Summary
Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) is een krachtig hulpmiddel om de rol van het 18 kDa translocator eiwit of serotonine 5HT2A-receptorexpressie bij de ziekte van Alzheimer op cellulaire schaal te bestuderen. Dit protocol beschrijft de ex-vivo toepassing van FACS-RTT in het TgF344-AD rat model.
Abstract
Gliacellen hebben waarschijnlijk een aanzienlijke implicatie in de pathofysiologie van neurodegeneratieve aandoeningen, zoals de ziekte van Alzheimer (AD). Hun veranderingen worden misschien geassocieerd met een pro-inflammatoire toestand. De TgF344-AD rattenstam is ontworpen om menselijke APP- en menselijke PS1ΔE9-genen tot expressie te brengen, coderend voor amyloïde eiwitten Aβ-40 en Aβ-42 en vertoont amyloïde pathologie en cognitieve tekorten bij veroudering. Het TgF344-AD rattenmodel wordt in deze studie gebruikt om de cellulaire oorsprong van de 18 kDa translocator eiwit (TSPO, een marker van gliacelactivatie) binding en de 5HT2A-receptor (5HT2AR) serotonine receptor niveaus die mogelijk verstoord zijn in AD te evalueren. De hier gepresenteerde techniek is Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT), een kwantitatieve celtype-specifieke techniek die complementair is aan in vivo PET of SPECT of ex vivo/in vitro autoradiografietechnieken. Het kwantificeert dezelfde radioactief gelabelde tracer die eerder werd gebruikt voor beeldvorming, met behulp van een γ teller na cytometriecelsortering. Dit maakt het mogelijk om de cellulaire oorsprong van het radioactief gelabelde eiwit met hoge cellulaire specificiteit en gevoeligheid te bepalen. Studies met FACS-RTT toonden bijvoorbeeld aan dat (i) de toename van TSPO-binding geassocieerd was met microglia in een rattenmodel van lipopolysaccharide (LPS)-geïnduceerde neuro-inflammatie, (ii) een toename van TSPO-binding na 12 en 18 maanden eerst geassocieerd was met astrocyten en vervolgens microglia in de TgF344-AD-ratten in vergelijking met wildtype (WT) ratten, en (iii) de striatale dichtheid van 5HT2A R neemt af in astrocyten na 18 maanden in hetzelfde rat AD-model. Interessant is dat deze techniek kan worden uitgebreid naar vrijwel alle radiotracers.
Introduction
Neurodegeneratieve ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer (AD), worden gekenmerkt door een neuronaal verlies geassocieerd met verhoogde symptomen. AD, de meest voorkomende oorzaak van dementie, goed voor 60% -70% van de gevallen, treft ongeveer 50 miljoen mensen wereldwijd1. Op neuropathologisch niveau zijn de twee belangrijkste kenmerken van AD de accumulatie van extracellulaire amyloïde-β (Aβ) plaques en intracellulaire Tau neurofibrillaire klitten. Gliacelveranderingen zijn ook in verband gebracht met AD2 en mogelijke verstoring van verschillende neurotransmittersystemen 3,4.
De TgF344-AD rattenlijn is aangepast naar model AD door menselijke APP- en PS1ΔE9-transgenen tot expressie te brengen, wat leidt tot oplosbare en onoplosbare Aβ-40- en Aβ-42-expressie en amyloïde plaquevorming5. Het presenteert ook de accumulatie van hyperfosforyleerde vormen van het Tau-eiwit die leiden tot tauopathie. Vanaf de leeftijd van 9-24 maanden ontwikkelen de ratten geleidelijk de pathologische kenmerken van AD en een cognitieve stoornis 5,6,7,8,9.
Positron Emission Tomography (PET), Single-Photon Emission computed Tomography (SPECT) en autoradiografie zijn technieken gebaseerd op de emissie en kwantificering van γ stralen. Radiotracers worden gekwantificeerd in vivo (PET en SPECT) of ex vivo/in vitro (autoradiografie). Die gevoelige technieken hebben bijgedragen aan het begrijpen van mechanismen van verschillende hersenziekten, zoals AD. Inderdaad, in termen van neuro-inflammatie zijn er veel studies die 18 kDa Translocator Protein (TSPO), een in vivo neuro-inflammatiemarker, beoordelen met radioactief gelabelde tracers zoals [11C] - (R) - PK11195 of [11C] PBR28 (voor beoordeling zie10). Bovendien zijn veranderingen van neurotransmittersystemen bestudeerd met behulp van radiotracers 11,12,13.
