TDP-43 단백질 요법의 드로소필라 모델에서 포도당 섭취 측정
Summary
포도당 섭취량은 FRET 기반의 유전자 인코딩 된 포도당 센서에 의해 표시된 바와 같이 TAR DNA 결합 단백질 (TDP-43) 단백질 병증에 의해 영향을받는 Drosophila 운동 뉴런에서 증가합니다.
Abstract
근위축성 측삭 경화증은 진단 후 2-5 년 이내에 진보적 인 근육 약점과 죽음을 일으키는 신경 퇴행성 질환입니다. 임상 증상은 체중 감소를 포함, 이상 지질 혈 증, 그리고 과대사; 그러나, 이러한 모터 뉴런 변성에 어떻게 관련 되어 불분명 남아. 세포질 내재, 운동 장애 및 수명 감소를 포함한 ALS의 여러 특징을 재구성하는 TDP-43 단백질 요법의 Drosophila 모델을 사용하여, 우리는 최근에 광범위한 신진 대사 적자를 확인했습니다. 이들 중, 글리코리시스는 조절되고 유전적 상호작용 실험이 보상 신경보호 메커니즘에 대한 증거를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 실제로, 인산화루크토키나아제의 강화 규제에도 불구하고, 글리코리시스의 효소를 제한하는 속도, 식이 및 유전 적 조작을 이용한 글리코리시스의 증가는 TDP-43 단백질 요법의 비행 모델에서 운동 기능 장애 및 증가수명을 완화하는 것으로 나타났다. 모터 뉴런의 글리코리틱 플럭스에 대한 TDP-43 단백질 요법에 대한 효과를 더욱 조사하기 위해 이전에 보고된 유전자 인코딩, FRET 기반 센서, FLII12Pglu-700μδ6이 사용되었다. 이 센서는 FRET 쌍으로 세균성 포도당 감지 도메인및 시안 및 황형 광성 단백질로 구성됩니다. 포도당 결합시 센서는 FRET가 발생할 수 있도록 형성적 변화를 겪습니다. FLII12Pglu-700μδ6를 사용하여, 포도당 섭취량은 TDP-43G298S,ALS를 유발하는 변형을 발현하는 운동 뉴런에서 현저하게 증가하는 것으로 나타났다. 여기서, TDP-43 단백질요법의 맥락에서 포도당 센서 FLII12Pglu-700δ6을 발현하는 애벌레 복부 신경코드 제제에서 포도당 통풍구, ex vivo를측정하는 방법을 보여 준다. 이 접근법은 포도당 섭취량을 측정하고 다른 세포 유형또는 ALS 및 관련 신경 퇴행성 질환을 일으키는 다양한 돌연변이의 맥락에서 글리코리틱 플럭스를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
근위축성 측삭 경화증 (ALS)은 현재 불치의 진보적 인 신경 퇴행성 질환입니다. ALS는 진단1의2-5 년 안에 운동 조정, 돌이킬 수 없는 마비, 호흡 부전 및 최종 죽음의 손실로 이끌어 내는 상부 및 하부 운동 뉴런에 영향을 미칩니다. ALS는 체중 감소, 이상지질혈증 및 과대사와 같은 신진 대사 결함과 관련이 있습니다(2에서검토됨); 그러나, 그것은 어떻게 신진 대사에 이러한 변경 모터 뉴런 변성관련 불분명 남아. ALS 및 관련 신경퇴행성 질환에서 흔히 발생하는 분모는 TDP-43, RNA처리3,4,5의여러 단계에 관여하는 핵산 결합 단백질이다. TDP-43에 있는 돌연변이는 환자의 3%-5%에 영향을 미치지만, 야생 형 TDP-43 단백질은 ALS 케이스의 >97%에서 세포질 집계 에서 발견됩니다(6에서검토). 이 병리학은 세포질 포함, 운동 기능 장애 및 감소수명을포함하여 ALS의 여러 측면을 재구성하는 모터 뉴런에서 인간 야생형 또는 돌연변이 TDP-43 (G298S)의 과발현에 의해 드로소필라에서 모델링되었다7,8. 이러한 모델을 이용하여, 최근에는 TDP-43 단백질요법이 피루바테 수준및 인포스포프락토키나아제(PFK) mRNA, 글리코리시스9의속도 제한 효소의 상당한 증가를 야기한다고 보고되었다. PFK 성적증명서의 유사한 증가는 환자 유래 운동 뉴런과 척수에서 발견되었으며, 이는 당해가 TDP-43 단백질 요법의 맥락에서 강화된다는 것을 시사한다. 흥미롭게도, 식이 및 유전 조작을 이용한 글리코리시스의 추가 증가는 운동 신경을 퇴행성화하는 보상, 신경 보호 메커니즘과 일치하여 TDP-43 단백질 요법의 플라이 모델에서 운동 기능 장애 및 증가수명과 같은 여러 ALS 표현형을 완화시켰습니다.
