En forenklet model til heterotopisk hjerteventiltransplantation hos gnavere

Summary

Denne protokol beskriver en enkel og effektiv metode til transplantation af aortaklappere under nyrekapslen for at muliggøre undersøgelse af alloreaktivitet af hjerteklapper.

Abstract

Der er et presserende klinisk behov for udskiftning af hjerteklappen, der kan vokse hos børn. Hjerteventiltransplantation foreslås som en ny type transplantation med potentiale til at levere holdbare hjerteklapper, der er i stand til somatisk vækst uden krav om antikoagulation. Imidlertid forbliver immunbiologien af hjerteventiltransplantationer uudforsket, hvilket fremhæver behovet for dyremodeller til at studere denne nye type transplantation. Tidligere rottemodeller til heterotopisk aortaklaptransplantation i abdominal aorta er blevet beskrevet, selvom de er teknisk udfordrende og dyre. For at løse denne udfordring blev der udviklet en renal subkapsulær transplantationsmodel hos gnavere som en praktisk og mere ligetil metode til undersøgelse af hjerteklaptransplantationsimmunbiologi. I denne model høstes en enkelt aortaklapper og indsættes i det renale subkapsulære rum. Nyren er let tilgængelig, og det transplanterede væv er sikkert indeholdt i et subkapsulært rum, der er godt vaskulariseret og kan rumme en række vævsstørrelser. Da en enkelt rotte kan give tre donor-aortablade, og en enkelt nyre kan give flere steder til transplanteret væv, kræves der desuden færre rotter til en given undersøgelse. Her beskrives transplantationsteknikken, hvilket giver et væsentligt skridt fremad i studiet af transplantationsimmunologien ved hjerteklaptransplantation.

Introduction

Medfødte hjertefejl er den mest almindelige medfødte handicap hos mennesker og påvirker 7 ud af 1.000 levendefødte børn hvert år¹. I modsætning til voksne patienter, hvor forskellige mekaniske og bioprostetiske ventiler rutinemæssigt implanteres, har pædiatriske patienter i øjeblikket ingen gode muligheder for udskiftning af ventilen. Disse konventionelle implantater har ikke potentiale til at vokse hos modtagerbørn. Som følge heraf kræves sygelige genoperationer for at udskifte hjerteklapimplantaterne til successivt større versioner, når børnene vokser, hvor berørte børn ofte kræver op til fem eller flere åbne hjerteoperationer i deres levetid ^2,3. Undersøgelser har vist, at frihed fra intervention eller død er signifikant dårlig for spædbørn end ældre børn, hvor 60% af spædbørn med protetiske hjerteklapper står over for reoperation eller død inden for 3 år efter deres første operation⁴. Derfor er der et presserende behov for at levere en hjerteklap, der kan vokse og opretholde funktion hos pædiatriske patienter.

I årtier har forsøg på at levere voksende udskiftninger af hjerteklapper været centreret om vævsteknik og stamceller. Forsøg på at oversætte disse ventiler til klinikken har dog hidtil været forgæves 5,6,7,8. For at løse dette foreslås en hjerteventiltransplantation som en mere kreativ operation til levering af voksende udskiftninger af hjerteklappen, der har evnen til selvreparation og undgå trombogenese. I stedet for at transplantere hele hjertet transplanteres kun hjerteklappen og vil derefter vokse med modtagerbarnet, svarende til konventionelle hjertetransplantationer eller en Ross lungeautograf ^9,10,11. Postoperativt vil modtagerbørn modtage immunsuppression, indtil den transplanterede ventil kan udskiftes med en mekanisk protese i voksenstørrelse, når ventilens vækst ikke længere er nødvendig. Transplantationsbiologien af hjerteventiltransplantationstransplantater forbliver imidlertid uudforsket. Derfor er dyremodeller nødvendige for at studere denne nye type transplantation.

