Bu protokol, tek hücreli RNA dizileme (scRNAseq) teknolojisini kullanarak tek hücreli düzeyde konakçı/patojen etkileşimlerini karakterize etmek için insan bağırsak organoidlerinin apikal veya bazolateral tarafından nasıl enfekte olduğunu açıklar.
İnsan bağırsak organoidleri gastrointestinal sistemin patojen enfeksiyonlarını incelemek için en iyi hücresel modeli oluşturur. Bu organoidler GI sisteminin tüm bölümlerinden (mide, jejunum, duodenum, ileum, kolon, rektum) türetilebilir ve farklılaşma üzerine her bir bölümde doğal olarak bulunan hücre tiplerinin çoğunu içerir. Örneğin, bağırsak organoidleri besin emici enterositler, salgı hücreleri (Goblet, Paneth ve enteroendokrin), kök hücrelerin yanı sıra tüm soylara özgü farklılaşma aralarını (örneğin, erken veya olgunlaşmamış hücre tipleri) içerir. Bulaşıcı hastalıkları incelemek için gastrointestinal sistem kaynaklı organoidlerin kullanılmasındaki en büyük avantaj, enterik patojen tarafından hangi hücre tipinin hedeflendiğini tam olarak belirleme ve gastrointestinal sistemin farklı bölümlerinin ve spesifik hücre tiplerinin patojen zorluklarına benzer şekilde yanıt verip vermediğini ele alma olasılığıdır. Son yıllarda, gastrointestinal modellerin yanı sıra diğer dokulardan organoidler, viral tromizm ve patogenez mekanizmalarını incelemek için bunların yanı sıra bunların yanı sıra 2015’ten beri 2008’de 100’den fazla kişi kullanıldı. Bununla birlikte, son derece patojenik virüsler kullanırken organoid kullanmanın tüm avantajlarından yararlanmak teknik bir zorluğu temsil eder ve sıkı biyogüvenlik hususları gerektirir. Ek olarak, organoidler genellikle üç boyutta yetiştirildiği için, hücrelerin bazolateral tarafı organoidin dışına, apikal tarafı ise organoidlerin iç kısmına (lümen) bakmaktadır. Bu organizasyon, birçok enterik enfeksiyonun yutulması takiben hücrelerin apikal/aydınlık tarafından başlaması nedeniyle enterik patojenler için bir zorluk teşkil eder. Aşağıdaki makale, hücre tipine özgü konakçı/patojen etkileşimlerini karakterize etmek için tek hücreli RNA dizilimini gerçekleştirmek için enfeksiyon tarafını (apikal vs. bazolateral) göz önünde bulundurarak insan bağırsak organoidlerini enterik patojenlerle enfeksiyona hazırlamak için kapsamlı bir protokol sağlayacaktır. Bu yöntem, organoidlerin hazırlanmasının yanı sıra biyogüvenlik düzeyi 3 (BSL-3) muhafaza koşulları altında bu işi gerçekleştirmek için gereken hususları detaylandırıyor.
hücre tipine özgü tromizm ve insan enterik virüslerine karşı hücre tipine özgü immün yanıtın incelenmesi, birincil insan hücresel modellerinin eksikliği nedeniyle tarihsel olarak zor olmuştur. Bu sınırlama şimdi organoidlerin gelişimi ile kısmen ortadan kaldırılmıştır1. Gastrointestinal sistem durumunda, insanlar ve diğer birkaç tür (örneğin,murine, sığır, kedi, yarasa) 2 , 3,4,5,6için mide ve bağırsak organoid modelleri geliştirilmiştir. Bağırsak organoidleri insan bağırsak epitelinin yapısal mimarisini yeniden üretir ve mahzen ve villi benzeri yapılar, fonksiyonel bağırsak soyları içerir ve hatta daha önce bilinmeyen hücre soylarını tanımlamak için kullanılmıştır. Bağırsak organoidlerini büyütmek için iki farklı yaklaşım kullanılabilir. İlk olarak, mahzen içeren bağırsak sapları hücreleri doku reeksiyonlarından veya biyopsilerden izole edilir ve genişlemek için belirli kültür koşulları altında (örneğin, Wnt3A, R-spondin, Noggin ve EGF) yetiştirilir ve daha sonra kök hücreleri çoğu bağırsak hücresi soyuna(örneğin, enterositler, Paneth hücreleri, Goblet hücreleri, enteroendokrin hücreler) ayırt eder7. Bu yöntem, organoidlerin gastrointestinal sistemin tüm bölümlerinden (örneğin, mide, duodenum, jejunum, ileum ve kolon) izolasyonusağlar. İkinci yöntem, daha sonra adım adım bir işlemde bağırsak epitel hücrelerine farklılaştırılan insan kaynaklı pluripotent veya embriyonik kök hücrelere dayanır8. Bu indüklenen kök hücre bazlı organoidler genellikle hasta kaynaklı organoidlere kıyasla doğada daha embriyonik olarak tanımlanır. Tüm bu organoid modeller bağırsak sistemini oluşturmak için gereken gelişimsel ipuçlarını çözmek için kritik öneme sahip olsa da, bulaşıcı hastalık araştırmalarında kullanımları henüz emekleme aşamasındadır.
