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Biology

पूंछ नस ट्रांससेक्शन रक्तस्राव मॉडल पूरी तरह से संवेदनाहारी हीमोफिलिया एक चूहों में

Published: September 30, 2021 doi: 10.3791/62952
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1, 4, 5, 1, 6, 1
1Global Drug Discovery, Novo Nordisk A/S, 2Department of Veterinary and Animal Sciences, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 3Department of Biomedical Sciences, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 4Independent consultant, 5Catalyst Biosciences, 6Værløse Dyreklinik

Summary

संवेदनाहारी चूहों में परिष्कृत पूंछ शिरा ट्रांससेक्शन (टीवीटी) रक्तस्राव मॉडल हीमोफिलिक रक्तस्राव के आकलन के लिए विवो विधि में एक संवेदनशील है। यह अनुकूलित टीवीटी रक्तस्राव मॉडल समापन बिंदुओं के रूप में रक्त हानि और रक्तस्राव के समय का उपयोग करता है, अन्य मॉडलों को परिष्कृत करता है और समापन बिंदु के रूप में मृत्यु से बचता है।

Abstract

पूंछ रक्तस्राव मॉडल हीमोफीलिया अनुसंधान में महत्वपूर्ण उपकरण हैं, विशेष रूप से प्रोकोआगुलेंट प्रभावों के मूल्यांकन के लिए। पूंछ शिरा ट्रांससेक्शन (टीवीटी) उत्तरजीविता मॉडल को एफवीआईआईआई की नैदानिक रूप से प्रासंगिक खुराक के प्रति संवेदनशीलता के कारण कई सेटिंग्स में पसंद किया गया है, जबकि अन्य स्थापित मॉडल, जैसे कि पूंछ क्लिप मॉडल, को प्रोकोआगुलेंट यौगिकों के उच्च स्तर की आवश्यकता होती है। एक समापन बिंदु के रूप में अस्तित्व का उपयोग करने से बचने के लिए, हमने पूरे प्रयोग के दौरान समापन बिंदुओं और पूर्ण संज्ञाहरण के रूप में रक्त हानि और रक्तस्राव के समय की स्थापना करने वाला एक टीवीटी मॉडल विकसित किया। संक्षेप में, संवेदनाहारी चूहों को समशीतोष्ण खारा (37 डिग्री सेल्सियस) में डूबे पूंछ के साथ तैनात किया जाता है और सही पार्श्व पूंछ नस में परीक्षण यौगिक के साथ खुराक दी जाती है। 5 मिनट के बाद, बाएं पार्श्व पूंछ नस को टेम्पलेट गाइड का उपयोग करके ट्रांसेक्ट किया जाता है, पूंछ को खारा में वापस कर दिया जाता है, और रक्त एकत्र करते समय सभी रक्तस्राव एपिसोड की निगरानी की जाती है और 40 मिनट के लिए दर्ज की जाती है। यदि 10 मिनट, 20 मिनट, या 30 मिनट के बाद चोट पर कोई रक्तस्राव नहीं होता है, तो गीले धुंध झाड़ू के साथ दो बार कटौती को पोंछकर थक्के को धीरे-धीरे चुनौती दी जाती है। 40 मिनट के बाद, रक्त की हानि को खारा में हीमोग्लोबिन की मात्रा से निर्धारित किया जाता है। इस तेज़ और अपेक्षाकृत सरल प्रक्रिया के परिणामस्वरूप सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रक्तस्राव होता है। टीवीटी उत्तरजीविता मॉडल की तुलना में, यह औषधीय हस्तक्षेप के प्रति संवेदनशीलता से समझौता किए बिना अधिक मानवीय प्रक्रिया का उपयोग करता है। इसके अलावा, दोनों लिंगों का उपयोग करना संभव है, 3 आर के सिद्धांतों के पालन में, नस्ल की आवश्यकता वाले जानवरों की कुल संख्या को कम करना। रक्तस्राव मॉडल में एक संभावित सीमा हेमोस्टेसिस की स्टोकेस्टिक प्रकृति है, जो मॉडल की प्रजनन क्षमता को कम कर सकती है। इसका मुकाबला करने के लिए, मैनुअल थक्का व्यवधान यह सुनिश्चित करता है कि निगरानी के दौरान थक्के को चुनौती दी जाती है, प्राथमिक (प्लेटलेट) हेमोस्टेसिस को रक्तस्राव को रोकने से रोकता है। रक्तस्राव चोट मॉडल की सूची के लिए यह अतिरिक्त एक मानकीकृत और मानवीय तरीके से प्रोकोआगुलेंट प्रभावों को चिह्नित करने का विकल्प प्रदान करता है।