Flere rottemodeller er tidligere beskrevet til heterotopisk transplantation af aortaklappen i abdominal aorta 12,13,14,15,16,17,18. Disse modeller er imidlertid uoverkommeligt vanskelige og kræver ofte, at uddannede kirurger opererer med succes. Derudover er de dyre og tidskrævende¹⁹. En ny rottemodel blev udviklet for at skabe en enklere dyremodel til undersøgelse af immunbiologien af hjerteklaptransplantationer. Enkelt aortaklappere udskæres og indsættes i det renale subkapsulære rum. Nyren er specielt velegnet til at studere transplantationsafstødning, da den er stærkt vaskulariseret med adgang til cirkulerende immunceller^20,21. Mens flere andre har brugt en renal subkapsulær model til at studere transplantationsbiologien af andre allografttransplantationer såsom bugspytkirtel, lever, nyre og hornhinde 22,23,24,25,26,27, er dette den første beskrivelse af transplantation af hjertevæv i denne position. Her beskrives transplantationsteknikken, hvilket giver et væsentligt skridt fremad i studiet af transplantationsimmunologien ved hjerteklaptransplantation.

Protocol

Undersøgelsen blev godkendt af Komitéen for Dyreforsøg efter National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals. 1. Oplysninger om dyremodellen (rotter) Brug et operationsmikroskop (se materialetabel) med op til 20x forstørrelse til alle kirurgiske procedurer. Brug syngeneiske (såsom Lewis-Lewis) eller allogene (såsom Lewis-Brown Norway) stammer til transplantationerne efter behov for eksperimentet. Brug rotter i alde…

Representative Results

En grafisk skildring af det eksperimentelle design er tilvejebragt for rottemodellen (figur 1). Derudover er en aortarod dissekeret fra donorens hjerte og en individuel aortaklapper fremstillet til implantation også vist i figur 2. Dernæst vises et repræsentativt billede af placeringen af aortaklappens folder under nyrekapslen til implantation i figur 3A og efter 3, 7 og 28 dage inden for modtagerrotten (figu…

Discussion

Betydning og potentielle anvendelser
Mens mekaniske og bioprostetiske hjerteklapper rutinemæssigt anvendes til voksne patienter, der kræver udskiftning af ventilen, mangler disse ventiler potentialet til at vokse og er derfor suboptimale for pædiatriske patienter. Hjerteventiltransplantation er en eksperimentel operation designet til at levere voksende hjerteventiludskiftninger til nyfødte og spædbørn med medfødt hjertesygdom. I modsætning til transplantationsimmunobiologien ved konventionelle…

Materials

0.9% Sodium Chlordie, USP	Baxter	NDC 0338-0048-04
4-0 Polyglactin 910	Ethicon	J415H
7.5% Povidone-Iodine	CareFusion	29904-004
70% ETOH	Fisher Scientific	BP82031GAL
Anesthesia induction chamber	Harvard Apparatus	75-2030	Air-tight inducton chamber for rats
Anesthesia machine	Harvard Apparatus	75-0238	Mobile Anesthesia System with Passive Scavenging
Anesthesia Mask	Harvard Apparatus	59-8255	Rat anesthesia mask
Brown Norway Rats (BN/Crl)	Charles River	Strain Code 091	Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Buprenorphine Hydrochloride, 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05	0.03 mg/kg, administered subcutaneously
Electric hair clippers	WAHL	79434
Electric Heating Pad	Harvard Apparatus	72-0492	Maintained at 36-38 °C
Heparin	Sagent Pharmaceuticals	NDC 25021-400-10	100U/100g injection into the left atrium
Insulin Syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-841-33
Iris forceps curved	World Precision Instruments	15917
Iris forceps straight	World Precision Instruments	15916
Isoflurane, USP	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25	Induced at 5% isoflurance in oxygen and maintained with 3.5% isoflurane in oxygen
Lewis Rats (LEW/ Crl)	Charles River	Strain Code 004	Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Micro forceps	World Precision Instruments	500233	Dumont #5
Micro scissors	World Precision Instruments	501930	Spring-loaded Vannas Scissors
Needle Driver	World Precision Instruments	500226	Ryder Needle Driver
Operating microscope	AmScope	SM-3BZ-80S	3.5x – 90x Stereo Microscope
Petri Dish	Fisher Scientific	FB0875714
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38
Skin staples	Ethicon	PXR35	Proximate 35
Sterile cotton swabs	Puritan	25-806 1WC
Sterile gauze sponges	Fisher Scientific	22-037-902
Surgical Scissors	World Precision Instruments	1962C	Metzenbaum Scissors
University of Wisconsin Buffer (Servator B)	S.A.L.F S.p.A.	6484A1	Stored at 4 °C