat cultured cardiomyocytes. Circulation Journal. 73 (8), (2009).
- Horiba, M., et al. T-type Ca2+ channel blockers prevent cardiac cell hypertrophy through an inhibition of calcineurin-NFAT3 activation as well as L-type Ca2+ channel blockers. Life Sciences. 82 (11-12), 554-560 (2008).
- Inoue, N., et al. Rapid electrical stimulation of contraction modulates gap junction protein in neonatal rat cultured cardiomyocytes: involvement of mitogen-activated protein kinases and effects of angiotensin II receptor agonist. Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 914-922 (2004).
- Aalders, J., et al. Effects of fibrillin mutations on the behavior of heart muscle cells in Marfan syndrome. Scientific Reports. 10 (16756), (2020).
- Matsuura, K., et al. Creation of mouse embryonic stem cell-derived cardiac cell sheets. Biomaterials. 32 (30), 7355-7362 (2011).
- Fujita, H., Shimizu, K., Nagamori, E. Application of a cell sheet-polymer film complex with temperature sensitivity for increased mechanical strength and cell alignment capability. Biotechnology and Bioengineering. 103 (2), 370-377 (2009).
- Baba, S., et al. Generation of cardiac and endothelial cells from neonatal mouse testis-derived multipotent germline stem cells. Stem Cells. 25 (6), 1375-1383 (2007).
- Baba, S., et al. Flk1+ cardiac stem/progenitor cells derived from embryonic stem cells improve cardiac function in a dilated cardiomyopathy mouse model. Cardiovascular Research. 76 (1), 119-131 (2007).
- Shimizu, K., et al. Construction of multi-layered cardiomyocyte sheets using magnetite nanoparticles and magnetic force. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 803-809 (2007).
- Haraguchi, Y., Shimizu, T., Yamato, M., Kikuchi, A., Okano, T. Electrical coupling of cardiomyocyte sheets occurs rapidly via functional gap junction formation. Biomaterials. 27 (27), 4765-4774 (2006).
- Miyagawa, S., et al. Tissue cardiomyoplasty using bioengineered contractile cardiomyocyte sheets to repair damaged myocardium: Their integration with recipient myocardium. Transplantation. 80 (11), 1586-1595 (2005).
- Watts, M., et al. Decreased bioavailability of hydrogen sulfide links vascular endothelium and atrial remodeling in atrial fibrillation. Redox Biology. 38, 101817 (2021).
- Feng, Y., Cao, H., Zhang, Y. Prediction model of sinoatrial node field potential using high order partial least squares. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, 1805-1811 (2015).
- Feng, Y., Cao, H., Wang, Y., Zhang, Y. Fuzzy linguistic prediction model for sinoatrial node field potential analysis in acute hyperglycemia environment. Bio-Medical Materials and Engineering. 26, Suppl 1 881-887 (2015).
- Suzuki, K., Matsumoto, A., Nishida, H., Reien, Y., Maruyama, H., Nakaya, H. Termination of aconitine-induced atrial fibrillation by the KACh-channel blocker tertiapin: underlying electrophysiological mechanism. Journal of Pharmacological Sciences. 125 (4), 406-414 (2014).
- Chang, S. -L., et al. Heart failure enhances arrhythmogenesis in pulmonary veins. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 38 (10), 666-674 (2011).
- Wang, Y. -J., et al. Time-dependent block of ultrarapid-delayed rectifier K+ currents by aconitine, a potent cardiotoxin, in heart-derived H9c2 myoblasts and in neonatal rat ventricular myocytes. Toxicological Sciences. 106 (2), 454-463 (2008).
- Lai, Y. -J., Huang, E. Y. -K., Yeh, H. -I., Chen, Y. -L., Lin, J. J. -C., Lin, C. -I. On the mechanisms of arrhythmias in the myocardium of mXinα-deficient murine left atrial-pulmonary veins. Life Sciences. 83 (7-8), 272-283 (2008).
- Gustafson-Wagner, E. A., et al. Loss of mXinα, an intercalated disk protein, results in cardiac hypertrophy and cardiomyopathy with conduction defects. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (5), 2680-2692 (2007).
- Clark, R. B., et al. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286, 1757-1766 (2004).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Nikmaram, M. R., et al. Characterization of the effects of Ryanodine, TTX, E-4031 and 4-AP on the sinoatrial and atrioventricular nodes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 96 (1-3), 452-464 (2008).
- Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nature Protocols. 11 (1), 61-86 (2016).
- Masé, M., Glass, L., Ravelli, F. A model for mechano-electrical feedback effects on atrial flutter interval variability. Bulletin of Mathematical Biology. 70 (5), 1326-1347 (2008).
- Franz, M. R., Bode, F. Mechano-electrical feedback underlying arrhythmias: The atrial fibrillation case. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 82 (1-3), 163-174 (2003).
- Bucchi, A., Tognati, A., Milanesi, R., Baruscotti, M., DiFrancesco, D. Properties of ivabradine-induced block of HCN1 and HCN4 pacemaker channels. Journal of Physiology. 572 (2), 335-346 (2006).