Introduction

हीमोफीलिया के रोगजनन को समझने और उपचार आहार और उपचार के विकास और परीक्षण के लिए पशु मॉडल आवश्यक हैं। फैक्टर आठवीं नॉक-आउट माउस (एफ 8-केओ) हीमोफीलिया ए 1,2 के अध्ययन के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल है। ये चूहे रोग की प्रमुख विशेषताओं को दोहराते हैं और उपचार के विकास के लिए व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं, जैसे कि पुनः संयोजक एफवीआईआईआई उत्पाद 3,4,5 और जीन थेरेपी रणनीतियों 6,7।

विवो में विभिन्न हेमोस्टैटिक यौगिकों के औषधीय प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए विभिन्न रक्तस्राव चोट मॉडल हैं। इन जमावट मॉडलों में से एक चूहों 8,9,10,11,12,13,14 में पूंछ शिरा ट्रांससेक्शन उत्तरजीविता मॉडल है, जो पूंछ ट्रांससेक्शन के बाद एक्सेंगुइनेशन से बचने के लिए हीमोफिलिक चूहों की क्षमता को मापता है। यह विधि चार दशक पहले15 से अधिक समय पहले पेश की गई थी और अभी भी 9,16,17 का उपयोग किया जाता है। हालांकि, मॉडल एक समापन बिंदु के रूप में अस्तित्व का उपयोग करता है और 24 घंटे तक की अवधि में जानवरों के अवलोकन की आवश्यकता होती है, जिसके दौरान जानवर सचेत होते हैं और इसलिए दर्द और संकट का अनुभव कर सकते हैं।

छोटी अवधि और पूर्ण संज्ञाहरण के तहत रक्तस्राव मॉडल को पहले वर्णित किया गया है, जैसे कि पूंछ क्लिप मॉडल (जिसे पूंछ टिप के रूप में भी जाना जाता है) 8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . फिर भी, रक्तस्राव चुनौती के बाद रक्त हानि के पूर्ण सामान्यीकरण के लिए, इन मॉडलों को नैदानिक रूप से प्रशासित29 की तुलना में प्रोकोआगुलेंट यौगिकों (जैसे, एफवीआईआईआई) की खुराक की आवश्यकता होती है। संज्ञाहरण के तहत एक अलग चोट मॉडल, वेना सैफेना रक्तस्राव विधि, प्रोकोआगुलेंट यौगिकों30 की कम खुराक के प्रति संवेदनशील है, लेकिन उच्च स्तर के प्रयोगकर्ता हस्तक्षेप की आवश्यकता होती है क्योंकि थक्कों को अक्सर बाधित किया जाना चाहिए (प्रस्तुत मॉडल में 3 बार के विपरीत)।

नए प्रोकोआगुलेंट यौगिकों का परीक्षण करने के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल की दिशा में मानकीकरण प्रयोगशालाओं31,32,33 के बीच डेटा तुलना की सुविधा प्रदान करेगा। टीवीटी मॉडल में, अध्ययन किए गए समापन बिंदुओं (रक्त हानि 7,26, रक्तस्राव समय 9,34, और जीवित रहने की दर35,36) पर अभी तक एक आम समझौता नहीं है, और प्रयोगात्मक लंबाई अध्ययन 13 के बीच भिन्न होती है।

