Este protocolo describe cómo infectar organoides intestinales humanos desde su lado apical o basolateral para caracterizar las interacciones huésped/patógeno a nivel de una sola célula utilizando la tecnología de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNAseq).
Los organoides intestinales humanos constituyen el mejor modelo celular para estudiar las infecciones patógenas del tracto gastrointestinal. Estos organoides se pueden derivar de todas las secciones del tracto gastrointestinal (gástrico, yeyuno, duodeno, íleon, colon, recto) y, tras la diferenciación, contienen la mayoría de los tipos de células que se encuentran naturalmente en cada sección individual. Por ejemplo, los organoides intestinales contienen enterocitos que absorben nutrientes, células secretoras (Cáliz, Paneth y enteroendocrino), células madre, así como todos los intermediarios de diferenciación específicos del linaje (por ejemplo, tipos de células tempranas o inmaduras). La mayor ventaja en el uso de organoides derivados del tracto gastrointestinal para estudiar enfermedades infecciosas es la posibilidad de identificar con precisión qué tipo de célula es el objetivo del patógeno entérico y abordar si las diferentes secciones del tracto gastrointestinal y sus tipos de células específicas responden de manera similar a los desafíos de los patógenos. En los últimos años, se han empleado modelos gastrointestinales, así como organoides de otros tejidos, para estudiar el tropismo viral y los mecanismos de patogénesis. Sin embargo, utilizar todas las ventajas del uso de organoides cuando se emplean virus altamente patógenos representa un desafío técnico y requiere estrictas consideraciones de bioseguridad. Además, como los organoides a menudo se cultivan en tres dimensiones, el lado basolateral de las células está orientado hacia el exterior del organoide, mientras que su lado apical está orientado hacia el interior (lumen) de los organoides. Esta organización plantea un desafío para los patógenos entéricos, ya que muchas infecciones entéricas se inician desde el lado apical / luminal de las células después de la ingestión. El siguiente manuscrito proporcionará un protocolo completo para preparar organoides intestinales humanos para la infección con patógenos entéricos al considerar el lado de la infección (apical vs. basolateral) para realizar la secuenciación de ARN de una sola célula para caracterizar las interacciones huésped/patógeno específicas del tipo celular. Este método detalla la preparación de los organoides, así como las consideraciones necesarias para realizar este trabajo bajo condiciones de contención de nivel de bioseguridad 3 (BSL-3).
El estudio del tropismo específico del tipo celular y la respuesta inmune específica del tipo celular a los virus entéricos humanos ha sido históricamente un desafío debido a la falta de modelos celulares humanos primarios. Esta limitación ha sido parcialmente erradicada con el desarrollo de organoides1. En el caso del tracto gastrointestinal, se han desarrollado modelos organoides gástricos e intestinales para humanos y varias otras especies (porejemplo, murinos, bovinos, felinos, murciélagos)2,3,4,5,6. Los organoides intestinales reproducen la arquitectura estructural del epitelio intestinal humano y contienen estructuras similares a criptas y vellosidades, linajes intestinales funcionales e incluso se han utilizado para identificar linajes celulares previamente desconocidos. Se pueden utilizar dos enfoques diferentes para cultivar organoides intestinales. Primero, las células madre intestinales que contienen criptas se aíslan de resecciones tisulares o biopsias y se cultivan bajo condiciones de cultivo específicas (por ejemplo, Wnt3A, R-spondin, Noggin y EGF) para expandirse y luego diferenciar las células madre a la mayoría de los linajes de células intestinales (porejemplo, enterocitos, células de Paneth, células caliciformes, células enteroendocrinas)7. Este método permite el aislamiento de organoides de todas las secciones del tracto gastrointestinal(porejemplo, estómago, duodeno, yeyuno, íleon y colon). El segundo método se basa en células madre pluripotentes o embrionarias inducidas por humanos, que luego se diferencian en un proceso gradual en células epiteliales intestinales8. Estos organoides inducidos basados en células madre a menudo se describen como de naturaleza más embrionaria en comparación con los organoides derivados del paciente. Si bien todos estos modelos organoides han sido críticos para desentrañar las señales de desarrollo necesarias para formar el tracto intestinal, su uso en la investigación de enfermedades infecciosas aún está en su infancia.
