Un modello semplificato per il trapianto di valvole cardiache eterotopiche nei roditori

Summary

Questo protocollo descrive un metodo semplice ed efficiente per il trapianto di foglietti valvolari aortici sotto la capsula renale per consentire lo studio dell’alloreattività delle valvole cardiache.

Abstract

C’è un urgente bisogno clinico di sostituzioni delle valvole cardiache che possono crescere nei bambini. Il trapianto di valvole cardiache è proposto come un nuovo tipo di trapianto con il potenziale per fornire valvole cardiache durevoli in grado di crescere somaticamente senza necessità di anticoagulazione. Tuttavia, l’immunobiologia dei trapianti di valvole cardiache rimane inesplorata, evidenziando la necessità di modelli animali per studiare questo nuovo tipo di trapianto. Sono stati descritti precedenti modelli di ratto per il trapianto di valvola aortica eterotopica nell’aorta addominale, sebbene siano tecnicamente impegnativi e costosi. Per affrontare questa sfida, è stato sviluppato un modello di trapianto sottocapsulare renale nei roditori come metodo pratico e più semplice per studiare l’immunobiologia del trapianto di valvole cardiache. In questo modello, un singolo foglietto della valvola aortica viene raccolto e inserito nello spazio sottocapsulare renale. Il rene è facilmente accessibile e il tessuto trapiantato è contenuto in modo sicuro in uno spazio sottocapsulare che è ben vascolarizzato e può ospitare una varietà di dimensioni del tessuto. Inoltre, poiché un singolo ratto può fornire tre foglietti aortici donatori e un singolo rene può fornire più siti per il tessuto trapiantato, sono necessari meno ratti per un determinato studio. Qui viene descritta la tecnica del trapianto, fornendo un significativo passo avanti nello studio dell’immunologia del trapianto di valvole cardiache.

Introduction

I difetti cardiaci congeniti sono la disabilità congenita più comune negli esseri umani, che colpisce 7 su 1.000 bambini nati vivi ogni anno¹. A differenza dei pazienti adulti in cui vengono impiantate di routine varie valvole meccaniche e bioprotesiche, i pazienti pediatrici attualmente non hanno buone opzioni per la sostituzione della valvola. Questi impianti convenzionali non hanno il potenziale per crescere nei bambini riceventi. Di conseguenza, sono necessarie ri-operazioni morbose per scambiare gli impianti della valvola cardiaca con versioni successive più grandi man mano che i bambini crescono, con i bambini affetti che spesso richiedono fino a cinque o più interventi chirurgici a cuore aperto nella loro vita ^2,3. Gli studi hanno dimostrato che la libertà dall’intervento o dalla morte è significativamente scarsa per i neonati rispetto ai bambini più grandi, con il 60% dei neonati con valvole cardiache protesiche che affrontano il rinogomento o la morte entro 3 anni dalla loro operazione iniziale⁴. Pertanto, vi è un urgente bisogno di fornire una valvola cardiaca in grado di crescere e mantenere la funzione nei pazienti pediatrici.

Per decenni, i tentativi di fornire sostituzioni delle valvole cardiache in crescita sono stati incentrati sull’ingegneria tissutale e sulle cellule staminali. Tuttavia, i tentativi di tradurre queste valvole nella clinica non hanno avuto successo finora 5,6,7,8. Per affrontare questo problema, un trapianto di valvole cardiache viene proposto come un’operazione più creativa per fornire sostituzioni della valvola cardiaca in crescita che hanno la capacità di autoripararsi ed evitare la trombogenesi. Invece di trapiantare l’intero cuore, solo la valvola cardiaca viene trapiantata e crescerà con il bambino ricevente, simile ai trapianti di cuore convenzionali o a un autografo polmonare di Ross ^9,10,11. Post-operatoriamente, i bambini riceventi riceveranno immunosoppressione fino a quando la valvola trapiantata non può essere sostituita con una protesi meccanica di dimensioni adulte quando la crescita della valvola non è più necessaria. Tuttavia, la biologia dei trapianti di trapianto di valvole cardiache rimane inesplorata. Pertanto, sono necessari modelli animali per studiare questo nuovo tipo di trapianto.