हमारा प्राथमिक उद्देश्य उच्च प्रजनन क्षमता के साथ एक अनुकूलित मॉडल का वर्णन और लक्षण वर्णन करना है, ऑन-डिमांड के साथ-साथ रोगनिरोधी उपचार का अध्ययन करने की संभावना, उत्तरजीविता मॉडल के बराबर औषधीय हस्तक्षेप के प्रति संवेदनशीलता, फिर भी समापन बिंदुओं के रूप में मृत्यु या निकट-मृत्यु का उपयोग नहीं करना है। दर्द और संकट को कम करने के लिए, जानवरों को रक्तस्राव के दौरान सचेत नहीं होना चाहिए और अधिक नैतिक समापन बिंदु को लागू करने की आवश्यकताहै।

टेल क्लिप मॉडल आम तौर पर दो वेरिएंट में से एक में आयोजित किए जाते हैं, या तो पूंछ की नोक को काटते हैं, उदाहरण के लिए, 1-5 मिमी 18,19,20,21,23,24 का विच्छेदन या, अधिक गंभीर संस्करण में, 1-3 मिमी 8,22,25 के आसपास पूंछ व्यास पर ट्रांसेक्ट किया जाता है . यह एक संयुक्त धमनी शिरापरक रक्तस्राव का कारण बनता है, क्योंकि पार्श्व और पृष्ठीय नसों और उदर धमनी आमतौर पर अलग हो जाते हैं, और सामान्य तौर पर, विच्छेदन जितना बड़ा होता है, प्रोकोआगुलेंट यौगिक की संवेदनशीलता उतनी ही कम होती है। इसके अलावा, चूंकि पूंछ की नोक को काट दिया जाता है, धमनीशिरापरक चोट बिना किसी विरोधी ऊतक के उजागर होती है; इस प्रकार, कम से कम सिद्धांत रूप में, यह सबसे आम हीमोफिलिक रक्तस्राव से भिन्न है।

जैसा कि नाम से पता चलता है, केवल शिरा पूंछ नस ट्रांससेक्शन मॉडल में घायल हो जाती है जैसे कि इस पत्र में वर्णित है, जिसके परिणामस्वरूप विशेष रूप से शिरापरक रक्तस्राव होता है। चूंकि पोत पूरी तरह से अलग नहीं है, इसलिए चोट विच्छेदन मॉडल की तुलना में छोटी होने की उम्मीद है, और कट के चारों ओर ऊतक, जो एक थक्का पालन कर सकता है, को बनाए रखा जाता है। इसके अलावा, धमनी के विपरीत नस में निम्न रक्तचाप होता है। ये कारक विच्छेदन मॉडल के सापेक्ष बढ़ी हुई संवेदनशीलता में योगदान करते हैं, जैसे कि रक्तस्राव का सामान्यीकरण प्रतिस्थापन चिकित्सा की नैदानिक रूप से प्रासंगिक खुराक के साथ प्राप्त किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, हीमोफिलिया ए में आरएफवीआईआईआई के साथ, जो प्रोकोआगुलेंट उपचार 26,38,39 केप्रभावों के परिमाण और स्थायित्व का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी प्रक्रियाओं को नोवो नॉर्डिस्क ए / एस में पशु कल्याण निकाय द्वारा अनुमोदित किया गया है, और डेनिश पशु प्रयोग निरीक्षणालय, डेनिश खाद्य, कृषि और मत्स्य पालन मंत्रालय। अनुकूलित 40 मिनट विधि में डिजाइन (चित्रा 1) में संज्ञाहरण और खुराक का समय शामिल है। इस प्रक्रिया के लिए 10-16 सप्ताह की आयु के बीच दोनों लिंगों के हीमोफिलिक चूहों की आवश्यकता होती है।