Enterik virüs, pikornavirüsler(örneğin,EV-71), reovirüsler (örneğin rotavirüs) ve calicivirüsler (örneğin, norovirüs)9gibi gastrointestinal sistem yoluyla enfekte olan tüm virüsleri kapsayan geniş bir terimdir. Enterik virüsler, bulaşıcı yaşam döngülerini kontamine gıda ve suyun yutulması yoluyla başlatır, bu da gelişmekte olan ülkelerdeki insanları, arıtılmamış atıkların çevreye boşaltılması ve enfeksiyonun başlangıcından sonra tıbbi bakım eksikliği nedeniyle yüksek risk altında bırakır10. Patojenin türüne bağlı olarak, enfeksiyon bağırsak astarının sızması nedeniyle gastroenterit, kusma ve / veya sulu ishale yol açabilir. İnsan norovirüsleri,dünyaçapında 600 milyondan fazla enfeksiyona ve 15 milyon hastaneye yatmaya yol açan son derece yaygın ve son derece bulaşıcı bir enterik patojendir. Organoidler, daha önce standart hücre kültürü modellerinde kültürlenemeyen insan norovirüslerinin enfeksiyonunu ve replikasyonunu destekledikleri için norovirüs araştırmalarının anahtarı olmuştur12.
Son yirmi yılda, koronavirüsler önemli insan patojenleri olarak ortaya çıktı13. Bu aile, bu virüsler üzerinde araştırma yaparken sıkı güvenlik seviyesi muhafazaları gerektiren son derece patojenik MERS, SARS-CoV-1 ve SARS-CoV-2’yi içerir. İlginçtir ki, bu patojenlerin üçü de çoğunlukla indüklenmiş solunum semptomları ve sıkıntıları ile tanınırken, bu virüslerin sadece solunum yollarını değil, diğer organları da enfekte ettiği açıktır. SARS-CoV-2 enfekte hastalarda solunum sıkıntısının yanı sıra indüklenen önemli bir patoloji gastrointestinal semptomların varlığıdır14. SARS-CoV-2 enfekte hastaların bir kısmı, çok hafif ila şiddetli ishal arasında değişen bu tür semptomlar gösterir. Ayrıca enfekte hastaların dışkı ve gastrointestinal sistem biyopsilerinde SARS-CoV-2 genomları saptanabilir15. Daha da önemlisi, gastrointestinal semptomların varlığı, MERS ve SARS-CoV-1 enfekte hastalarda da gözlendiği gibi SARS-CoV-2 ile sınırlı değildir. SARS-CoV-2’nin gastrointestinal sıkıntıya nasıl yol açtığını ve gastrointestinal sistemde SARS-CoV-2’nin tropizmini tam olarak tanımlamak için, insan bağırsak organoidleri önemli bir araç olmuştur ve şimdi bu patojene hücre tipine özgü yanıtları çözmek için16,17.
