ייצור מיקרופלואידי של מיקרו-מעטפת ליבה הנושאים כדוריות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים
Summary
מאמר זה מתאר אנקפסולציה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) באמצעות התקן מיקוד זרימה צירית משותפת. אנו מראים שטכנולוגיית אנקפסולציה מיקרופלואידית זו מאפשרת היווצרות יעילה של כדוריות hPSC.
Abstract
תרביות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) או ספרואידיות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) מציעות את היתרונות של תוצאות דיפרנציאציה משופרות ומדרגיות. במאמר זה, אנו מתארים אסטרטגיה להיווצרות חזקה וניתנת לשחזור של כדוריות hPSC שבהן נעשה שימוש בהתקן מיקוד זרימה צירית משותפת כדי ללכוד hPSCs בתוך מיקרו-קפסולות של מעטפת ליבה. תמיסת הליבה הכילה תרחיף של תאים בודדים של hPSCs ונעשתה צמיגת על ידי שילוב של פולי(אתילן גליקול) בעל משקל מולקולרי גבוה (PEG) ומדיה הדרגתית של צפיפות. זרם הפגזים כלל PEG-4 זרוע-מלימיד או PEG-4-Mal וזרם לצד זרם הליבה לעבר שני צמתי שמן רצופים. היווצרות טיפות התרחשה בצומת השמן הראשון כאשר תמיסת המעטפת עוטפת את עצמה סביב הליבה. הצלבה כימית של הקונכייה התרחשה בצומת השמן השני על ידי החדרת צלב די-תיול (1,4-dithiothreitol או DTT) לטיפות אלה. ההצלבה מגיבה עם קבוצות פונקציונליות של מאלימיד באמצעות כימיה של קליקים, וכתוצאה מכך נוצרת מעטפת הידרוג’ל סביב המיקרו-קפסולות. טכנולוגיית האנקפסולציה שלנו ייצרה כמוסות בקוטר 400 מיקרומטר בקצב של 10 כמוסות בשנייה. הכמוסות שהתקבלו היו בעלות קליפת הידרוג’ל ולייבה מימית שאפשרה לתאים בודדים להתקבץ במהירות לאגרגטים וליצור ספרואידים. תהליך האנקפסולציה לא השפיע לרעה על הכדאיות של hPSCs, כאשר הכדאיות >95% נצפתה 3 ימים לאחר האנקפסולציה. לשם השוואה, hPSCs עטופים במיקרו-חלקיקי ג’ל מוצקים (ללא ליבה מימית) לא יצרו כדוריות והיו בעלי כדאיות <50% 3 ימים לאחר האנקפסולציה. היווצרות כדורית של hPSCs בתוך מיקרו-קפסולות של קליפת ליבה התרחשה תוך 48 שעות לאחר האנקפסולציה, כאשר קוטר הספרואידים הוא פונקציה של צפיפות חיסון התא. באופן כללי, טכנולוגיית האנקפסולציה המיקרופלואידית המתוארת בפרוטוקול זה התאימה היטב לאנקפסולציה של hPSCs ולהיווצרות ספרואידים.
Introduction
יש עניין רב בתרביות תלת-ממדיות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) בשל הפלוריפוטנטיות המשופרת ופוטנציאל ההתמיינות שמעניקה תבנית תרבית זו 1,2,3. hPSCs נוצרים בדרך כלל לספרואידים או לפורמטים אחרים של תרבית תלת-ממדית באמצעות ביו-ריאקטורים, מיקרו-וולים, הידרוג’לים ופיגומים פולימריים 4,5,6. אנקפסולציה מציעה אמצעי נוסף לארגון hPSCs בודדים לספרואידים. לאחר עטיפת כדורי hPSC ניתן לטפל בקלות ולהעבירם ללוחות מיקרוטיטר לצורך התמיינות, מידול מחלות או ניסויים בבדיקת תרופות. עטיפת hPSCs בשכבת הידרוג’ל גם מגנה על התאים מפני נזקי גזירה ומאפשרת תרבית ספרואידים בביוריאקטור בקצבים גבוהים של ערבוב7.