1. अध्ययन से पहले तैयारी

  1. सही सांद्रता में खुराक समाधान तैयार करें।
  2. पानी के स्नान और 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्मी शुरू करें। खारा (0.9% एनएसीएल) के साथ रक्त संग्रह के लिए 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब भरें।
  3. प्रयोग की शुरुआत से कम से कम 15 मिनट पहले गर्म बेस प्लेट में छेद में 15 एमएल खारा ट्यूब रखें।
  4. चूहों की पहचान करें और उनका वजन रिकॉर्ड करें। चूहों को आवश्यकता से अधिक संभालने से बचें क्योंकि यह तनाव पैदा कर सकता है और अध्ययन को प्रभावित कर सकता है।
  5. आगे बढ़ने से पहले फ्यूम हुड में वर्कस्टेशन तैयार करें ताकि सब कुछ पहुंच के भीतर हो: नैपकिन, पूंछ धारक, धुंध, सिरिंज, स्केलपेल, स्टॉपवॉच और रक्त प्रवाह संकेतन पेपर।
  6. हीटिंग प्लेट पर पूंछ के निशान और कटिंग ब्लॉक रखें - ठंडे ब्लॉक नसों को अनुबंधित करेंगे और इस तरह रक्तस्राव को प्रभावित करेंगे।

2. संज्ञाहरण

  1. एक धूआं हुड के अंदर आइसोफ्लूरेन संवेदनाहारी प्रक्रिया का संचालन करें।
  2. मिनट प्रवाह के साथ संज्ञाहरण कक्ष में 30% ओ2/70% एन2ओ में शुरू में 5% आइसोफ्लूरेन के लिए गैस वाष्पीकरण सेट करें। संज्ञाहरण कक्ष को भरने के लिए पर्याप्त समय दें (कक्ष की मात्रा और गैस प्रवाह दर के आधार पर लगभग 5 मिनट)। तेजी से प्रेरण सुनिश्चित करें (एक मिनट से कम)।
  3. चूहों को संज्ञाहरण कक्ष में रखें जब तक कि वे चेतना खो न दें।
    नोट: यह एक मिनट या उससे कम समय के भीतर होना चाहिए यदि कक्ष पर्याप्त रूप से भरा हुआ है।
  4. पेडल रिफ्लेक्स (फर्म पैर की अंगुली चुटकी) के लिए दर्दनाक प्रतिक्रिया की अनुपस्थिति से उचित संवेदनाहारी सुनिश्चित करें।
  5. हीटिंग प्लेट पर चूहों प्लेस, सुनिश्चित करें कि नाक नाक शंकु में है।
  6. संज्ञाहरण को 30% ओ 2/70% एन2 ओ में2% आइसोफ्लूरेन के रखरखाव स्तर तक कम करें और गर्मी के नुकसान को कम करने के लिए चूहों के ऊपर एक प्लास्टिक कवर रखें। संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए एक उपयुक्त आंख मरहम लागू करें।
  7. पूंछ के निशान ब्लॉक का उपयोग करके पूंछ को 2.5 मिमी के व्यास पर चिह्नित करें। ब्लॉक में भट्ठा में पूंछ को मजबूर न करें - इसे स्नगली फिट होना चाहिए (पूरक चित्रा 1)
  8. अंतःशिरा (यानी) खुराक के लिए इष्टतम है कि एक गर्म पूंछ नस सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 5 मिनट के लिए खारा ट्यूब में पूंछ रखें।

3. परीक्षण समाधान की खुराक

  1. एक संज्ञाहरण मुखौटा में नाक के साथ पूंछ धारक में एक माउस रखें।
  2. ब्याज के यौगिक के साथ जानवर खुराक (इस मामले में, आरएफवीआईआईआई) और तुरंत स्टॉपवॉच (टी = 0) शुरू करें।
  3. नमकीन ट्यूब में पूंछ के साथ हीटिंग प्लेट पर माउस वापस रखें। अन्य चूहों के साथ प्रक्रिया को दोहराएं।