Die technieken bepalen echter niet de cellulaire oorsprong van het radioactieve signaal. Dit zou de interpretatie van de biologische onderbouwing van de verandering in de binding van een radioligand in PET/SPECT kunnen belemmeren. In het geval van TSPO-studies naar neuro-inflammatie is het bijvoorbeeld van het grootste belang om te begrijpen of de toename of afname van TSPO te wijten is aan astrocytische of microgliale veranderingen. De Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) techniek werd ontwikkeld om deze problemen te omzeilen, waardoor de beoordeling van radioligandbinding in elk celtype afzonderlijk en de kwantificering van de doeleiwitdichtheid per cel mogelijk is. Deze innovatieve techniek is bijgevolg complementair en zeer compatibel met PET- en SPECT-beeldvorming.
Hier werd deze techniek toegepast langs twee assen: de studie van neuro-inflammatie met behulp van TSPO-specifieke radioliganden en het beoordelen van het serotonerge systeem. Op de eerste as was het doel om de cellulaire oorsprong van het TSPO-signaal te begrijpen als reactie op een acute ontstekingsreactie. Daarom werd FACS-RTT gebruikt op de hersenweefsels van ratten na de inductie van neuro-inflammatie via een lipopolysaccharide (LPS) injectie en na een in vivo [125I] CLINDE SPECT beeldvormingsstudie. Verder werden dezelfde beeldvorming en hetzelfde FACS-RTT-protocol toegepast op 12- en 24 maanden oude TgF344-AD-ratten en bijpassende wild-type (WT) ratten. De tweede as was gericht op het bepalen van de oorsprong van serotoninerge systeemveranderingen in dit rattenmodel via ex vivo 5-HT2A R-dichtheidsbeoordelingper celtype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met respectievelijk de Ethische Commissie voor menselijke en dierlijke experimenten van het kanton Genève, de Kantonnale Commissie voor Onderzoeksethiek (CCER) en de Algemene Directie van het Gezondheidsgebied Genève (Zwitserland). Gegevens worden gerapporteerd volgens de richtlijnen voor dieronderzoek: rapportage in vivo experimenten (ARRIVE).
1. SPECT camera voorbereiding en kalibratie
- Schakel de camera in, laad de besturingssoftware (zie Tabel met materialen). Klik op de Home XYZ Stage knop om homing uit te voeren.
- Stel het experiment in dat bestaat uit één scanacquisitie van 10 minuten. Stel de stapmodus in op Fijn en de acquisitiemodus op de Listmode (om het volledige emissiespectrum op te nemen).
- Stel het bed in en zorg ervoor dat het verwarmingssysteem, de ademhalingssensor en de anesthesie functioneel en veilig zijn (figuur 1A-D). Plaats vervolgens een fantoom (d.w.z. 2 ml van een bekende concentratie van 125I in een microfugebuis van 2 ml) waar het hoofd van het dier wordt geplaatst (gecentreerd op het gebied, figuur 1E).
- Stel het scangebied in door de cursors voor de drie dimensies te schuiven met behulp van de drie afbeeldingen in het onderste deel van het scherm. Zorg ervoor dat het scanvolume van het fantoom en het dier hetzelfde is.
- Start de fantoomscan voor de daaropvolgende kalibratie met de parameters die zijn vastgesteld in stappen 1.2-1.4.
2. Werkruimte-instelling voor SPECT-imaging
- Reinig de werkruimte met het desinfectiemiddel virucide en plaats zachte papieren op alle oppervlakken.
- Zorg ervoor dat er voldoende isofluraan en zuurstof in hun respectieve tanks zit.
- Bereid een 24 G-katheter voor door de vinnen van de vlinderkatheter af te snijden om een duidelijker zicht op de ader van de rattenstaart te hebben.
- Bekleed de katheter door deze volledig te vullen met heparine-oplossing (25000 E/ml) na het verwijderen van de naald. Plaats vervolgens de naald er weer in om de vorming van bloedstolsels na het inbrengen van de katheter te voorkomen.
