Fabbricazione microfluidica di microcapsule Core-Shell che trasportano sferoidi di cellule staminali pluripotenti umane
Summary
Questo articolo descrive l’incapsulamento di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) utilizzando un dispositivo di messa a fuoco del flusso coassiale. Dimostriamo che questa tecnologia di incapsulamento microfluidico consente una formazione efficiente di sferoidi hPSC.
Abstract
Le colture tridimensionali (3D) o sferoidi di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) offrono i vantaggi di migliori risultati di differenziazione e scalabilità. In questo articolo, descriviamo una strategia per la formazione robusta e riproducibile di sferoidi hPSC in cui un dispositivo di messa a fuoco del flusso coassiale viene utilizzato per intrappolare le hPSC all’interno di microcapsule core-shell. La soluzione principale conteneva sospensione monocellulare di hPSC ed è stata resa viscosa dall’incorporazione di poli(glicole etilenico) ad alto peso molecolare (PEG) e mezzi gradienti di densità. Il flusso di guscio comprendeva PEG-4 braccio-maleimmide o PEG-4-Mal e scorreva lungo il flusso centrale verso due giunzioni petrolifere consecutive. La formazione di goccioline si è verificata alla prima giunzione dell’olio con la soluzione del guscio che si avvolge attorno al nucleo. La reticolazione chimica del guscio si è verificata alla seconda giunzione dell’olio introducendo un reticolante di-tiolo (1,4-ditiotreitolo o DTT) a queste goccioline. Il reticolante reagisce con i gruppi funzionali della maleimmide tramite la chimica dei clic, con conseguente formazione di un guscio di idrogel attorno alle microcapsule. La nostra tecnologia di incapsulamento ha prodotto capsule da 400 μm di diametro ad una velocità di 10 capsule al secondo. Le capsule risultanti avevano un guscio di idrogel e un nucleo acquoso che permetteva alle singole cellule di assemblarsi rapidamente in aggregati e formare sferoidi. Il processo di incapsulamento non ha influenzato negativamente la vitalità delle hPSC, con una vitalità >95% osservata 3 giorni dopo l’incapsulamento. Per confronto, le hPSC incapsulate in microparticelle di gel solido (senza un nucleo acquoso) non formavano sferoidi e avevano una vitalità <50% 3 giorni dopo l'incapsulamento. La formazione sferoide di hPSC all'interno di microcapsule core-shell si è verificata entro 48 ore dall'incapsulamento, con il diametro sferoide in funzione della densità di inoculazione cellulare. Nel complesso, la tecnologia di incapsulamento microfluidico descritta in questo protocollo era adatta per l'incapsulamento delle hPSC e la formazione di sferoidi.
Introduction
C’è un notevole interesse per le colture 3D di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) a causa del miglioramento della pluripotenza e del potenziale di differenziazione offerti da questo formatodi coltura 1,2,3. Le hPSC sono tipicamente formate in sferoidi o altri formati di coltura 3D per mezzo di bioreattori, microwell, idrogel e scaffold polimerici 4,5,6. L’incapsulamento offre un altro mezzo per organizzare singole hPSC in sferoidi. Una volta incapsulati, gli sferoidi hPSC possono essere maneggiati con facilità e trasferiti in piastre di microtitolazione per la differenziazione, la modellazione della malattia o esperimenti di test antidroga. L’involucro di hPSC in uno strato di idrogel protegge anche le cellule dai danni da taglio e consente di coltivare sferoidi in un bioreattore ad alti tassi di agitazione7.
La nostra metodologia per l’incapsulamento delle cellule staminali si è evoluta nel tempo. In primo luogo, ci siamo concentrati sulle microparticelle di idrogel solido e abbiamo dimostrato successo nell’incapsulamento e nella coltivazione di cellule staminali embrionali di topo (mESC)8. Tuttavia, è stato notato che le cellule staminali embrionali umane (hESC) avevano una bassa vitalità quando incapsulate in tali microparticelle di idrogel, presumibilmente a causa della maggiore necessità per queste cellule di ristabilire i contatti cellula-cellula dopo l’incapsulamento. Abbiamo ragionato sul fatto che la microcapsula eterogenea, che possiede un nucleo acquoso, può essere più adatta per l’incapsulamento di cellule che si basano sul rapido ristabilimento dei contatti cellula-cellula. Il concetto di dispositivo microfluidico di focalizzazione del flusso coassiale per la produzione di microcapsule acquose a nucleo / guscio idrogel è stato adattato da He et al.9, ma invece dell’alginato impiegato nell’approccio originale, un idrogel a base di PEG è stato incorporato nel guscio. Abbiamo prima dimostrato il successo dell’incapsulamento e della formazione sferoide di epatociti primari in microcapsule10 del guscio centrale e più recentemente descritto incapsulamento di cellule hES e iPS7. Come delineato nella Figura 1A, le capsule sono fabbricate in un dispositivo di messa a fuoco del flusso in cui i flussi di flusso del guscio e del nucleo passano da un lato all’altro al flusso coassiale prima dell’espulsione nella fase dell’olio. Il flusso del nucleo contiene cellule e additivi che aumentano la viscosità della soluzione (PEG MW 35kD non reattivo e iodixanolo – nome commerciale OptiPrep) mentre il flusso del guscio contiene molecole reattive (PEG-4-Mal). Il flusso continuo coassiale viene discretizzato in goccioline che mantengono l’architettura core-shell. La struttura del guscio centrale è resa permanente dall’esposizione al reticolante di-tiolo (DTT), che reagisce con PEG-4-Mal tramite la chimica del clic e provoca la formazione di una pelle o di un guscio di idrogel sottile (~ 10 μm). Dopo che l’emulsione è stata rotta e le capsule sono state trasferite in una fase acquosa, le molecole di PEG si diffondono dal nucleo e vengono sostituite da molecole d’acqua. Ciò si traduce in microcapsule a nucleo acquoso e guscio idrogel.
Di seguito sono fornite istruzioni dettagliate su come realizzare dispositivi microfluidici, come preparare le cellule e come eseguire l’incapsulamento delle hPSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il processo di incapsulamento qui descritto si traduce nella formazione riproducibile di sferoidi hPSC. Il formato a microcapsula facilita l’erogazione di sferoidi nei pozzetti di una piastra di microtitolazione per esperimenti volti a migliorare/ottimizzare i protocolli di differenziazione o testare terapie. Gli sferoidi a cellule staminali incapsulati possono anche essere utilizzati in colture di sospensioni in cui il guscio di idrogel protegge le cellule dai danni indotti dal taglio7.
<p cl…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato in parte dalle sovvenzioni del Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, J. W. Kieckhefer Foundation, Al Nahyan Foundation, Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) e NIH (DK107255).
Materials
| 0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
| 6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
| Digital hot plate | Dataplate | ||
| Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
| Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
| Magic tape | Staples | 483535 | |
| Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
| Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
| Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
| Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
| Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
References
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