Bir hücre popülasyonunun transkripsiyonel profillemesi (toplu RNA dizilimi), hem ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarının hem de organoidlerin patojen enfeksiyonlarını değerlendirirken standart bir uygulama olmuştur. Bu, patojenlere yanıt olarak küresel değişiklikleri belirlememize izin verirken (örneğin, sitokinlerin yukarıgülasyonu), toplu RNAseq, bir popülasyondaki belirli hücrelerin neden diğerlerinden daha fazla enfeksiyona eğilimli olduğunu belirlememize izin vermez. Tek hücreli RNA dizilimi (scRNAseq), hücre soyuna özgü transkripsiyonel programları çözmek için güçlü bir araç haline gelmiştir ve bu programların virüs enfeksiyonunu nasıl desteklediğini veya bastırdığını belirlemek için kullanılabilir18,19. scRNAseq’in ilk açıklaması 2009 yılındaydı ve bir fare blastomere20’debulunan farklı hücrelerin transkripsiyon profillerini değerlendirmek için kullanıldı. Bu teknolojiler artık genişletildi ve birkaç farklı platform üzerinden uygulanabilir. Bu teknolojinin ilk sürümleri, genellikle 96 veya 384 kuyu plakalarıyla sınırlı olan sıralama için tek tek hücreleri ayırmak için floresanla aktive edilmiş hücre sıralayıcısı (FACS) uyguladı, böylece örnek başına analiz etmek için 300 bireysel hücre verdi21. Bu yöntemler artık tek hücreli dizileme platformları tarafından gelişmiştir, bu platformlar tek hücreleri boncuk içeren barkodlu tek damlacıklara kapsüllemek için mikroakışkan bir cihaz kullanmaktadır. Bu teknoloji, örnek durum başına 10.000’e kadar hücrenin yakalanmasını sağlar.
Organoid teknolojisini scRNAseq ile birleştirmek, enterik patojenlerin gastrointestinal sistemi hücre tipine özgü bir şekilde nasıl etkilediğini incelememizi sağlar. Bununla birlikte, çeşitli teknik ve biyogüvenlik hususlarına dikkat edilmelidir. Her şeyden önce, klasik organoid kültür yöntemleri (hücre dışı matrise (ECM) gömülü 3 boyutlu (3D) organoidler, epitel hücrelerinin bazolateral tarafını organoidin dışına maruz bırakır. Enterik patojenler enfeksiyonlarını kontamine gıda / suyun yutulması yoluyla başlattıkça, enfeksiyon en sık bu 3D bağırsak organoidlerinde erişilemeyen hücrelerin apikal tarafından başlar. Bu nedenle, organoidlerin apikal tarafı patojen enfeksiyonu için erişilebilir hale getirmek için hazırlanması gerekir ya 2D tohumlama yoluyla, böylece hücrelerin apikal tarafını doğrudan açığa çıkarmak veya mikroenjeksiyonyoluyla 22,23. İkincisi, enfekte biyolojik örneklerin scRNAseq’ini gerçekleştirmek için, bulaşıcı doğalarını göz önünde bulundurmak önemlidir. Sonraki RNAseq için tek hücreli izolasyondan önce hücreleri düzeltmek ve patojenleri inaktive etmek için yöntemler önerilmiş olsa da, bu yöntemler genellikle sıralama kalitesinde bir düşüşe yol açar18. Aşağıdaki protokol, enfeksiyon tarafını (apikal ve bazolateral enfeksiyon) göz önünde bulundurarak bağırsak organoidlerini enterik virüslerle enfekte etmek için çeşitli yaklaşımları açıklayacaktır (Şekil 1). Ayrıca, protokol, scRNAseq için yüksek patojenik virüslerle enfekte olmuş organoidlerden tek hücreleri ayrıştırmak ve izole etmek için bir iş akışı içerecektir. Protokol, aerosollerin ve potansiyel kontaminasyonun üretilmesini önlemek için biyogüvenlik seviye-3 (BSL-3) muhafaza koşulları altında çalışırken uygulanması gereken temel adımları vurgulayacaktır.