3. [125I]CLINDE radiotracer synthese
LET OP: Radioactiviteit kan voldoende ioniserende energie hebben om de atomen van de levende cellen te beïnvloeden en hun genetisch materiaal (DNA) te beschadigen.
- Zorg ervoor dat u werkt in een geschikte omgeving die is toegestaan voor experimenten met radioactiviteit.
OPMERKING: Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) voor het hanteren van radioactiviteit, inclusief vinger- en lichaamsdosimeters. Probeer op een veilige afstand te blijven van elke bron van radioactiviteit. - Incubeer 100 μg tributylineprecursor in 100 μL azijnzuur met natriumjodide (Na125I) (zie Materiaaltabel) en 5 μL 37% perazijnzuur bij 70 °C gedurende 20 minuten in een thermocycler in een handschoenenkastje.
- Verdun de reactie met 50% acetonitril (ACN) in water tot een volume van 500 μL. Injecteer de 500 μL van de verdunde reactie in een kolom met omgekeerde fasen (zie Materialentabel).
- Isoleer de [125I]CLINDE met een lineaire gradiënt HPLC run van 5%-95% ACN in 7 mM H3PO4 gedurende 10 minuten. Verdun het isolaat in H2O tot een eindvolume van 10 ml en injecteer vervolgens de verdunde reactie in een concentratiekolom (zie Tabel met materialen).
- Eluteer de [125I]CLINDE uit de kolom met 300 μL absolute ethanol en verdamp vervolgens de ethanol door deze gedurende 40 minuten in een vacuümcentrifuge bij RT te incuberen.
- Verdun het residu dat de [125I]CLINDE bevat in 300 μL steriele zoutoplossing om een stamoplossing te creëren.
- Na het meten van de radioactiviteit, verdunt u de stamoplossing in steriele zoutoplossing om een oplossing van 0,037 MBq in 500 μL te verkrijgen.
- Zuiver de tracer met HPLC (High-performance liquid chromatography). Bepaal de elutietijd met behulp van een standaardkalibratie bij 450 nm en isoleer de enkele radioactieve piek. Voer de standaard kalibratiecurve uit met zeven standaardconcentraties koude (niet-radioactieve) CLINDE (0,1 μg, 0,5 μg, 0,75 μg, 1 μg, 1,5 μg, 2 μg en 5 μg in 400 μL van een oplossing van 50% ACN). Bepaal de radiochemische zuiverheid door een enkele piek in radio-TLC (Dunne laagchromatografie) te meten. Zorg ervoor dat de zuiverheid van de radiochemische stof boven de 60% ligt.
- Controleer de specifieke activiteit van de radioligand die de ultraviolette absorptie bij 450 nm meet en de kalibratiecurven die zijn vastgesteld met koude referentieverbindingen. Zorg ervoor dat de specifieke activiteit groter is dan 1000 GBq/μmol.
4. [125I]R91150 radiotracersynthese
OPMERKING: Zorg ervoor dat u dezelfde beveiligingsregels volgt als vermeld in de clinde-synthesesectie.
- Meng 300 μg R91150 precursor in een oplossing van 3 μL absolute ethanol, 3 μL ijsazijn, 15 μL dragervrije Na125I (zie Materiaaltabel) (10 mCi) in 0,05 M NaOH en 3 μL van 30% H2O2. Incubeer gedurende 30 minuten in een handschoenenkastje.
- Injecteer de gehele reactie in een kolom met omgekeerde fasen (zie Tabel met materialen).
- Isoleer [125I]R91150 door isocratische HPLC-run (ACN/water 50/50, 10 mM azijnzuurbuffer) met een debiet van 3 ml/min.
- Verdun [125I]R91150 in H2O voor een eindvolume van 10 ml.
- Injecteer 10 ml van de verdunde reactie op een concentratiekolom (zie Materiaaltabel).
- Elute [125I]R91150 uit de kolom met 300 μL absolute ethanol.
- Verdamp de ethanol door deze gedurende 40 minuten in een vacuümcentrifuge bij RT te broeden.
- Verdun het residu dat [125I]R91150 bevat in 300 μL zoutoplossing.