Virus entérico es un término amplio que abarca todos los virus que infectan a través del tracto gastrointestinal, como los picornavirus(porejemplo, EV-71), los reovirus (por ejemplo, rotavirus) y los calicivirus (por ejemplo, norovirus)9. Los virus entéricos inician su ciclo de vida infeccioso a través de la ingestión de alimentos y agua contaminados, lo que deja a las personas en los países en desarrollo en alto riesgo debido a la descarga de desechos no tratados en el medio ambiente y la falta de atención médica después del inicio de la infección10. Dependiendo del tipo de patógeno, la infección puede provocar gastroenteritis, vómitos y / o diarrea acuosa debido a la fuga del revestimiento intestinal. Los norovirus humanos son un patógeno entérico altamente prevalente y altamente infeccioso, que conduce a más de 600 millones de infecciones y 15 millones de hospitalizaciones en todo el mundo11. Los organoides han sido clave para la investigación del norovirus, ya que apoyan la infección y replicación del norovirus humano, que anteriormente no podía cultivarse en modelos de cultivo celular estándar12.
En las últimas dos décadas, los coronavirus han surgido como patógenos humanos clave13. Esta familia incluye el mersma altamente patógeno, el SARS-CoV-1 y el SARS-CoV-2, que requieren estrictas contenciones de nivel de seguridad al realizar investigaciones sobre estos virus. Curiosamente, si bien estos tres patógenos son reconocidos principalmente por sus síntomas respiratorios inducidos y angustia, ahora es evidente que estos virus no solo infectan el tracto respiratorio, sino también otros órganos. Una patología importante inducida en pacientes infectados por SARS-CoV-2 además de la dificultad respiratoria es la presencia de síntomas gastrointestinales14. Una fracción de los pacientes infectados por SARS-CoV-2 muestra tales síntomas, que van desde diarrea muy leve a severa. Además, los genomas del SARS-CoV-2 se pueden detectar en biopsias de heces y del tracto gastrointestinal de pacientes infectados15. Es importante destacar que la presencia de síntomas gastrointestinales no se limita al SARS-CoV-2, ya que también se observaron en pacientes infectados por MERS y SARS-CoV-1. Para comprender cómo el SARS-CoV-2 induce malestar gastrointestinal e identificar con precisión el tropismo del SARS-CoV-2 en el tracto gastrointestinal, los organoides intestinales humanos han sido una herramienta clave y ahora se explotan para desentrañar las respuestas específicas del tipo celular a este patógeno16,17.
El perfil transcripcional de una población celular (secuenciación masiva de ARN) ha sido una práctica estándar al evaluar infecciones por patógenos tanto de líneas celulares inmortalizadas como de organoides. Si bien esto nos permite determinar los cambios globales en respuesta a los patógenos (por ejemplo, la regulación al alza de las citoquinas), RNAseq a granel no nos permite determinar por qué las células específicas de una población son más propensas a la infección que otras. La secuenciación de ARN unicelular (scRNAseq) se ha convertido en una poderosa herramienta para desentrañar los programas transcripcionales específicos del linaje celular y se puede utilizar para determinar cómo estos programas apoyan o reprimen la infección por virus18,19. La primera descripción de scRNAseq fue en 2009 y se utilizó para evaluar los perfiles de transcripción de las diferentes células encontradas en un blastómerode ratón 20. Estas tecnologías ahora se han expandido y se pueden implementar a través de varias plataformas diferentes. Las primeras versiones de esta tecnología aplicaban el clasificador celular activado por fluorescencia (FACS) para separar células individuales para su secuenciación, que a menudo se limitaba a placas de 96 o 384 pocillos, dando así 300 células individuales para analizar por muestra21. Estos métodos ahora han sido avanzados por las plataformas de secuenciación de una sola célula, que utilizan un dispositivo microfluídico para encapsular células individuales en gotas individuales con códigos de barras que contienen perlas. Esta tecnología permite capturar hasta 10.000 células por condición de muestra.