4. पूंछ नस ट्रांससेक्शन प्रदर्शन

  1. खुराक के ठीक 5 मिनट बाद पूंछ नस ट्रांससेक्शन करें। काटने ब्लॉक में पूंछ प्लेस और नस (पूरक चित्रा 2) बेनकाब करने के लिए 90 ° बारी।
  2. नस पर कटौती करें जहां से परीक्षण समाधान खुराक दिया गया था।
  3. रक्तस्राव बनाने के लिए पूंछ को पकड़ने वाले कटिंग ब्लॉक के भट्ठा के माध्यम से # 11 स्केलपेल ब्लेड खींचें। स्टॉपवॉच को रीसेट करें और पूंछ को तुरंत नमकीन पर वापस करें।

5. अवलोकन समय और चुनौतियां

  1. रक्तस्राव का निरीक्षण करें और 40 मिनट में रक्तस्राव की शुरुआत और स्टॉप को एनोटेट करें; इसे रक्त प्रवाह संकेतन पेपर पर एनोटेट करें।
    नोट: रक्तस्राव का यह दृश्य मूल्यांकन व्यक्तिपरकता के कारण थोड़ा भिन्न हो सकता है।
  2. कटौती करने के बाद प्राथमिक रक्तस्राव 3 मिनट के भीतर बंद हो जाना चाहिए। यदि ऐसा नहीं है, तो माउस को अयोग्य घोषित करें, इच्छामृत्यु दें, और प्रतिस्थापित करें (प्राथमिक रक्तस्राव को रोकने में विफलता बहुत गंभीर चोट या प्राथमिक हेमोस्टेसिस की कमी का संकेत दे सकती है, जैसा कि वीडब्ल्यूएफ केओ चूहों में है)।
  3. यदि 10 मिनट, 20 मिनट और 30 मिनट के बाद चोट पर कोई रक्तस्राव नहीं होता है, तो चरण 4-5 में वर्णित पूंछ कटौती को चुनौती दें।
  4. पानी के स्नान में रखी एक अलग ट्यूब से गर्म खारा में भिगोए गए धुंध झाड़ू का उपयोग करें। पूंछ को नमकीन से बाहर उठाएं और पूंछ के कट पर एक डिस्टल दिशा में गीले धुंध के साथ धीरे-धीरे दो बार पोंछें।
  5. प्रत्येक चुनौती के बाद, तुरंत पूंछ को फिर से खारा ट्यूब में डुबोएं।
  6. टी = 40 मिनट में, खारा ट्यूब से पूंछ को हटाकर रक्त संग्रह को रोकें।

6. रक्त नमूनाकरण

  1. टी = 40 मिनट के बाद, सुपरऑर्बिटल नस से रक्त के नमूने प्राप्त करें।

7. इच्छामृत्यु

  1. ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा चूहों को इच्छामृत्यु जबकि अभी भी पूर्ण संज्ञाहरण के तहत।