- Zuiver de tracer met HPLC. Bepaal de elutietijd met behulp van een standaardkalibratie bij 450 nm en isoleer de enkele radioactieve piek. Bepaal de radiochemische zuiverheid door een enkele piek in radio-TLC te meten. Zorg ervoor dat de zuiverheid van de radiochemische stof hoger is dan 98%.
5. Bereiding van dieren
- Weeg en anesthetiseer de TgF344-AD rat (mannelijk of vrouwelijk, van 2-24 maanden oud) in een inductiekamer met 3% isofluraan. Eenmaal diep verdoofd, verlaagt u de isofluraanstroom tot 2% (0,4 l / min, 100% O2) in de kamer.
- Plaats het dier op een voorverwarmd bed uitgerust met een anesthesie neuskegel. Houd isofluraan op 2% (0,4 l/min, 100% O2).
- Breng ooggelglijmiddel aan in de ogen van het dier en bevestig de diepte van de anesthesie via ademhalingsmonitoring; pas de anesthesie indien nodig aan.
- Voer het inbrengen van de 24 G-katheter in de staartader uit.
6. Overname van SPECT
- Breng het dier over naar het camerabed dat is uitgerust met een temperatuurgeregeld verwarmingskussen dat is ingesteld op 38 °C (figuur 1E).
- Bevestig de kop van het dier op de bijtbalk en bevestig de hoofdsteunen.
- Stel het experiment in op een scan van 60 minuten die 60 frames van 1 min vormt. Gebruik alle andere parameters die in stap 1 zijn ingesteld opnieuw. Klik op de knop Afbeelding bijwerken om de positie van het dier bij te werken.
- Stel het scangebied in door de cursors te schuiven met behulp van de drie afbeeldingen in het onderste deel van het scherm voor de drie dimensies.
- Injecteer 500 μL van de radioactieve radiotracer ([125I]CLINDE of [125I]R91150) en spoel de buis vervolgens met 300 μL steriel 0,9% NaCl. Klik tegelijkertijd op Acquisitie starten om de scan te starten.
- Zorg er tijdens de scantijd voor dat het dier onder constante anesthesie blijft met bewaking van de ademhalingsfrequentie. Pas indien nodig de stroom van isofluraan aan.
- Zodra de scan voorbij is, euthanaseer het verdoofde dier snel door onthoofding.
7. Scan reconstructie
- Open de software voor scanreconstructie (zie Materiaaltabel) en open vervolgens de gegevensset, op zoek naar het bestand [bestandsnaam].parameters dat is gemaakt in de map van de scan.
- Selecteer de gewenste isotoop. Merk op dat de parameter Listmode bij deze stap meerdere isotopenselectie toestaat.
- Selecteer de volgende parameters: Voxel-grootte van 0,4 mm, 4 (POS-EM)-subsets, 6 iteraties (24ME-EM-equivalent), geen postfilter en de overeenkomstige isotoop decaycorrectie. Selecteer de uitvoerindeling naar NIfTI en selecteer vervolgens SPECT-reconstructie starten .
8. Hersenextractie bij ratten
- In hetzelfde verdovingsgebeuren als de scanprocedure en na het verzekeren van de diepe anesthesietoestand van het dier door de ademhalingsfrequentie te controleren, gaat u verder met de onthoofding door guillotine en brengt u het hoofd snel over naar de dissectiebank.
- Knip met een schaar voorzichtig de huid bovenop het hoofd van de achterkant naar voren tot het midden van de ogen.
- Snijd de overtollige spieren rond de basis van de schedel en de halswervels af.
- Plaats vervolgens voorzichtig een mes van de schaar in het gat aan de achterkant van de schedel, het foramen magnum, en verwijder het achterste deel van de schedel met een chirurgische tang.
- Verwijder vervolgens met een chirurgische tang voorzichtig het bovenste deel van de schedel. De schedel van oude mannelijke ratten kan dik zijn, verwijder als kleine stukjes om schade aan de hersenen te voorkomen.
- Knip de hersenvliezen voorzichtig af met een schaar. Hersenvliezen kunnen de hersenen beschadigen tijdens het extractieproces; verwijder het uit voorzorg.
- Nadat u het bovenste deel van de schedel hebt verwijderd, draait u het hoofd van het dier rond en trekt u met een kleine platte spatel voorzichtig de hersenen eruit door de oog- en trigeminuszenuwen door te snijden.
