Mikrofluidisk tillverkning av kärnskalmikrokapslar som bär humana pluripotenta stamcellsfäroider
Summary
Denna artikel beskriver inkapsling av humana pluripotenta stamceller (hPSC) med hjälp av en koaxiell flödesfokuseringsanordning. Vi visar att denna mikrofluidiska inkapslingsteknik möjliggör effektiv bildning av hPSC-sfäroider.
Abstract
Tredimensionella (3D) eller sfäroidkulturer av humana pluripotenta stamceller (hPSC) erbjuder fördelarna med förbättrade differentieringsresultat och skalbarhet. I det här dokumentet beskriver vi en strategi för robust och reproducerbar bildning av hPSC-sfäroider där en koaxiell flödesfokuseringsanordning används för att fånga hPSC inuti kärnskalmikrokapslar. Kärnlösningen innehöll encellssuspension av hPSC och gjordes viskös genom införlivande av poly (etylenglykol) med hög molekylvikt (PEG) och densitetsgradientmedier. Skalströmmen bestod av PEG-4 arm-maleimid eller PEG-4-Mal och flödade längs kärnströmmen mot två på varandra följande oljekorsningar. Droppbildning inträffade vid den första oljekorsningen med skallösning som lindade sig runt kärnan. Kemisk tvärbindning av skalet inträffade vid den andra oljekorsningen genom att införa en di-tiolkribärbindning (1,4-ditiotreitol eller DTT) till dessa droppar. Tvärbindningen reagerar med maleimidfunktionella grupper via klickkemi, vilket resulterar i bildandet av ett hydrogelskal runt mikrokapslarna. Vår inkapslingsteknik producerade kapslar med en diameter på 400 μm med en hastighet av 10 kapslar per sekund. De resulterande kapslarna hade ett hydrogelskal och en vattenhaltig kärna som gjorde det möjligt för enskilda celler att snabbt monteras i aggregat och bilda sfäroider. Inkapslingsprocessen påverkade inte hPSC:s livskraft negativt, med >95 % viabilitet observerad 3 dagar efter inkapslingen. Som jämförelse bildade hPSC inkapslade i fasta gelmikropartiklar (utan vattenhaltig kärna) inte sfäroider och hade <50% livskraft 3 dagar efter inkapsling. Sfäroidbildning av hPSC inuti mikrokapslar med kärnskal inträffade inom 48 timmar efter inkapsling, med sfäroiddiametern som en funktion av cellinokuleringsdensiteten. Sammantaget var den mikrofluidiska inkapslingstekniken som beskrivs i detta protokoll väl lämpad för hPSC-inkapsling och sfäroidbildning.
Introduction
Det finns ett stort intresse för 3D-kulturer av humana pluripotenta stamceller (hPSC) på grund av den förbättrade pluripotensen och differentieringspotentialen som detta odlingsformatger 1,2,3. hPSC bildas typiskt till sfäroider eller andra 3D-odlingsformat med hjälp av bioreaktorer, mikrobrunnar, hydrogeler och polymera byggnadsställningar 4,5,6. Inkapsling erbjuder ett annat sätt att organisera enskilda hPSC i sfäroider. En gång inkapslade hPSC-sfäroider kan hanteras med lätthet och överföras till mikrotiterplattor för differentiering, sjukdomsmodellering eller drogtestexperiment. Inneslutning av hPSC i ett hydrogelskikt skyddar också celler mot skjuvskador och gör det möjligt att odla sfäroider i en bioreaktor vid höga omrörningshastigheter7.
Vår metodik för stamcellinkapsling utvecklades över tid. Först fokuserade vi på fasta hydrogelmikropartiklar och demonstrerade framgångsrik inkapsling och odling av musembryonstamceller (mESC)8. Det noterades emellertid att mänskliga embryonala stamceller (hESC) hade låg livskraft när de inkapslades i sådana hydrogelmikropartiklar, förmodligen på grund av det större behovet av dessa celler att återupprätta cell-cellkontakter efter inkapslingen. Vi resonerade att heterogen mikrokapsel, som har en vattenhaltig kärna, kan vara bättre lämpad för inkapsling av celler som är beroende av snabb återupprättande av cell-cellkontakter. Konceptet med koaxiell flödesfokuserande mikrofluidisk anordning för tillverkning av vattenhaltiga kärn-/hydrogelskalmikrokapslar anpassades från He et al.9, men istället för alginat som användes i det ursprungliga tillvägagångssättet införlivades en PEG-baserad hydrogel i skalet. Vi visade först framgångsrik inkapsling och sfäroidbildning av primär hepatocyt i kärnskalmikrokapslar10 och senast beskriven inkapsling av hES- och iPS-celler7. Som beskrivs i figur 1A tillverkas kapslar i en flödesfokuseringsanordning där skal- och kärnflödesströmmarna övergår från sida till sida till koaxiellt flöde innan de kastas ut i oljefasen. Kärnflödet innehåller celler och tillsatser som ökar lösningens viskositet (icke-reaktiv PEG MW 35kD och jodoxanol – kommersiellt namn OptiPrep) medan skalströmmen innehåller reaktiva molekyler (PEG-4-Mal). Kontinuerlig koaxiell flödesström diskretiseras till droppar som behåller kärnskalarkitekturen. Kärnskalstrukturen görs permanent genom exponering för di-tiolkribvärsbindning (DTT), som reagerar med PEG-4-Mal via klickkemi och resulterar i bildandet av en tunn (~ 10 μm) hydrogelhud eller skal. Efter att emulsionen har brutits och kapslar överförs till en vattenhaltig fas diffunderar molekyler av PEG från kärnan och ersätts av vattenmolekyler. Detta resulterar i vattenhaltiga kärn- och hydrogelskalmikrokapslar.
Nedan följer steg-för-steg-instruktioner om hur man gör mikrofluidiska enheter, hur man förbereder celler och hur man utför inkapsling av hPSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Inkapslingsprocessen som beskrivs här resulterar i reproducerbar bildning av hPSC-sfäroider. Mikrokapselformatet gör det enkelt att dispensera sfäroider i brunnar på en mikrotiterplatta för experiment som syftar till att förbättra / optimera differentieringsprotokoll eller testa terapier. Inkapslade stamcellsfäroider kan också användas i suspensionskulturer där hydrogelskal skyddar celler mot skjuvinducerad skada7.
Det finns flera kritiska steg i protokollet…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes delvis av bidragen från Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, J. W. Kieckhefer Foundation, Al Nahyan Foundation, Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) och NIH (DK107255).
Materials
| 0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
| 6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
| Digital hot plate | Dataplate | ||
| Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
| Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
| Magic tape | Staples | 483535 | |
| Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
| Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
| Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
| Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
| Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
References
- Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).
- Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).
- Lei, Y., Schaffer, D. V. A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).
- Fattahi, P., et al. Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
- Siltanen, C., et al. Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids. Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).
- Agarwal, P., et al. One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells. Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).
- Siltanen, C., et al. One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids. Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).
- Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood. ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).
- Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).
- Shin, D. S., et al. Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells. Angewandte Chemie International Edition. , (2014).
- You, J., et al. Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells. Advanced Functional Materials. , (2015).