Enterik patojenler en sık bağırsak epitel hücrelerini apikal tarafından bağırsak lümenine bakacak şekilde enfekte ederek yaşam döngülerini başlatırlar. Organoidler, bağırsak epitelinin hücresel karmaşıklığını ve organizasyonunu yeniden üretmek için iyi bir model olarak kabul edilirken, üç boyutlu, kapalı yapılar olarak organizasyonları apikal zarlarını patojene erişilemez hale getirir. Bu protokol, bağırsak organoidlerini apikal yanlarından, bazolateral taraflarından veya her ikisinden de BLS-3 patojenleriyle enfekte etme yöntemlerini tanımladı. Bu protokoller, aşağıda vurgulanan birkaç kritik adımı izleyerek BSL-2 veya BLS-3 muhafazası veya başka bir organoid modeli altında herhangi bir enterik patojeni incelemek için kolayca uyarlanabilir. Yukarıda açıklanan yöntem, Almanya’daki düzenlemelere uygun olarak tek hücreli damlacıkların izolasyonu ve hazırlanması içindir. Bir feragatname olarak, bu protokol BSL-3 koşulları altında çalışırken alınması gereken biyogüvenlik işleme önlemlerini (standart işletim prosedürleri) açıklamaz. Düzenlemelerin diğer ülkelerde de değişebileceği ve tüm yerel düzenlemelere uyulacağından emin olmak için yerel makamlarla irtibata geçilmesi gerektiği konusunda ısrar etmek de önemlidir.
Apikal enfeksiyon için organoidlerin iki boyutlu tohumlamada kritik adımlardan biri, hücrelerin klasik üç boyutlu organoidler olarak yetiştirildiğinde benzer şekilde farklılaşacağını kontrol etmektir. Enterik patojene bağlı olarak, tromizm çok nadir hücrelerle veya çok farklılaşması gereken hücrelerle sınırlandırılabilir. Bu durumda, tam olarak ayırt edilemeyen iki boyutlu bir organoid kullanmak, bu enterik patojenin bağırsak organoidlerini enfekte edemeyeceği konusunda yanlış birlgıya neden olabilir. Mümkünse, bu protokolün üç konfigürasyonunu kullanarak enfeksiyonların gerçekleştirilmesi önerilir: sadece apikal enfeksiyon için 2D organoid (bölüm 2), apikal ve bazolateral enfeksiyon için çatlak açık 3D organoidler (bölüm 3) ve sadece bazolateral enfeksiyon için tam 3D organoidler (bölüm 3). Bu yaklaşım, patojenin giriş yolunun (apikal ve bazolateral) ayırt edilmesine yardımcı olacak ve aynı zamanda benzer bir farklılaşma seviyesine ulaşıldığını kontrol edecektir. 2D apikal enfeksiyon için bir alternatif, 3D organoid kullanacak ancak patojeni doğrudan apikal tarafa ulaştıracak mikroenjeksiyondur (ayrıntılar için Bartfeld ve ark.27’ye bakın). Bu yöntem, patojenin düzgün yerleştirildiğından ve organoidlerin bozulmadan kaldığından emin olmak için yetenekli bir enjektör gerektirir. Mikroenjeksiyon genellikle BSL-2 muhafazasında kullanılır ve BSL-3 muhafazası için uygun olmayabilir.
2D tohumlu organoidlerde enfeksiyon deneyleri yapılırken ek bir önemli husus son hücre yoğunluğudur. Adım 2.3’te belirtildiği gibi, 100-150 organoid 48 kuyulu bir plakanın bir kuyusunda veya 8 kuyulu bir cam tabanlı hazne kaydırağından bir kuyuda tohumlanacaktır. Organoid çizgisine ve organoidleri işleyen kişiye bağlı olarak, bu organoidlerin büyüklüğü önemli ölçüde farklı olabilir. Bu, 48 kuyu plakasında veya 8 kuyulu cam tabanlı hazne kaydırasında çok farklı hücre yoğunluklarına neden olabilir. Enterik virüse bağlı olarak, bazı virüsler daha seyrek hücreleri tercih ederken, diğerleri de birleştiği hücreleri enfekte edebilecektir. Farklı hücre izdihamları için enfeksiyozitedeki bu tür farklılıkların moleküler kökeni açık değildir; bu nedenle, daha fazla aşağı akış karakterizasyonu gerçekleştirmeden önce, tercih edilen enterik patojen için en iyi hücre yoğunluğunu bulmayı amaçlayan pilot deneyler yapılmalıdır.