La combinación de la tecnología de organoides con scRNAseq nos permite estudiar cómo los patógenos entéricos afectan el tracto gastrointestinal de una manera específica del tipo de célula. Sin embargo, es necesario tener en cuenta varias consideraciones técnicas y de bioseguridad. En primer lugar, los métodos clásicos de cultivo de organoides (organoides tridimensionales (3D), incrustados en una matriz extracelular (ECM)) exponen el lado basolateral de las células epiteliales al exterior del organoide. A medida que los patógenos entéricos inician su infección a través de la ingestión de alimentos / agua contaminados, la infección se inicia con mayor frecuencia desde el lado apical de las células, que no es accesible en estos organoides intestinales 3D. Por lo tanto, los organoides deben estar preparados para hacer que el lado apical sea accesible para la infección por patógenos, ya sea a través de la siembra 2D, exponiendo así directamente el lado apical de las células, o a través de la microinyección22,23. En segundo lugar, para realizar scRNAseq de muestras biológicas infectadas, es importante considerar su naturaleza infecciosa. Si bien se han propuesto métodos para fijar células e inactivar patógenos antes del aislamiento de una sola célula para el RNAseq posterior, estos métodos a menudo conducen a una disminución en la calidad de la secuenciación18. El siguiente protocolo describirá varios enfoques para infectar organoides intestinales con virus entéricos considerando el lado de la infección (infección apical vs. basolateral) (Figura 1). Además, el protocolo incluirá un flujo de trabajo para disociar y aislar células individuales de organoides infectados con virus altamente patógenos para scRNAseq. El protocolo destacará los pasos clave que deben implementarse cuando se trabaja bajo condiciones de contención de nivel de bioseguridad 3 (BSL-3) para evitar la generación de aerosoles y la posible contaminación.
Los patógenos entéricos con mayor frecuencia inician su ciclo de vida infectando las células epiteliales intestinales desde su lado apical frente a la luz del intestino. Si bien los organoides son bien reconocidos como un buen modelo para reproducir la complejidad celular y la organización del epitelio intestinal, su organización como estructuras tridimensionales y cerradas hace que su membrana apical sea inaccesible para el patógeno. Este protocolo describió métodos para infectar organoides intestinales desde su lado apical, su lado basolateral o ambos con patógenos BLS-3. Estos protocolos se pueden adaptar fácilmente para estudiar cualquier patógeno entérico bajo contención de BSL-2 o BLS-3 o cualquier otro modelo organoide siguiendo algunos pasos críticos que se destacan a continuación. El método descrito anteriormente es para el aislamiento y la preparación de gotas unicelulares de acuerdo con las regulaciones en Alemania. Como descargo de responsabilidad, este protocolo no describe las medidas de manejo de bioseguridad (procedimientos operativos estándar) que deben tomarse mientras se trabaja en condiciones BSL-3. También es importante insistir en que las regulaciones pueden variar en otros países y que se debe contactar a las autoridades locales para asegurarse de que se respeten todas las regulaciones locales.
Uno de los pasos críticos en la siembra de organoides en dos dimensiones para la infección apical es controlar que las células se diferencien de manera similar en comparación con cuando se cultivan como organoides tridimensionales clásicos. Dependiendo del patógeno entérico, el tropismo podría restringirse a células muy raras o a células que necesitan ser altamente diferenciadas. En este caso, el uso de un organoide bidimensional que no se diferenció completamente podría resultar en la conclusión errónea de que este patógeno entérico no puede infectar los organoides intestinales. Se sugiere, si es posible, realizar infecciones utilizando las tres configuraciones de este protocolo: organoide 2D solo para infección apical (sección 2), organoides 3D abiertos para infección apical y basolateral (sección 3) y organoides 3D completos solo para infección basolateral (sección 3). Este enfoque ayudará a discernir la ruta de entrada del patógeno (apical vs. basolateral) y también controlará que se haya logrado un nivel similar de diferenciación. Una alternativa para la infección apical 2D es la microinyección, que utilizará un organoide 3D pero entregará el patógeno directamente en el lado apical (ver Bartfeld et al.27 para más detalles). Este método requiere un inyector experto para garantizar que el patógeno se coloque correctamente y que los organoides permanezcan intactos. La microinyección se usa comúnmente en la contención de BSL-2 y puede no ser adecuada para la contención de BSL-3.