8. नमूनों का उपचार

  1. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 4000 x g पर खारा के साथ 15 एमएल रक्त संग्रह ट्यूबों अपकेंद्रित्र।
  2. 15 एमएल ट्यूबों से सतह पर तैरनेवाला त्यागें, एरिथ्रोसाइट्स (आरबीसी) समाधान के 2-14 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें, और फिर इसे हल्के कॉफी रंग तक पहुंचने तक पतला करें।
  3. कुल मात्रा (रक्त की मात्रा + ट्यूब पर स्नातक के निशान का उपयोग करके जोड़े गए एरिथ्रोसाइट्स (आरबीसी) लाइजिंग समाधान की मात्रा) पर ध्यान दें।
  4. एक हीमोग्लोबिन ट्यूब में कमजोर पड़ने के 2 एमएल को स्थानांतरित करें और हीमोग्लोबिन विश्लेषण तक इसे ठंडा करें।
  5. खारा में हीमोग्लोबिन एकाग्रता को मापकर रक्त हानि का निर्धारण करें। माइक्रोप्लेट रीडर (सामग्री की तालिका) पर 550 एनएम पर अवशोषण को मापें।
  6. मानव हीमोग्लोबिन (सामग्री की तालिका) से तैयार एक मानक वक्र का उपयोग करके अवशोषण को एनएमओएल हीमोग्लोबिन में परिवर्तित करें और आरबीसी लाइज़िंग समाधान के साथ कमजोर पड़ने के लिए सही है।

9. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. उपयुक्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें। यहां ग्राफपैड प्रिज्म सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया गया। अध्ययनों की एक श्रृंखला में, निम्नलिखित सांख्यिकीय विधियों को अच्छा प्रदर्शन करने के लिए पाया गया था।
    नोट: रक्त हानि, रक्तस्राव समय, जोखिम, प्लेटलेट काउंट और हेमटोक्रिट का विश्लेषण करने के लिए; ब्राउन-फोर्सिथ और वेल्च एनोवा परीक्षण का उपयोग किया गया था, (क्योंकि डेटा निरंतर थे लेकिन अवशेषों की विचरण समरूपता के बिना) कई तुलनाओं के लिए समायोजित करने के लिए डनेट के परीक्षण को लागू करना। एक पियर्सन परीक्षण का उपयोग रक्तस्राव के समय, रक्त हानि और खुराक के बीच सहसंबंधों के परीक्षण के लिए किया गया था। ईडी50 मानों को निर्धारित करने के लिए, एक चार-पैरामीटर व्युत्क्रम लॉग (खुराक) प्रतिक्रिया समीकरण रक्तस्राव- और रक्त हानि डेटा के लिए फिट किया गया था। लिंग प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए, दो-तरफा एनोवा परीक्षण का उपयोग किया गया था, जो कई तुलनाओं के लिए समायोजित करने के लिए बोनफेरोनी सुधार लागू करता था। महत्व स्तर को पी < 0.05 के रूप में परिभाषित किया गया था। डेटा एसईएम के साधन के रूप ± प्रदर्शित किया जाता है।

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Representative Results

अनुकूलित मॉडल की प्रयोज्यता का आकलन करने के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पुनः संयोजक कारक आठवीं प्रतिस्थापन चिकित्सा (आरएफवीआईआईआई) के साथ प्रशासित एफ 8-केओ (सी 57 बीएल आनुवंशिक पृष्ठभूमि) चूहों में एक अध्ययन किया गया था; चार अलग-अलग खुराक का परीक्षण किया गया: 1 आईयू / किग्रा, 5 आईयू / किग्रा, 10 आईयू / किग्रा, और 20 आईयू / किग्रा। इसके अलावा, हमने मॉडल में प्रतिक्रिया सीमा का आकलन करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण समूह के रूप में सी 57 बीएल चूहों का उपयोग करके एफ 8-केओ चूहों और जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) समूह में संबंधित वाहन (नकारात्मक) नियंत्रण का परीक्षण किया।

