Mikrofluidisk fremstilling af kerneskalmikrokapsler, der bærer humane pluripotente stamcellesfæroider
Summary
Denne artikel beskriver indkapsling af humane pluripotente stamceller (hPSC’er) ved hjælp af en koaksial flowfokuseringsenhed. Vi demonstrerer, at denne mikrofluidiske indkapslingsteknologi muliggør effektiv dannelse af hPSC-sfæroider.
Abstract
Tredimensionelle (3D) eller sfæroidkulturer af humane pluripotente stamceller (hPSC’er) giver fordelene ved forbedrede differentieringsresultater og skalerbarhed. I dette papir beskriver vi en strategi for robust og reproducerbar dannelse af hPSC-sfæroider, hvor en koaksial flowfokuseringsenhed bruges til at fange hPSC’er inde i kerneskalmikrokapsler. Kerneopløsningen indeholdt enkeltcellesuspension af hPSC’er og blev gjort tyktflydende ved inkorporering af poly(ethylenglycol) (PEG) med høj molekylvægt og densitetsgradientmedie. Skalstrømmen bestod af PEG-4 arm-maleimid eller PEG-4-Mal og flød langs kernestrømmen mod to på hinanden følgende oliekryds. Dråbedannelse fandt sted ved det første oliekryds med skalopløsning, der viklede sig rundt om kernen. Kemisk tværbinding af skallen forekom ved det andet oliekryds ved at indføre en di-thiol-tværbinding (1,4-dithiothreitol eller DTT) til disse dråber. Tværbindingen reagerer med maleimidfunktionelle grupper via klikkemi, hvilket resulterer i dannelsen af en hydrogelskal omkring mikrokapslerne. Vores indkapslingsteknologi producerede kapsler med en diameter på 400 μm med en hastighed på 10 kapsler i sekundet. De resulterende kapsler havde en hydrogelskal og en vandig kerne, der gjorde det muligt for enkeltceller hurtigt at samle sig i aggregater og danne sfæroider. Indkapslingsprocessen påvirkede ikke hPSC’ernes levedygtighed negativt, idet >95 % levedygtighed blev observeret 3 dage efter indkapslingen. Til sammenligning dannede hPSC’er indkapslet i faste gelmikropartikler (uden en vandig kerne) ikke sfæroider og havde <50% levedygtighed 3 dage efter indkapsling. Sfæroiddannelse af hPSC'er inde i kerneskalmikrokapsler forekom inden for 48 timer efter indkapsling, hvor sfæroiddiameteren var en funktion af celleinokuleringstætheden. Samlet set var den mikrofluidiske indkapslingsteknologi, der er beskrevet i denne protokol, velegnet til hPSC'er indkapsling og sfæroiddannelse.
Introduction
Der er stor interesse for 3D-kulturer af humane pluripotente stamceller (hPSC’er) på grund af den forbedrede pluripotens og differentieringspotentiale, som dette kulturformat 1,2,3 giver. hPSC’er dannes typisk til sfæroider eller andre 3D-kulturformater ved hjælp af bioreaktorer, mikrobrønde, hydrogeler og polymere stilladser 4,5,6. Indkapsling tilbyder et andet middel til at organisere enkelte hPSC’er i sfæroider. Når indkapslede hPSC-sfæroider kan håndteres med lethed og overføres til mikrotiterplader til differentiering, sygdomsmodellering eller lægemiddeltestforsøg. Indkapsling af hPSC’er i et hydrogellag beskytter også celler mod forskydningsskader og gør det muligt at dyrke sfæroider i en bioreaktor ved høje omrøringshastigheder7.
Vores metode til indkapsling af stamceller udviklede sig over tid. For det første fokuserede vi på faste hydrogelmikropartikler og demonstrerede vellykket indkapsling og dyrkning af museembryonale stamceller (mESC’er)8. Det blev imidlertid bemærket, at humane embryonale stamceller (hESC’er) havde lav levedygtighed, når de blev indkapslet i sådanne hydrogelmikropartikler, formodentlig på grund af det større behov for, at disse celler genoprettede celle-cellekontakter efter indkapslingen. Vi ræsonnerede, at heterogen mikrokapsel, der besidder en vandig kerne, kan være bedre egnet til indkapsling af celler, der er afhængige af hurtig genetablering af celle-cellekontakter. Konceptet med koaksial strømningsfokuserende mikrofluidisk enhed til fremstilling af vandige kerne / hydrogelskalmikrokapsler blev tilpasset fra He et al.9, men i stedet for alginat anvendt i den oprindelige tilgang blev en PEG-baseret hydrogel inkorporeret i skallen. Vi demonstrerede først vellykket indkapsling og sfæroiddannelse af primær hepatocyt i kerneskalmikrokapsler10 og senest beskrevet indkapsling af hES- og iPS-celler7. Som skitseret i figur 1A fremstilles kapsler i en flowfokuseringsanordning, hvor skal- og kernestrømstrømmene overgår fra side til side til koaksial strømning, inden de skubbes ud i oliefasen. Kernestrømmen indeholder celler og additiver, der øger opløsningens viskositet (ikke-reaktiv PEG MW 35kD og iodixanol – kommercielt navn OptiPrep), mens skalstrømmen indeholder reaktive molekyler (PEG-4-Mal). Kontinuerlig koaksial strømningsstrøm diskretiseres i dråber, der bevarer kerneskalarkitektur. Kerneskalstrukturen gøres permanent ved udsættelse for di-thiol crosslinker (DTT), som reagerer med PEG-4-Mal via klikkemi og resulterer i dannelse af en tynd (~ 10 μm) hydrogelhud eller skal. Efter at emulsionen er brudt, og kapsler overføres til en vandig fase, diffunderer molekyler af PEG fra kernen og erstattes af vandmolekyler. Dette resulterer i vandige kerne- og hydrogelskalmikrokapsler.
Nedenfor er trinvise instruktioner om, hvordan man fremstiller mikrofluidiske enheder, hvordan man forbereder celler, og hvordan man udfører indkapsling af hPSC’er.
Protocol
Representative Results
Discussion
Indkapslingsprocessen beskrevet her resulterer i reproducerbar dannelse af hPSC-sfæroider. Mikrokapselformatet gør det nemt at dispensere sfæroider i brønde på en mikrotiterplade til eksperimenter, der sigter mod at forbedre / optimere differentieringsprotokoller eller testterapier. Indkapslede stamcellesfæroider kan også anvendes i suspensionskulturer, hvor hydrogelskallen beskytter celler mod forskydningsinduceret skade7.
Der er flere kritiske trin i protokolle…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev delvist støttet af bevillingerne fra Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, J. W. Kieckhefer Foundation, Al Nahyan Foundation, Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) og NIH (DK107255).
Materials
| 0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
| 6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
| Digital hot plate | Dataplate | ||
| Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
| Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
| Magic tape | Staples | 483535 | |
| Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
| Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
| Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
| Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
| Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
References
- Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).
- Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).
- Lei, Y., Schaffer, D. V. A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).
- Fattahi, P., et al. Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
- Siltanen, C., et al. Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids. Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).
- Agarwal, P., et al. One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells. Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).
- Siltanen, C., et al. One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids. Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).
- Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood. ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).
- Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).
- Shin, D. S., et al. Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells. Angewandte Chemie International Edition. , (2014).
- You, J., et al. Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells. Advanced Functional Materials. , (2015).