Una consideración importante adicional al realizar experimentos de infección en organoides sembrados en 2D es la densidad celular final. Como se mencionó en el paso 2.3, se sembrarán 100-150 organoides en un pozo de una placa de 48 pocillos o un pozo de un tobogán de cámara de fondo de vidrio de 8 pocillos. Dependiendo de la línea organoide y de la persona que maneja los organoides, el tamaño de estos organoides puede ser significativamente diferente. Esto podría resultar en densidades celulares muy diferentes en la placa de 48 pocillos o en el tobogán de la cámara de fondo de vidrio de 8 pocillos. Dependiendo del virus entérico, algunos virus prefieren células más escasas, mientras que otros también podrán infectar células confluentes. El origen molecular de tales diferencias en la infectividad para diferentes confluencias celulares no está claro; por lo tanto, los experimentos piloto destinados a encontrar la mejor densidad celular para el patógeno entérico de elección deben realizarse antes de realizar una mayor caracterización aguas abajo.
A menudo, la clasificación FACS se realiza antes de realizar la emulsión de gotas de una sola célula. Este paso se utiliza a menudo para separar las células muertas de las células vivas y las células individuales de los dobletes. Cuando se trabaja con patógenos BSL-3, se requiere que la instalación esté equipada con un clasificador FACS apropiado, lo que no suele ser el caso. Además, no todas las células de un organoide tienen el mismo tamaño, y a menudo es difícil discriminar entre un doblete o una célula más grande, lo que causa un riesgo de selección negativa contra un tipo de célula específico. Además, todavía hay discusión en el campo sobre si el tiempo necesario para clasificar entre 5.000-10.000 para cada muestra podría resultar en una modificación significativa del perfil de transcripción de las células individuales. Si bien se han descrito métodos de fijación celular compatibles con la secuenciación unicelular (por ejemplo, metanol y RNAassist), se observó que esto conduce a una disminución en la calidad de la secuenciación18. Finalmente, se sospecha que la clasificación de células utilizando marcadores de muerte celular también puede conducir a un sesgo. Dada la proliferación direccional y la diferenciación de las células a través del eje cripta-vellosidad, las células más diferenciadas, que van a ser desprendidas y liberadas, se encuentran en la punta de las vellosidades. Estas células a menudo son positivas para diferentes marcadores de vías de muerte celular (porejemplo, apoptosis, necrosis y necroptosis); sin embargo, cuando se observa la infección por rotavirus del intestino del ratón, la punta de las vellosidades es el área más infectada28. Por lo tanto, filtrar las células que pueden parecer positivas para los marcadores de muerte resultaría en una selección negativa de las células infectadas que pueden representar la infección fisiológica. Actualmente, no existe una buena solución para clasificar y fijar organoides antes de la secuenciación de una sola célula. Se recomienda el uso de células vivas y sin clasificar, ya que se necesitan más estudios para encontrar protocolos alternativos adecuados.
La secuenciación de una sola célula ha revolucionado la forma en que se pueden evaluar las respuestas celulares. Esta técnica permite la identificación de respuestas específicas del linaje celular tanto en condiciones basales como bajo infecciones por patógenos. Este método ha abierto puertas en muchos campos que antes estaban limitados por lecturas masivas. Si bien este método es muy poderoso, tiene sus limitaciones. Una limitación clave es el extenso análisis bioinformático que se requiere aguas abajo de la secuenciación. Esto es especialmente clave cuando se analizan tejidos y se asignan tipos de células donde actualmente no hay anotación. Se requiere tener un bioinformático capacitado para apoyar todos los estudios de una sola célula.