Genellikle FACS sıralama, tek hücreli damlacık emülsiyonunu gerçekleştirmeden önce gerçekleştirilir. Bu adım genellikle ölüleri canlı hücrelerden ve tek hücreleri çiftlerden ayırmak için kullanılır. BSL-3 patojenleri ile çalışırken, tesisin uygun bir FACS sıralayıcısı ile donatılmayı gerektirir, bu genellikle böyle değildir. Ayrıca, bir organoiddeki tüm hücreler aynı boyuta sahip değildir ve genellikle bir çift veya daha büyük bir hücre arasında ayrım yapmak zordur, böylece belirli bir hücre tipine karşı olumsuz seçim yapma riskine neden olur. Ayrıca, her örnek için 5.000-10.000 arasında sıralama için gereken sürenin tek tek hücrelerin transkript profilinin önemli bir şekilde değiştirilmesine neden olup olmayacağı hala tartışlanmaktadır. Tek hücreli dizileme ile uyumlu hücre sabitleme yöntemleri (örneğin, metanol ve RNAassist) açıklanmış olsa da, bunun sıralama kalitesinde bir düşüşe yol açtığı gözlenmiştir18. Son olarak, hücre ölüm işaretleyicileri kullanarak hücreleri sıralamanın da bir önyargıya yol açabileceği şüphelidir. Hücrelerin şifreli villi ekseninden yönlü çoğalması ve farklılaşması göz önüne alındığında, dökülecek ve serbest bırakılacak olan en farklılaştırılmış hücreler villinin ucunda bulunur. Bu hücreler genellikle hücre ölüm yollarının farklı belirteçleri için pozitiftir(örneğin, apoptoz, nekroz ve nekroptoz); bununla birlikte, fare bağırsağının rotavirüs enfeksiyonuna bakıldığında, villinin ucu en enfekte bölgedir28. Bu nedenle, ölüm belirteçleri için pozitif görünebilecek hücreleri filtrelemek, fizyolojik enfeksiyonu temsil edebilecek enfekte hücrelerin olumsuz bir şekilde seçilmesine neden olacaktır. Şu anda, tek hücreli sıralamadan önce organoidleri sıralamak ve sabitlemek için iyi bir çözüm yoktur. Uygun alternatif protokolleri bulmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç duyulduğu için canlı, sıralanmamış hücrelerin kullanılması önerilir.
Tek hücreli sıralama, hücresel yanıtların nasıl değerlendirilebileceği konusunda devrim yaratmamıştır. Bu teknik, hem bazal koşullarda hem de patojen enfeksiyonları altında hücre soyuna özgü yanıtların tanımlanmasını sağlar. Bu yöntem, daha önce toplu okumalarla sınırlı olan birçok alanda kapılar açmıştır. Bu yöntem çok güçlü olsa da, sınırlamaları vardır. Önemli bir sınırlama, sıralamanın aşağı akışı için gerekli olan kapsamlı biyoinformatik analizdir. Bu, özellikle dokuları analiz ederken ve şu anda ek açıklamanın olmadığı hücre tiplerini atarken anahtardır. Yetenekli bir biyoinformatikçiye sahip olmak, tüm tek hücreli çalışmaları desteklemek için gereklidir.
Bu protokol, insan bağırsak organoidlerinin nasıl tohumlanıp ele alınacağını, enterik patojenlerle nasıl enfekte olunabileceğini ve scRNAseq’in nasıl gerçekleştirildiğini açıklar. Organoid model sistemleri çoğu organ için geliştirildiği için bu yaklaşımın diğer organlara uyarlanabilir olması artık mümkündür. Akciğer ve karaciğer organoidleri bağırsak organoidlerine göre benzer şekilde organize edilir ve bu nedenle benzer bir yaklaşım kullanılarak bu organoidlere aktarılabilir. Kritik kontrol, iki boyutta yetiştirildiğinde veya açık çatladığında, bu organoidlerin 3D organoid meslektaşlarıyla benzer farklılaşma elde ettiğini doğrulamak olacaktır. Farklılaştırılmış bir durumu tanımlayan spesifik özellikler ve genler her organ modeli için özeldir. Böbrek ve damar organoidleri, büyük yoğun yapılar gibi diğer organoid modelleri, bu yapıları seri olarak tek hücrelere ayrıştırmak için ek yöntemlere ihtiyaç duyacaktır.