המתודולוגיה שלנו לאנקפסולציה של תאי גזע התפתחה עם הזמן. ראשית, התמקדנו במיקרו-חלקיקי הידרוג’ל מוצקים והדגמנו אנקפסולציה וטיפוח מוצלחים של תאי גזע עובריים של עכברים (mESCs)8. עם זאת, צוין כי לתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) הייתה יכולת קיום נמוכה כאשר הם עטופים במיקרו-חלקיקי הידרוג’ל כאלה, ככל הנראה בשל הצורך הגדול יותר של תאים אלה ליצור מחדש את המגעים בין התא לתאים לאחר האנקפסולציה. סברנו כי מיקרו-קפסולות הטרוגניות, בעלות ליבה מימית, עשויות להתאים יותר לתמצות של תאים המסתמכים על התבססות מחדש מהירה של מגעים בין תאים לתאים. הרעיון של מכשיר מיקרופלואידי ממוקד זרימה צירית משותפת ליצירת מיקרו-קפסולות של מעטפת ליבה/הידרוג’ל מימית הותאם מ-He et al.9, אך במקום אלגינט שהופעל בגישה המקורית, הידרוג’ל מבוסס PEG שולב במעטפת. הדגמנו לראשונה אנקפסולציה מוצלחת והיווצרות כדורית של הפטוציטים ראשוניים במיקרו-קפסולות של קליפת ליבה10 ולאחרונה תיארנו אנקפסולציה של תאי hES ו-iPS7. כפי שמתואר באיור 1A, הקפסולות מיוצרות בהתקן למיקוד זרימה שבו זרמי הזרימה של המעטפת והליבה עוברים מצד לצד לזרימה קו-צירית לפני שהם נפלטים לתוך שלב השמן. זרימת הליבה מכילה תאים ותוספים המגבירים את צמיגות התמיסה (PEG MW 35kD שאינו תגובתי ויודיקסנול – שם מסחרי OptiPrep) בעוד שזרם הקליפה מכיל מולקולות תגובתיות (PEG-4-Mal). זרם זרימה קו-צירית רציפה מחולק בנפרד לטיפות השומרות על ארכיטקטורת מעטפת הליבה. מבנה הליבה-מעטפת הופך לקבוע על ידי חשיפה ל-di-thiol crosslinker (DTT), המגיב עם PEG-4-Mal באמצעות כימיה של קליקים ומביא להיווצרות של עור או מעטפת הידרוג’ל דקים (כ-10 מיקרומטר). לאחר שהאמולסיה נשברת והקפסולות מועברות לשלב מימי, מולקולות של PEG מתפזרות מהליבה ומוחלפות במולקולות מים. התוצאה היא מיקרו-קפסולות של ליבה מימית ומעטפת הידרוג’ל.
להלן הוראות שלב אחר שלב כיצד ליצור התקנים מיקרופלואידיים, כיצד להכין תאים וכיצד לבצע אנקפסולציה של hPSCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
תהליך האנקפסולציה המתואר כאן מביא להיווצרות ניתנת לשחזור של כדוריות hPSC. פורמט המיקרו-קפסולה מקל על חלוקת הספרואידים לבארות של צלחת מיקרוטיטר לניסויים שמטרתם לשפר/למטב פרוטוקולי התמיינות או לבדוק טיפולים. ניתן להשתמש בספרואידים של תאי גזע עטופים גם בתרביות תרחיפים שבהן מעטפת הידרוג’ל מג?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקים ממרכז מאיו קליניק לרפואה רגנרטיבית, קרן J. W. Kieckhefer, קרן אל נהיאן, רפואה רגנרטיבית מינסוטה (RMM 101617 TR 004) ו- NIH (DK107255).
Materials
| 0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
| 6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
| Digital hot plate | Dataplate | ||
| Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
| Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
| Magic tape | Staples | 483535 | |
| Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
| Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
| Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
| Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
| Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
References
- Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).
- Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).
- Lei, Y., Schaffer, D. V. A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).
- Fattahi, P., et al. Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
- Siltanen, C., et al. Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids. Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).
- Agarwal, P., et al. One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells. Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).
- Siltanen, C., et al. One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids. Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).
- Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood. ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).
- Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).
- Shin, D. S., et al. Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells. Angewandte Chemie International Edition. , (2014).
- You, J., et al. Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells. Advanced Functional Materials. , (2015).