- Breng de hersenen voorzichtig over op een plat, schoon glazen oppervlak voor dissectie op ijs.
- Gebruik een platte metalen spatel en een scheermesje om de interessegebieden van de hersenen te ontleden. Plaats de weefsels in een centrifugebuis van 2 ml en weeg het verkregen weefsel. Gebruik het hersengedeelte direct voor celisolatie of vries het snel in vloeibare stikstof in voor later gebruik.
9. Celisolatie
- Zorg ervoor dat u in een schone en steriele omgeving werkt. Werken onder een klasse-II bioveiligheidskast (BSC) wordt geadviseerd. Zorg ervoor dat de handschoenen en elk apparaat dat in de BSC wordt ingebracht steriel zijn.
- Om de cellen voor te bereiden op celsortering, volgt u het protocol van Jaclyn M. Schwarz14.
OPMERKING: In dit experiment werd een in de handel verkrijgbare neurale dissociatiekit (zie tabel met materialen) gebruikt voor celvoorbereiding.- Doe de monsters in een centrifugebuis van 2 ml met 1 ml HBSS (Ca- en Mg-vrij) en centrifugeer vervolgens (300 x g, 2 min, kamertemperatuur = RT) en verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren.
- Voeg 1900 μL enzymmix-1 toe en incubeer het gedurende 15 minuten bij 37 °C terwijl u de buisjes roert door elke 5 minuten om te keren.
- Voeg 30 μL enzymmix-2 toe, roer voorzichtig met pipet 1 (zie Materiaaltabel) 30 keer heen en weer. Incubeer vervolgens gedurende 15 minuten bij 37 °C terwijl u de buizen om de 5 minuten door inversie roert.
- Meng voorzichtig heen en weer met pipet 2 en pipetteer vervolgens 3 voordat u gedurende 10 minuten bij 37 °C incubeert om de weefsels te dissociëren.
- Filter de cellen met een celzeef van 80 μm, voeg 10 ml HBSS (Ca- en Mg-vrij) toe. Centrifugeer (300 x g, 10 min, RT) en verwijder het supernatant zonder de pellet te storen.
- Voor myelinedepletie, resuspend de pellet met 400 μL myelineverwijderingsbuffer (zie Tabel met materialen) en voeg vervolgens 100 μL myelineverwijderingsparels toe (zie Tabel met materialen), voordat u gedurende 15 minuten bij 4 °C broedt.
- Voeg 5 ml myelineverwijderingsbuffer toe, centrifugeer (300 x g, 10 min, RT) en verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren.
- Voeg 500 μL myelineverwijderingsbuffer toe en plaats de buis in de magnetische veldkolom. Was de kolom vier keer met 1 ml myelineverwijderingsbuffer.
- Centrifugeer (300 x g, 2 min, RT) en verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren. Vortex kort (2 s) om de cellen te dissociëren en 5 μL Fc-blok CD32 toe te voegen. Vortex opnieuw en incubeer gedurende 5 min bij 4 °C.
- Voeg 100 μL van de mix van primaire antilichamen van belang toe; incubeer gedurende 20 min bij 4 °C.
- Centrifugeer (350 x g, 5 min, 4 °C) en verwijder het supernatant zonder de pellet te storen. Dep de buisjes ondersteboven op zacht papier.
- Voeg na een korte vortex (2 s) 100 μL van het secundaire antilichaammengsel toe en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 °C.
- Voeg 2 ml myelineverwijderingsbuffer toe, centrifugeer (350 x g, 5 min, 4 °C) en verwijder het supernatant zonder de pellet te storen. Dep de buisjes ondersteboven op zacht papier. Resuspend de cellen in 250 μL steriel PBS en ga direct over tot celsortering.
10. Cel sorteren
- Bereid de microfugebuis voor met 500 μL steriel PBS voor het verzamelen van de gesorteerde cellen.
- Voeg 10 μL Hoechst per 1000 μL celoplossing toe om de kernen van de levende cellen te kleuren en ze te onderscheiden van de dode cellen.
- Breng de cellen zo snel mogelijk over naar de celsorteermachine bij 4 °C.
