Mikrofluidische Herstellung von Core-Shell-Mikrokapseln mit humanen pluripotenten Stammzellsphäroiden
Summary
Dieser Artikel beschreibt die Verkapselung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) mit einem koaxialen Flussfokussiergerät. Wir zeigen, dass diese mikrofluidische Verkapselungstechnologie eine effiziente Bildung von hPSC-Sphäroiden ermöglicht.
Abstract
Dreidimensionale (3D) oder sphäroide Kulturen humaner pluripotenter Stammzellen (hPS-Zellen) bieten die Vorteile verbesserter Differenzierungsergebnisse und Skalierbarkeit. In diesem Artikel beschreiben wir eine Strategie für die robuste und reproduzierbare Bildung von hPSC-Sphäroiden, bei der eine koaxiale Flussfokussierungsvorrichtung verwendet wird, um hPSCs in Kern-Shell-Mikrokapseln einzuschließen. Die Kernlösung enthielt Einzelzellsuspension von hPS-Zellen und wurde durch den Einbau von hochmolekularem Polyethylenglykol (PEG) und Dichtegradientenmedien viskos gemacht. Der Schalenstrom bestand aus PEG-4-Armmaleimid oder PEG-4-Mal und floss entlang des Kernstroms zu zwei aufeinanderfolgenden Ölverbindungen. Die Tröpfchenbildung erfolgte an der ersten Ölverbindung, wobei sich die Schalenlösung um den Kern wickelte. Die chemische Vernetzung der Schale erfolgte am zweiten Ölübergang durch Einbringen eines Dithiol-Vernetzers (1,4-Dithiothreitol oder DTT) in diese Tröpfchen. Der Vernetzer reagiert mit Malemid-funktionellen Gruppen über die Klickchemie, wodurch eine Hydrogelhülle um die Mikrokapseln gebildet wird. Unsere Verkapselungstechnologie produzierte Kapseln mit einem Durchmesser von 400 μm bei einer Rate von 10 Kapseln pro Sekunde. Die resultierenden Kapseln hatten eine Hydrogelhülle und einen wässrigen Kern, der es einzelnen Zellen ermöglichte, sich schnell zu Aggregaten zusammenzusetzen und Sphäroide zu bilden. Der Prozess der Verkapselung wirkte sich nicht negativ auf die Lebensfähigkeit von hPSCs aus, wobei 3 Tage nach der Verkapselung eine Lebensfähigkeit von >95% beobachtet wurde. Zum Vergleich: In festen Gel-Mikropartikeln (ohne wässrigen Kern) verkapselte hPS-Zellen bildeten keine Sphäroide und hatten 3 Tage nach der Verkapselung eine <50%ige Lebensfähigkeit. Die Sphäroidbildung von hPS-Zellen in Kernhüllen-Mikrokapseln erfolgte innerhalb von 48 h nach der Verkapselung, wobei der Sphäroiddurchmesser eine Funktion der Zellimpfdichte war. Insgesamt war die in diesem Protokoll beschriebene mikrofluidische Verkapselungstechnologie für die Verkapselung und Sphäroidbildung von hPSCs gut geeignet.
Introduction
Aufgrund der verbesserten Pluripotenz und des Differenzierungspotenzials dieses Kulturformats 1,2,3 besteht ein erhebliches Interesse an 3D-Kulturen humaner pluripotenter Stammzellen (hPSCs). hPS-Zellen werden typischerweise mittels Bioreaktoren, Mikrotöpfen, Hydrogelen und polymeren Gerüsten zu Sphäroiden oder anderen 3D-Kulturformaten geformt 4,5,6. Die Verkapselung bietet eine weitere Möglichkeit, einzelne hPSCs in Sphäroide zu organisieren. Einmal verkapselte hPSC-Sphäroide können mit Leichtigkeit gehandhabt und in Mikrotiterplatten zur Differenzierung, Krankheitsmodellierung oder Drogentestexperimenten übertragen werden. Die Einkapselung von hPSCs in einer Hydrogelschicht schützt die Zellen auch vor Scherschäden und ermöglicht es, Sphäroide in einem Bioreaktor mit hohen Rührraten zu kultivieren7.