The authors have nothing to disclose.
Megan Stanifer ve Steeve Boulant, Deutsche Forschungsgemeinschaft’ın (DFG) araştırma hibeleriyle desteklendi: (Proje numarası 240245660, 278001972, 415089553 ve Steeve Boulant’a 272983813 ve Megan Stanifer’e 416072091), Baden-Wuerttemberg eyaleti ve Bundesministerium für Bildung und Forschung BMBF 01KI20239B’den MS ve 01KI20198A’ya ve (NUM-COVID 19, Organo-Strat 01KX2021) için SB. Şemalar BioRender oluşturuldu.
Recombinant mouse noggin | Peprotech | Cat#250-38 | |
[Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | Cat# G9145 | |
0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fischer Scientific | Cat#25300054 | |
24-well non-cell culture treated plate | Corning | Cat#3738 | |
8-well glass bottom chamber slide | iBIDI | Cart#80827 | |
A83-01 | Tocris | Cat#2939 | |
Advanced DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat# 12634010 | |
B27 | Thermo Fischer Scientific | Cat#17504-044 | |
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | Cat#1000202 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit | 10X Genomics | Cat #1000127 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
Chromium Next GEM Single Cell 3′ Kit v3.1 | 10X Genomics | Cat#1000268 | Used in the preparation of single cell solution and preparation of Gel beads-in-emulsion (GEM) |
Collagen from human placenta | Sigma Aldrich | Cat#C5533-5MG | |
CYP34A forward | Eurofins | GATGGCTCTCATCCCAGACTT | Primers used to check for differentiation |
CYP3A4 reverse | Eurofins | AGTCCATGTGAATGGGTTCC | Primers used to check for differentiation |
DMEM/F12 | Thermo Fischer Scientific | Cat#11320074 | |
EDTA | Sigma Aldrich | Car#E9884 | |
Fast Read 102 counting slides | Biosigma | Cat# BVS100 | |
Fetal Bovein Serum (FBS) | Capricorn | Cat#FBS-12A | |
GlutaMAX | Thermo Fischer Scientific | Cat# 35050061 | |
HEPES | Thermo Fischer Scientific | Cat3 15630080 | |
L-WRN cells | ATCC | CRL-3276 | This cell line is used to make the conditioned media containg Wnt 3A, R-Spondin and Noggin. The protocol for the production of the conditioned media can be found on the manufacterures site. |
MatriGel. GFR, LDEV free | Corning | Cat#354230 | |
MUC-2 forward | Eurofins | TGTAGGCATCGCTCTTCTCA | Primers used to check for differentiation |
MUC-2 reverse | Eurofins | GACACCATCTACCTCACCCG | Primers used to check for differentiation |
N-acetyl-cysteine | Sigma Aldrich | Cat# A9165 | |
OLMF4 forward | Eurofins | ACCTTTCCCGTGGACAGAGT | Primers used to check for differentiation |
OLMF4 reverse | Eurofins | TGGACATATTCCCTCACTTTGGA | Primers used to check for differentiation |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fischer Scientific | Cat#15140122 | |
Recombinant human FGF basic | Peprotech | Cat#100-18B | |
Recombinant human IGF-1 | BioLegend | Cat#590904 | |
Recombinant mouse EGF | Thermo Fischer Scientific | Cat# PMG8043 | |
SI forward | Eurofins | AATCCTTTTGGCATCCAGATT | Primers used to check for differentiation |
SI reverse | Eurofins | GCAGCCAAGAATCCCAAT | Primers used to check for differentiation |
TrypLE Express | Thermo Fischer Scientific | Cat#12605036 | |
Y-27632 | Caymann Chemicals | Cat#10005583 |