- Sorteer eerst de cellen op voorwaartse en zijverstrooiing en sorteer vervolgens de Hoechst-positieve cellen. Sorteer vervolgens de cellen op basis van de antilichamen van belang. Verzamel de positief gekleurde cellen afzonderlijk. Zorg ervoor dat u de positieve cellen onderscheidt van de autofluorescente cellen.
- Tel het aantal gesorteerde cellen voor elke interessante pool.
11. Gamma tellen
- Kalibreer het γ telsysteem met 10 μL van dezelfde fantoomoplossing die wordt gebruikt voor de SPECT-kalibratie, maar verdun het in 1 ml water.
OPMERKING: De fantoomoplossing wordt verdund vanwege de verbeterde precisie van het γ telsysteem. - Plaats de buis met gesorteerde cellen in het γ telsysteem en ga verder met de γ tellen volgens het protocol van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
WT-ratten ondervonden in vivo SPECT-scan met [125I]CLINDE-radiotracer na een unilaterale LPS-injectie (figuur 2). Deze scan (met behulp van opgetelde gegevens van beelden van 45-60 min post radiotracer injectie) toonde een hogere binding van [125I]CLINDE op de plaats van de LPS-injectie (figuur 2A) dan in het contralaterale gebied van de hersenen (figuur 2B). De ex vivo monsters die FACS-RTT ondergingen, bevestigden die resultaten en onthulden de aanwezigheid van een hoger aantal [125I] CLINDE-bindingsplaatsen alleen in microglia, waaruit blijkt dat de cellulaire oorsprong van het [125I] CLINDE-signaal in de ipsilaterale kant van de hersenen microgliaal was (figuur 3A) 15.
Met behulp van dezelfde [125I] CLINDE-radiotracer werd het protocol vervolgens uitgevoerd op de hippocampus van oude TgF344-AD Ratten (12- en 24 maanden oud) en vergeleken met 24 maanden oude WT. De resultaten toonden aan dat de toename van TSPO-binding na 12 maanden bij TgF344-AD-ratten beperkt was tot astrocyten. Bij 24 maanden oude ratten was de toename van de TSPO-binding te wijten aan zowel astrocytische als microgliale veranderingen (figuur 3B). De resultaten toonden aan dat de TSPO-overexpressie in astrocyten waarschijnlijk eerder wordt waargenomen dan de microgliale. Onafhankelijk, met behulp van de radiotracer [125I] R91150, werd deze techniek op cellulaire schaal gebruikt om aan te tonen dat bij oudere TgF344-AD-ratten striatale astrocyten een verminderde 5HT2A R-dichtheidvertoonden in vergelijking met WT (figuur 3C)16.
Ten slotte werd FACS-RTT uitgevoerd op menselijke AD post-mortem monsters. Na dissociatie werden de cellen geïncubeerd met [125I] CLINDE vóór kleuring en de FACS-procedure. Dit maakte het mogelijk om een corticale overexpressie van TSPO te ontdekken in zowel astrocyten als microglia van AD-proefpersonen in vergelijking met leeftijdsgematchte controles (figuur 3D).
