Medição da captação de glicose em modelos de Drosophila de Proteinopatia TDP-43
Summary
A absorção de glicose é aumentada em neurônios motores Drosophila afetados pela proteína de ligação de DNA TAR (TDP-43), como indicado por um sensor de glicose à base de FRET, geneticamente codificado.
Abstract
A esclerose lateral amiotrófica é uma doença neurodegenerativa que causa fraqueza muscular progressiva e morte dentro de 2-5 anos após o diagnóstico. As manifestações clínicas incluem perda de peso, dislipidemia e hipermetabolismo; no entanto, ainda não está claro como estes se relacionam com a degeneração do neurônio motor. Usando um modelo de Drosophila de proteinopatia TDP-43 que recapitula várias características da ELA, incluindo inclusões citoplasmáticas, disfunção locomotor e redução da vida útil, recentemente identificamos amplos déficits metabólicos. Entre elas, verificou-se que a glicólise era regulada e os experimentos de interação genética forneceram evidências para um mecanismo neuroprotetor compensatório. De fato, apesar da regulação da fosfofructokinase, a taxa que limita a enzima na glicólise, um aumento da glicólise usando manipulações dietéticas e genéticas foi mostrado para mitigar a disfunção locomotor e o aumento da vida útil em modelos de moscas da proteinopatia TDP-43. Para investigar melhor o efeito sobre a proteinopatia TDP-43 no fluxo glicóglitico em neurônios motores, foi utilizado um sensor geneticamente codificado geneticamente, baseado em FRET, FLII12Pglu-700μδ6. Este sensor é composto por um domínio bacteriano de sensoriamento de glicose e proteínas fluorescentes ciano e amarela como o par FRET. Após a ligação de glicose, o sensor sofre uma alteração conformacional permitindo que o FRET ocorra. Utilizando FLII12Pglu-700μδ6, a absorção de glicose foi significativamente aumentada em neurônios motores expressando TDP-43G298S, uma variante causadora de ELA. Aqui, mostramos como medir a absorção de glicose, ex vivo,nas preparações do cabo do nervo ventral larval expressando o sensor de glicose FLII12Pglu-700μδ6 no contexto da proteinopatia TDP-43. Essa abordagem pode ser usada para medir a absorção de glicose e avaliar o fluxo glicóltico em diferentes tipos de células ou no contexto de várias mutações que causam ELA e distúrbios neurodegenerativos relacionados.
Introduction
A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa progressiva que atualmente é incurável. A ELA afeta neurônios motores superiores e inferiores levando à perda da coordenação motora, paralisia irreversível, insuficiência respiratória e eventual morte dentro de 2-5 anos após o diagnóstico1. A ELA está associada a defeitos metabólicos como perda de peso, dislipidemia e hipermetabolismo (revisado em2); no entanto, ainda não está claro como essas alterações no metabolismo se relacionam com a degeneração do neurônio motor. Um denominador comum em ELA e doenças neurodegenerativas relacionadas é o TDP-43, uma proteína de ligação nucleica de ácido envolvida em várias etapas do processamento de RNA3,4,5. Embora as mutações no TDP-43 afetem apenas 3%-5% dos pacientes, a proteína TDP-43 de tipo selvagem é encontrada dentro de agregados citoplasmicos em >97% dos casos de ELA (revisados em6). Esta patologia foi modelada em Drosophila por superexpressão do tipo selvagem humano ou mutante TDP-43 (G298S) em neurônios motores, que recapitula múltiplos aspectos da ELA, incluindo inclusões citoplasmáticas, disfunção locomotora e redução da vida útil7,8. Usando esses modelos, foi recentemente relatado que a proteinopatia TDP-43 causa um aumento significativo nos níveis de piruvato e mRNA de fosfofructokinase (PFK), a enzima que limita a taxa da glicólise9. Aumentos semelhantes nas transcrições de PFK foram encontrados em neurônios motores derivados do paciente e medulas espinhais, sugerindo que a glicólise é regulada no contexto da proteinopatia TDP-43. Curiosamente, o aumento da glicolise usando manipulações dietéticas e genéticas mitigau vários fenótipos da ALS, como disfunção locomotor e aumento da vida útil em modelos de moscas de proteinopatia TDP-43, consistente com um mecanismo compensatório e neuroprotetor na degeneração de neurônios motores.
Para sondar ainda mais mudanças na glicólise e medir a absorção de glicose em modelos de Drosophila de proteinopatia TDP-43, um sensor baseado em FRET geneticamente codificado anteriormente FLII12Pglu-700μδ610 foi expresso em neurônios motores especificamente usando o sistema de expressão UAS-GAL4. O sensor de glicose FLII12Pglu-700μδ6 utiliza a transferência de energia de ressonância entre duas variantes de proteína fluorescente verde, ciano e proteínas fluorescentes amarelas (CFP e YFP) para detectar glicose no nível celular. Consiste em um domínio de ligação de glicose bacteriana do gene E. coli MglB fundido a CFP e YFP em extremidades opostas da molécula. Quando ligado a uma molécula de glicose, o sensor sofre uma alteração conformacional aproximando o PCP e o YFP e permitindo que o FRET ocorra, que pode ser usado para quantificar os níveis de glicose intracelulares10,11,12 (Figura 1). Aqui, mostramos como o sensor FLII12Pglu-700μδ6 pode ser usado para determinar alterações na absorção de glicose causadas pela proteinopatia TDP-43 em neurônios motores. Os experimentos descritos aqui mostram que a superexpressão de um mutante associado à ALS, TDP-43G298S,em neurônios motores causa um aumento significativo na absorção de glicose em comparação com os controles. Essa abordagem pode ser usada em outros tipos de ELA (por exemplo, SOD1, C9orf72, etc.) e/ou outros tipos de células (por exemplo, glia, músculos) para determinar alterações na absorção de glicose associadas à neurodegeneração.
Protocol
Representative Results
Discussion
A técnica descrita em detalhes aqui pode ser aplicada para medir a absorção de glicose em um tipo específico de interesse celular em Drosophila viva usando FLII12Pglu-700μδ6, um sensor baseado em FRET que pode detectar alterações nos níveis de glicose para uma faixa mililitro10,11,12. Este sensor foi usado anteriormente em conjunto com o sistema UAS-GAL4 para direcionar sua expressão para tipos celulares espec…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Stefanie Schirmeier e Takeshi Iwatsubo por fornecerem cepas de Drosophila. Agradecemos também a Patricia Jansma por ajudar com a imagem no Marley Imaging Core na Universidade do Arizona. Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde NIH NS091299, NS115514 (para DCZ), HHMI Gilliam Fellowship (para EM) e o Programa de Pesquisa em Biologia de Graduação (para HB).
Materials
| 35 mm tissue culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | |
| 40X water immersion lens | Zeiss | 440090 | dippable, N.A. 0.8 |
| dissection scissors | Roboz | RS-5618 | |
| Dumont #5 forceps | VWR | 100189-236 | |
| Dumont #55 forceps | VWR | 100189-244 | |
| Minutien pins | Fine Science tools | 26002-10 | used for dissections |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 1317318 | |
| Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope | Zeiss | N/A |
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