Unsere Methodik zur Stammzellverkapselung hat sich im Laufe der Zeit weiterentwickelt. Zunächst konzentrierten wir uns auf feste Hydrogel-Mikropartikel und demonstrierten eine erfolgreiche Verkapselung und Kultivierung von embryonalen Stammzellen (mES-Zellen) der Maus)8. Es wurde jedoch festgestellt, dass menschliche embryonale Stammzellen (hES-Zellen) eine geringe Lebensfähigkeit aufwiesen, wenn sie in solchen Hydrogel-Mikropartikeln verkapselt wurden, vermutlich aufgrund der größeren Notwendigkeit für diese Zellen, Zell-Zell-Kontakte nach der Verkapselung wiederherzustellen. Wir argumentierten, dass heterogene Mikrokapseln, die einen wässrigen Kern besitzen, besser für die Verkapselung von Zellen geeignet sein könnten, die auf einer schnellen Wiederherstellung von Zell-Zell-Kontakten beruhen. Das Konzept der koaxialen Strömungsfokussierung mikrofluidischer Vorrichtung zur Herstellung von wässrigen Kern- / Hydrogel-Hüllen-Mikrokapseln wurde von He et al.9 übernommen, aber anstelle von Alginat, das im ursprünglichen Ansatz verwendet wurde, wurde ein PEG-basiertes Hydrogel in die Schale integriert. Wir zeigten zunächst eine erfolgreiche Verkapselung und Sphäroidbildung von primären Hepatozyten in Kernhüllen-Mikrokapseln10 und beschrieben zuletzt die Verkapselung von hES- und iPS-Zellen7. Wie in Abbildung 1A dargestellt, werden Kapseln in einer Strömungsfokussierungsvorrichtung hergestellt, bei der die Schalen- und Kernströme von Seite zu Seite in koaxiale Strömung übergehen, bevor sie in die Ölphase ausgestoßen werden. Der Kernstrom enthält Zellen und Additive, die die Viskosität der Lösung erhöhen (nicht-reaktives PEG MW 35kD und Iodixanol – Handelsname OptiPrep), während der Schalenstrom reaktive Moleküle enthält (PEG-4-Mal). Der kontinuierliche koaxiale Strömungsstrom wird in Tröpfchen diskretisiert, die die Kern-Shell-Architektur beibehalten. Die Kern-Schalen-Struktur wird durch die Exposition gegenüber Di-Thiol-Vernetzer (DTT) dauerhaft, der mit PEG-4-Mal über Klickchemie reagiert und zur Bildung einer dünnen (~ 10 μm) Hydrogelhaut oder -schale führt. Nachdem die Emulsion gebrochen und die Kapseln in eine wässrige Phase überführt wurden, diffundieren Moleküle des PEG aus dem Kern und werden durch Wassermoleküle ersetzt. Dies führt zu wässrigen Kern- und Hydrogelschalen-Mikrokapseln.
Im Folgenden finden Sie Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Herstellung mikrofluidischer Geräte, zur Vorbereitung von Zellen und zur Verkapselung von hPS-Systemen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der hier beschriebene Verkapselungsprozess führt zu einer reproduzierbaren Bildung von hPSC-Sphäroiden. Das Mikrokapselformat erleichtert die Abgabe von Sphäroiden in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte für Experimente zur Verbesserung / Optimierung von Differenzierungsprotokollen oder zum Testen von Therapien. Verkapselte Stammzellsphäroide können auch in Suspensionskulturen verwendet werden, in denen die Hydrogelhülle die Zellen vor scherinduzierten Schäden schützt7.
<p class="jove_…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde zum Teil durch die Zuschüsse des Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, der J. W. Kieckhefer Foundation, der Al Nahyan Foundation, der Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) und der NIH (DK107255) unterstützt.
Materials
| 0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
| 6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
| Digital hot plate | Dataplate | ||
| Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
| Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
| Magic tape | Staples | 483535 | |
| Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
| Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
| Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
| Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
| Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
References
- Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).
- Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).
- Lei, Y., Schaffer, D. V. A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).
- Fattahi, P., et al. Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
- Siltanen, C., et al. Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids. Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).
- Agarwal, P., et al. One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells. Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).
- Siltanen, C., et al. One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids. Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).
- Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood. ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).
- Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).
- Shin, D. S., et al. Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells. Angewandte Chemie International Edition. , (2014).
- You, J., et al. Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells. Advanced Functional Materials. , (2015).