Figuur 1: SPECT Camera Set-up. (A) Spect camera algemene presentatie. (B) Bedpresentatie met verwarming en ademhalingsfrequentiebewaking. (C) Anesthesiebuispluggen. (D) Verwarmingsbed en stopcontact voor ademhalingssondes. (E) Phantom positioning monitoring view van de software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: TSPO hersenbeeldvorming met SPECT met [125I]CLINDE radiotracer. Representatieve beelden (45-60 min na injectie van [125I]CLINDE) van de hippocampus na (A) LPS of (B) zoutoplossing injectie in de ipsilaterale (witte) en contralaterale (rode) kant van de hersenen. In vivo tijd-activiteitscurven gemeten in het volume-van-belang worden weergegeven in het rechterpaneel. SPECT: single-photon emission computertomografie; TSPO: translocator eiwit; LPS: lipopolysaccharide. n = 7 dieren per aandoening. Dit cijfer is aangepast van Tournier et al.15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Kwantificering van TSPO en 5HT2AR. (A) Cellulaire oorsprong van TSPO-overexpressie na een unilaterale herseninjectie van LPS. De radioactiviteit werd gemeten (% geïnjecteerde dosis/g weefsel) in elke celpopulatie in de contralaterale (grijs, n = 7) en de ipsilaterale (groen, n = 7) kant van de injectie. Gebruikte statistische test: gepaarde t-test. (B) TSPO bij oude TgF344-AD rat. De [125I]CLINDE-concentraties (% geïnjecteerde dosis/g weefsel) werden bepaald bij 24 maanden oude wild-type dieren (grijs, n = 9) en bij 12- (groen, n = 8) en 24 maanden oude (paars, n = 7) TgF344- AD-ratten. Gebruikte statistische test: tweerichtings-ANOVA. (C) 5HT2AR is verminderd in astrocyten van het striatum bij oude TgF344-AD ratten. De [125I]R91150 concentratie werd bepaald in astrocyten en microglia op cellulair niveau (% geïnjecteerde dosis/cel) bij WT (grijs, n = 7) en oude TgF344-AD (groen, n = 11) ratten. Gebruikte statistische test: eenrichtingsverkeer ANOVA. (D) Cel herkomst van TSPO overexpressie in de frontale cortex bij de ziekte van Alzheimer (AD). In elke celpopulatie wordt de radioactiviteit gemeten (% geïnjecteerde dosis/g weefsel) bij AD-proefpersonen (groen, n = 9) en controle (grijs, n = 9). Gebruikte statistische test: ongepaarde t-test. Alle gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± 95% BI met de volgende annotatie: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voor zover wij weten, was deze techniek de eerste die een benadering beschreef die een beter begrip mogelijk maakt van in vivo bindingsveranderingen van een radiotracer op cellulair niveau. Het protocol beschrijft een multischaalmethode om radiotracerbinding op cellulair niveau te kwantificeren met behulp van [125I]CLINDE (TSPO) of [125I]R91150 (5HT2AR) als voorbeelden.
Deze techniek is robuust en gevoelig genoeg om nauwkeurig de cellulaire oorsprong te detecteren van een breed spectrum van gliacelveranderingen, variërend van een intense ontstekingsreactie geïnduceerd door LPS tot meer subtiele gliacelveranderingen waargenomen in een rattenmodel van AD, waardoor belangrijke aanvullende informatie wordt gebracht voor in vivo nucleaire neuroimaging, als de microgliale oorsprong van het signaal verkregen met SPECT dat werd bepaald. De studie toonde verder aan dat FACS-RTT zelfs in staat was om veranderingen in de neuroreceptordichtheid op cellulaire schaal te onderscheiden met het voorbeeld van 5HT2AR (figuur 3C). Ten slotte werd bewijs geleverd voor het gebruik van de techniek in menselijke postmortemweefsels, wat een verhoogde TSPO-concentratie in astrocyten en microglia van AD-proefpersonen aantoonde.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de complementariteit met PET- en SPECT-beeldvorming. Inderdaad, nucleaire beeldvorming is een krachtige techniek die informatie kan extraheren uit een hersengebied of voxelniveau. De limiet ligt echter op cellulaire schaal; het is onmogelijk om de bijdrage van elk celtype aan het signaal te onderscheiden. FACS-RTT maakt het mogelijk om verder te gaan door een radiotracerconcentratie in elk celtype te onthullen. Interessant is dat in theorie een onbeperkte reeks doelen kan worden beoordeeld met deze techniek, met als beperking de beschikbaarheid van een radiotracer voor het doel van belang.
De kritieke stappen van het protocol omvatten het gebruik van radioactiviteit die moet worden uitgevoerd in een beveiligde omgeving met gekwalificeerd personeel. Verder is het cruciaal om rekening te houden met radioactief verval. Voor FACS-voorbereiding moet men zorgen voor antilichaamspecificiteit, golflengte, lichtintensiteit die verschillen afhankelijk van het celtype en optimalisatie nodig hebben voor efficiënte celsortering.