Este protocolo describe cómo sembrar y manejar organoides intestinales humanos, infectarlos con patógenos entéricos y realizar scRNAseq. Ahora es posible adaptar este enfoque a otros órganos, ya que se han desarrollado sistemas modelo de organoides para la mayoría de los órganos. Los organoides pulmonares e hepáticos están organizados de manera similar en comparación con los organoides intestinales, y como tales, utilizando un enfoque análogo podrían transponerse a estos organoides. El control crítico será validar que cuando se cultivan en dos dimensiones o se abren, estos organoides logran una diferenciación similar a la de sus contrapartes organoides 3D. Las características específicas y los genes que definen un estado diferenciado son específicos para cada modelo de órgano. Otros modelos de organoides, como los organoides renales y vasculares, grandes estructuras densas, necesitarán métodos adicionales para disociar en serie estas estructuras en células individuales.
The authors have nothing to disclose.
Megan Stanifer y Steeve Boulant fueron apoyadas por becas de investigación de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): (Proyecto número 240245660, 278001972, 415089553 y 272983813 a Steeve Boulant y 416072091 a Megan Stanifer), el estado de Baden-Wuerttemberg y el Bundesministerium für Bildung und Forschung BMBF 01KI20239B a MS y 01KI20198A y (NUM-COVID 19, Organo-Strat 01KX2021) a SB. Los esquemas se crearon en BioRender.
Recombinant mouse noggin | Peprotech | Cat#250-38 | |
[Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | Cat# G9145 | |
0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fischer Scientific | Cat#25300054 | |
24-well non-cell culture treated plate | Corning | Cat#3738 | |
8-well glass bottom chamber slide | iBIDI | Cart#80827 | |
A83-01 | Tocris | Cat#2939 | |
Advanced DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat# 12634010 | |
B27 | Thermo Fischer Scientific | Cat#17504-044 | |
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | Cat#1000202 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit | 10X Genomics | Cat #1000127 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
Chromium Next GEM Single Cell 3′ Kit v3.1 | 10X Genomics | Cat#1000268 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
Collagen from human placenta | Sigma Aldrich | Cat#C5533-5MG | |
CYP34A forward | Eurofins | GATGGCTCTCATCCCAGACTT | Primers used to check for differentiation |
CYP3A4 reverse | Eurofins | AGTCCATGTGAATGGGTTCC | Primers used to check for differentiation |
DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat#11320074 | |
EDTA | Sigma Aldrich | Car#E9884 | |
Fast Read 102 counting slides | Biosigma | Cat# BVS100 | |
Fetal Bovein Serum (FBS) | Capricorn | Cat#FBS-12A | |
GlutaMAX | Thermo Fischer Scientific | Cat# 35050061 | |
HEPES | Thermo Fischer Scientific | Cat3 15630080 | |
L-WRN cells | ATCC | CRL-3276 | This cell line is used to make the conditioned media containg Wnt 3A, R-Spondin and Noggin. The protocol for the production of the conditioned media can be found on the manufacterures site. |
MatriGel. GFR, LDEV free | Corning | Cat#354230 | |
MUC-2 forward | Eurofins | TGTAGGCATCGCTCTTCTCA | Primers used to check for differentiation |
MUC-2 reverse | Eurofins | GACACCATCTACCTCACCCG | Primers used to check for differentiation |
N-acetyl-cysteine | Sigma Aldrich | Cat# A9165 | |
OLMF4 forward | Eurofins | ACCTTTCCCGTGGACAGAGT | Primers used to check for differentiation |
OLMF4 reverse | Eurofins | TGGACATATTCCCTCACTTTGGA | Primers used to check for differentiation |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fischer Scientific | Cat#15140122 | |
Recombinant human FGF basic | Peprotech | Cat#100-18B | |
Recombinant human IGF-1 | BioLegend | Cat#590904 | |
Recombinant mouse EGF | Thermo Fischer Scientific | Cat# PMG8043 | |
SI forward | Eurofins | AATCCTTTTGGCATCCAGATT | Primers used to check for differentiation |
SI reverse | Eurofins | GCAGCCAAGAATCCCAAT | Primers used to check for differentiation |
TrypLE Express | Thermo Fischer Scientific | Cat#12605036 | |
Y-27632 | Caymann Chemicals | Cat#10005583 |