TDP-43 단백병증의 드로소필라 모델에서 글리코리시스의 변화를 더욱 조사하고 포도당 섭취를 측정하기 위해 이전에 보고된 유전자 인코딩 된 FRET 계 센서 FLII12Pglu-700μδ610은 UAS-GAL4 발현 시스템을 사용하여 모터 뉴런으로 발현되었다. FLII12Pglu-700μδ6 포도당 센서는 녹색 형광 단백질, 시안 및 황형 단백질(CFP 및 YFP)의 두 가지 변이체 간의 공명 에너지 전달을 사용하여 세포 수준에서 포도당을 검출합니다. 분자의 반대쪽 끝에 CFP 및 YFP에 융합된 대장균 MglB 유전자로부터 세균성 포도당 결합 도메인으로 구성된다. 포도당 분자에 바인딩될 때, 센서는 CFP와 YFP를 더 가깝게 가져오고 FRET가 생기도록 허용하는 형성 변화를 겪으며, 이는 세포내 포도당 수준10,11,12(도 1)를정량화하는 데 사용될 수 있다. 여기서, 우리는 FLII12Pglu-700μδ6 센서가 모터 뉴런에서 TDP-43 단백질 요법에 의한 포도당 섭취의 변화를 결정하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 를 보여줍니다. 여기에 설명된 실험은 운동 뉴런에서 ALS 관련 돌연변이, TDP-43G298S의과발현이 대조군에 비해 포도당 섭취량이 현저하게 증가한다는 것을 보여준다. 이 접근법은 다른 유형의 ALS(예를 들어, SOD1, C9orf72 등) 및/또는 다른 세포 유형(예: 신경변성과 관련된 포도당 섭취의 변화를 결정하기 위해 사용될 수 있다).
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 상세히 기술된 기술은 FLII12Pglu-700δ6, 밀리몰라 범위10,11,12로포도당 수준의 변화를 검출할 수 있는 FRET 기반 센서를 사용하여 살아있는 드로소필라에 대한 특정 세포 유형의 포도당섭취를측정하도록 적용될 수 있다. 이 센서는 이전에 UAS-GAL4 시스템과 함께 뉴런9,10을포?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 드로소필라 균주를 제공 스테파니 쉬르마이어와 다케시 이왓스보 감사합니다. 우리는 또한 애리조나 대학의 말리 이미징 코어에서 이미징을 지원한 패트리샤 얀스마에게 감사드립니다. 이 작품은 건강 NIH NS091299의 국가 학회에 의해 투자되었다, NS115514 (DCZ에), HHMI 길리엄 펠로우십 (EM에) 및 학부 생물학 연구 프로그램 (HB에).
Materials
| 35 mm tissue culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | |
| 40X water immersion lens | Zeiss | 440090 | dippable, N.A. 0.8 |
| dissection scissors | Roboz | RS-5618 | |
| Dumont #5 forceps | VWR | 100189-236 | |
| Dumont #55 forceps | VWR | 100189-244 | |
| Minutien pins | Fine Science tools | 26002-10 | used for dissections |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 1317318 | |
| Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope | Zeiss | N/A |
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