Een van de beperkingen van deze techniek die in de hier gepresenteerde studies wordt onderstreept, ligt in het gebruik van verouderde dieren en menselijke postmortale hersenmonsters vanwege autofluorescente cellen. Lipofuscine, d.w.z. een residu van lysosomale spijsvertering, is fluorescerend en hoopt zich op in verouderende neuronen, microglia en astrocyten. FACS kan, met voorafgaande optimalisatie, autofluorescente cellen onderscheiden van positief gelabelde cellen, wat een essentiële stap is als oudere dieren worden bestudeerd. Een andere beperking van de techniek is de onmogelijkheid om de radiotracerconcentratie tussen de verschillende gesorteerde celtypen over verschillende dieren direct te vergelijken. Dit zou kunnen worden uitgevoerd als de concentratie van de niet-gemetaboliseerde, niet-eiwitgebonden radiotracers in het bloed werd overwogen voor normalisatie tussen dieren.
Een laatste beperking is de noodzaak dat alle gebruikte apparatuur, bijvoorbeeld cyclotron, PET / SPECT-camera, FACS en γ teller, zich in de nabijheid van elkaar bevindt, vooral als isotopen met een korte halfwaardetijd worden gebruikt voor in vivo beeldvorming en FACS-RTT.
FACS-RTT kan ook worden gebruikt als een op zichzelf staande benadering, d.w.z. niet noodzakelijkerwijs na een in vivo nucleaire beeldvormingsstudie15. De complexiteit van hersenziekten vereist het bestuderen van mechanismen op cellulair niveau of op eencellige schaal. FACS-RTT zou een translationeel hulpmiddel kunnen zijn dat in vivo beeldvormingsbenaderingen overbrugt met een breed spectrum van ex vivo of in vitro cellulaire en moleculair biologische benaderingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation (subsidie nr. 320030-184713). Auteurs BBT en KC worden ondersteund door de Velux Foundation (projectnr. 1123). Auteur ST kreeg steun van de Swiss National Science Foundation (Early Post-Doc Mobility Scholarship, nr. P2GEP3_191446), de Prof Dr. Max Cloetta Foundation (Clinical Medicine Plus scholarship) en de Jean and Madeleine Vachoux Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
| BioVet | BioVet | Software for vitals check | |
| Bondclone C18 reverse-phase column | Phenomenex, Schlieren, Switzerland | ||
| Des-Sur | University Hospital of Geneva | Virucide | |
| Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | Reactivity for rat |
| FITC-conjugated anti-rat CD90 | Biolegend | 202504 | Reactivity for rat |
| Heparin | B. Braun | B01AB01 | |
| HPLC | Knauer | ||
| Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm | BD Biosciences | 321312 | 24 G catheter |
| Isoflurane | Baxter | ZDG9623 | |
| Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Micropore soft tape | 3M | F51DA01 | |
| MILabs-Uspect II | MILabs | Software for SPECT Camera | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | Cell sorter | |
| Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | Contains beads and myelin removal buffer. |
| NaCl 0.9% Sterile solution | B. Braun | 395202 | |
| Neural Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3. |
| Nylon Mesh Sheet | Amazon | CMN-0074-10YD | 40 inch width, 80 micron size mesh |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| R91150 précursor | CERMN | ||
| Sep-Pak C18 Column | Waters | Concentration column | |
| Sodium iodide Na125 | PerkinElmer | ||
| Tributylin precursor | CERMN | ||
| U-SPECT Rec2.38c | MILabs | Version Rec2.38c | Software for SPECT images reconstruction |
| USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
| Wizard 3" | PerkinElmer | Gamma counter |
References
- Nichols, E., et al. regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).
- Kinney, J. W., et al. Inflammation as a central mechanism in Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 4, New York, N. Y. 575-590 (2018).
- D'Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer's disease: Translating basic science into clinical practice. Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).
- D'Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer's disease: Bridging the gap between mice and humans. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).
- Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).
- Morrone, C. D., et al. Regional differences in Alzheimer's disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-β attenuation. Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).
- Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer's disease rats in the Morris Water Task. Scientific Reports. 8 (1), 16153 (2018).
- Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer's disease: A preliminary approach. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).
- Tournier, B. B., et al. Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer's disease. Genes, Brain, and Behavior. , 12712 (2020).
- Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyzériat, K., Garibotto, V., Millet, P. In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer's disease. Cells. 9 (9), (2020).
- Backes, H. [11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors. NeuroImage. 207, 116346 (2020).
- Millet, P., et al. Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images. NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).
- Tsartsalis, S., et al. A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images. Molecular Imaging. 13 (8), (2014).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).
- Tournier, B. B., et al. Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).
- Tournier, B. B., et al. Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).