Diversi modelli di ratto sono stati precedentemente descritti per il trapianto eterotopico della valvola aortica nell’aorta addominale 12,13,14,15,16,17,18. Tuttavia, questi modelli sono proibitivamente complicati, spesso richiedono chirurghi addestrati per operare con successo. Inoltre, sono costosi e richiedono molto tempo¹⁹. Un nuovo modello di ratto è stato sviluppato per creare un modello animale più semplice per studiare l’immunobiologia dei trapianti di valvole cardiache. I singoli lembi della valvola aortica vengono asportati e inseriti nello spazio sottocapsulare renale. Il rene è particolarmente adatto per studiare il rigetto del trapianto in quanto è altamente vascolarizzato con accesso alle cellule immunitarie circolanti^20,21. Mentre molti altri hanno utilizzato un modello sottocapsulare renale per studiare la biologia del trapianto di altri trapianti di allotrapianto come pancreas, fegato, rene e cornea ^{22,23,24,25,26,27}, questa è la prima descrizione del trapianto di tessuto cardiaco in questa posizione. Qui viene descritta la tecnica del trapianto, fornendo un significativo passo avanti nello studio dell’immunologia del trapianto di valvole cardiache.

Protocol

Lo studio è stato approvato dal Comitato di ricerca sugli animali a seguito della Guida nazionale degli istituti di salute per la cura e l’uso degli animali da laboratorio. 1. Informazioni sul modello animale (Ratti) Utilizzare un microscopio operatorio (vedi Tabella dei materiali) con ingrandimento fino a 20x per tutte le procedure chirurgiche. Utilizzare ceppi singenici (come Lewis-Lewis) o allogenici (come Lewis-Brown Norway) per i trapianti secondo nec…

Representative Results

Una rappresentazione grafica del disegno sperimentale è fornita per il modello di ratto (Figura 1). Inoltre, una radice aortica sezionata dal cuore del donatore e un singolo foglietto della valvola aortica preparato per l’impianto sono mostrati anche nella Figura 2. Successivamente, un’immagine rappresentativa della posizione del foglietto della valvola aortica sotto la capsula renale per l’impianto è mostrata nella Figura 3A e do…

Discussion

Importanza e potenziali applicazioni
Mentre le valvole cardiache meccaniche e bioprotesiche sono abitualmente utilizzate nei pazienti adulti che richiedono la sostituzione della valvola, queste valvole non hanno il potenziale per crescere e, quindi, non sono ottimali per i pazienti pediatrici. Il trapianto di valvole cardiache è un’operazione sperimentale progettata per fornire sostituzioni valvolari cardiache in crescita per neonati e neonati con cardiopatia congenita. Tuttavia, a differenza dell’im…

Materials

0.9% Sodium Chlordie, USP	Baxter	NDC 0338-0048-04
4-0 Polyglactin 910	Ethicon	J415H
7.5% Povidone-Iodine	CareFusion	29904-004
70% ETOH	Fisher Scientific	BP82031GAL
Anesthesia induction chamber	Harvard Apparatus	75-2030	Air-tight inducton chamber for rats
Anesthesia machine	Harvard Apparatus	75-0238	Mobile Anesthesia System with Passive Scavenging
Anesthesia Mask	Harvard Apparatus	59-8255	Rat anesthesia mask
Brown Norway Rats (BN/Crl)	Charles River	Strain Code 091	Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Buprenorphine Hydrochloride, 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05	0.03 mg/kg, administered subcutaneously
Electric hair clippers	WAHL	79434
Electric Heating Pad	Harvard Apparatus	72-0492	Maintained at 36-38 °C
Heparin	Sagent Pharmaceuticals	NDC 25021-400-10	100U/100g injection into the left atrium
Insulin Syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-841-33
Iris forceps curved	World Precision Instruments	15917
Iris forceps straight	World Precision Instruments	15916
Isoflurane, USP	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25	Induced at 5% isoflurance in oxygen and maintained with 3.5% isoflurane in oxygen
Lewis Rats (LEW/ Crl)	Charles River	Strain Code 004	Male, 5-7 weeks, 100-200 g
Micro forceps	World Precision Instruments	500233	Dumont #5
Micro scissors	World Precision Instruments	501930	Spring-loaded Vannas Scissors
Needle Driver	World Precision Instruments	500226	Ryder Needle Driver
Operating microscope	AmScope	SM-3BZ-80S	3.5x – 90x Stereo Microscope
Petri Dish	Fisher Scientific	FB0875714
Petrolatum ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38
Skin staples	Ethicon	PXR35	Proximate 35
Sterile cotton swabs	Puritan	25-806 1WC
Sterile gauze sponges	Fisher Scientific	22-037-902
Surgical Scissors	World Precision Instruments	1962C	Metzenbaum Scissors
University of Wisconsin Buffer (Servator B)	S.A.L.F S.p.A.	6484A1	Stored at 4 °C