Glukosupptaget ökar i Drosophila motoriska nervceller som påverkas av TAR DNA-bindande protein (TDP-43) proteinopati, vilket indikeras av en FRET-baserad, genetiskt kodad glukossensor.
Amyotrofisk lateral skleros är en neurodegenerativ sjukdom som orsakar progressiva muskel svaghet och död inom 2-5 år efter diagnos. Kliniska manifestationer inkluderar viktminskning, dyslipidemi och hypermetabolism; det är dock fortfarande oklart hur dessa relaterar till motor neuron degeneration. Med hjälp av en Drosophila modell av TDP-43 proteinopati som rekapitulerar flera funktioner i ALS inklusive cytoplasmic införanden, locomotor dysfunktion och minskad livslängd, identifierade vi nyligen omfattande metaboliska underskott. Bland dessa konstaterades glykolys vara uppreglerad och genetiska interaktion experiment gav bevis för en kompensatorisk neuroprotektiv mekanism. Trots uppreglering av phosphofructokinase, den hastighetsbegränsande enzym i glykolys, en ökning av glykolys med hjälp av kost och genetiska manipuleringar visade sig mildra locomotor dysfunktion och ökad livslängd i flug modeller av TDP-43 proteinopati. För att ytterligare undersöka effekten på TDP-43 proteinopati på glykolytiskt flöde i motoriska nervceller, användes en tidigare rapporterad genetiskt kodad, FRET-baserad sensor, FLII12Pglu-700μδ6. Denna sensor består av en bakteriell glukosavkännande domän och cyan och gula fluorescerande proteiner som FRET-paret. Vid glukosbindning genomgår sensorn en konformationsförändring som gör att FRET kan uppstå. Med hjälp av FLII12Pglu-700μδ6 konstaterades glukosupptag ökas avsevärt i motoriska nervceller som uttrycker TDP-43G298S, en ALS orsakar variant. Här visar vi hur man mäter glukosupptag, ex vivo, i larv ventrala nervkabelpreparat som uttrycker glukossensorn FLII12Pglu-700μδ6 i samband med TDP-43-proteinopati. Detta tillvägagångssätt kan användas för att mäta glukosupptag och bedöma glykolytiskt flöde i olika celltyper eller i samband med olika mutationer som orsakar ALS och relaterade neurodegenerativa sjukdomar.
Amyotrofisk lateral skleros (ALS) är en progressiv neurodegenerativ sjukdom som för närvarande är obotlig. ALS påverkar övre och nedre motoriska nervceller som leder till förlust av motorisk samordning, irreversibel förlamning, andningssvikt och eventuell död inom 2-5 år efter diagnos1. ALS är associerad med metaboliska defekter som viktminskning, dyslipidemi och hypermetabolism (ses över i2); det är dock fortfarande oklart hur dessa förändringar i ämnesomsättningen relaterar till motor neuron degeneration. En gemensam nämnare i ALS och relaterade neurodegenerativa sjukdomar är TDP-43, ett nukleinsyrabindande protein som är involverat i flera steg av RNA-bearbetning3,4,5. Även om mutationer i TDP-43 endast påverkar 3%-5% av patienterna, finns wild-typ TDP-43 protein inom cytoplasmiska aggregat i >97% av ALS fall (ses i6). Denna patologi modellerades i Drosophila genom överuttryck av mänsklig vildtyp eller mutant TDP-43 (G298S) i motoriska nervceller, som rekapitulerar flera aspekter av ALS, inklusive cytoplasmiska inneslutningar, lokomotorisk dysfunktion och minskad livslängd7,8. Med hjälp av dessa modeller rapporterades nyligen att TDP-43 proteinopati orsakar en betydande ökning av pyruvatnivåer och phosphofructokinase (PFK) mRNA, det hastighetsbegränsande enzymet av glykolys9. Liknande ökningar i PFK transkript hittades i patientens-härledda motor nervceller och ryggmärg, vilket tyder på att glykolys är uppreglerad i samband med TDP-43 proteinopati. Intressant nog mildrade ytterligare ökning av glykolys med hjälp av kost och genetiska manipuleringar flera ALS-fenotyper såsom lokomotorisk dysfunktion och ökad livslängd i flugmodeller av TDP-43 proteinopati, i överensstämmelse med en kompensatorisk, neuroprotektiv mekanism i degenererande motoriska nervceller.
För att ytterligare undersöka förändringar i glykolys och mäta glukosupptag i Drosophila modeller av TDP-43 proteinopati, uttrycktes en tidigare rapporterad genetiskt kodad FRET-baserade sensor FLII12Pglu-700μδ610 i motor nervceller specifikt med hjälp av UAS-GAL4 uttryckssystemet. FLII12Pglu-700μδ6 glukossensor använder resonansenergiöverföring mellan två varianter av grönt fluorescerande protein, cyan och gula fluorescerande proteiner (CFP och YFP) för att detektera glukos på cellnivå. Den består av en bakteriell glukosbindningsdomän från E. coli MglB-genen smält till CFP och YFP i motsatta ändar av molekylen. När den är bunden till en glukosmolekyl genomgår sensorn en konformationell förändring som för CFP och YFP närmare varandra och tillåter FRET att uppstå, som sedan kan användas för att kvantifiera intracellulära glukosnivåer10,11,12 ( figur1). Här visar vi hur FLII12Pglu-700μδ6-sensorn kan användas för att bestämma förändringar i glukosupptaget som orsakas av TDP-43-proteinopati i motoriska nervceller. Experimenten som beskrivs här visar att överuttryck av en ALS-associerad mutant, TDP-43G298S, i motoriska nervceller orsakar en betydande ökning av glukosupptag jämfört med kontroller. Detta tillvägagångssätt kan användas i andra typer av ALS (t.ex. SOD1, C9orf72, etc.) och/eller andra celltyper (t.ex. glia, muskler) för att bestämma förändringar i glukosupptag i samband med neurodegeneration.
Tekniken som beskrivs i detalj här kan tillämpas för att mäta glukosupptag i en specifik celltyp av intresse för levande Drosophila med FLII12Pglu-700μδ6, en FRET-baserad sensor som kan upptäcka förändringar i glukosnivåer till ett millimolarområde10,11,12. Denna sensor har tidigare använts tillsammans med UAS-GAL4-systemet för att rikta dess uttryck till specifika celltyper, inklusive nervceller<sup class…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Stefanie Schirmeier och Takeshi Iwatsubo för att de tillhandahåller Drosophila-stammar. Vi tackar också Patricia Jansma för att hon hjälpte till med avbildning i Marley Imaging Core vid University of Arizona. Detta arbete finansierades av National Institutes of Health NIH NS091299, NS115514 (till DCZ), HHMI Gilliam Fellowship (till EM) och Grundutbildningsbiologiforskningsprogrammet (till HB).
35 mm tissue culture dishes | Sigma Aldrich | CLS430165 | |
40X water immersion lens | Zeiss | 440090 | dippable, N.A. 0.8 |
dissection scissors | Roboz | RS-5618 | |
Dumont #5 forceps | VWR | 100189-236 | |
Dumont #55 forceps | VWR | 100189-244 | |
Minutien pins | Fine Science tools | 26002-10 | used for dissections |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 1317318 | |
Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope | Zeiss | N/A |