अनुकूलित प्रोटोकॉल के बाद, वाहन समूह की तुलना में आरएफवीआईआईआई उपचार समूहों के लिए रक्त हानि में महत्वपूर्ण कमी आई थी। इसके अतिरिक्त, वाहन समूह (चित्रा 2) की तुलना में 5 आईयू / किग्रा, 10 आईयू / किग्रा, और 20 आईयू / किग्रा उपचार समूहों में रक्तस्राव के समय में कमी देखी गई थी। डब्ल्यूटी चूहों में, कुल रक्त हानि 201.8-841.9 एनएमओएल एचजीबी (95% सीआई) और वाहन चूहों में 5335 से 7148 एनएमओएल एचजीबी (95% सीआई) तक थी। पूरे रक्त के 1000 एनएमओएल एचजीबी ~ 125 μL की अनुमानित तुल्यता के बाद, वाहन-उपचारित चूहों में औसत रक्तस्राव 780.25 μL था, जबकि 20 आईयू / किग्रा समूह पर 89.95 μL था। इस प्रकार, 20 आईयू / किग्रा की खुराक ने रक्तस्राव को पूरी तरह से सामान्य कर दिया, और 10 आईयू / किग्रा के प्रशासन ने एक महत्वपूर्ण प्रभाव डाला, जिससे डब्ल्यूटी रेंज (चित्रा 3) की ऊपरी सीमा तक रक्त हानि कम हो गई। डब्ल्यूटी चूहों का रक्तस्राव समय 0.98-9.16 मिनट (95% सीआई) से लेकर, और 10 आईयू / किग्रा और 20 आईयू / किग्रा के खुराक के स्तर ने इस सीमा के भीतर रक्तस्राव के समय को कम कर दिया। रक्त हानि और रक्तस्राव समय के बीच एक मजबूत सहसंबंध संयुक्त डेटा (आर = 0.9357, पी < 0.0001) (चित्रा 4) में मनाया गया था।

मॉडल की संवेदनशीलता का मूल्यांकन करने के लिए, एक चार-पैरामीटर व्युत्क्रम लॉग (खुराक) प्रतिक्रिया समीकरण रक्त हानि और रक्तस्राव समय टिप्पणियों के लिए फिट किया गया था, और रक्त हानि पर और रक्तस्राव के समय के लिए आरएफवीआईआईआई प्रशासन का एक स्पष्ट खुराक-निर्भर प्रभाव मनाया गया था (चित्रा 3)। रक्त हानि और रक्तस्राव समय के लिए अनुमानित ईडी50 मूल्य क्रमशः 2.41 ± 1.69 आईयू / किग्रा और 2.55 ± 2.80 आईयू / किग्रा थे।

यह स्पष्ट करने के लिए कि मॉडल में रक्तस्राव कैसे होता है, सभी रिकॉर्ड किए गए रक्तस्राव एपिसोड को प्रत्येक व्यक्तिगत माउस (चित्रा 5) द्वारा रक्तस्राव की लंबाई और संख्या का दृश्य प्रदान करने के लिए प्लॉट किया गया है। प्राथमिक रक्तस्राव सभी समूहों में बहुत समान है। अधिकांश हीमोफिलिक वाहन समूह 20 मिनट में दूसरी चुनौती से पहले फिर से खून बहना शुरू कर देते हैं, और इनमें से लगभग आधे जानवरों के लिए, पहली चुनौती के बाद रक्तस्राव बंद नहीं होता है। अंत में, जैसा कि वर्णित है, आरएफवीआईआईआई उपचार ने वाहन की तुलना में इलाज किए गए एफ 8-केओ चूहों में रक्तस्राव एपिसोड की लंबाई को कम कर दिया, पहले से ही सबसे कम खुराक पर एक अवलोकन योग्य परिवर्तन के साथ। उच्चतम खुराक के स्तर पर, अधिकांश चूहों को चुनौती देने के बाद केवल संक्षेप में खून बह रहा था।

प्लाज्मा आरएफवीआईआईआई एकाग्रता को ल्यूमिनेसेंट ऑक्सीजन चैनलिंग परख (एलओसीआई) द्वारा एचएफवीआईआईआई और एनालॉग्स का पता लगाने के लिए मापा गया था ताकि यह सत्यापित किया जा सके कि रक्त हानि और रक्तस्राव के समय को कम करने में मनाया गया प्रभाव एकाग्रता-निर्भर था (चित्रा 6)। प्रत्येक समूह के भीतर परिवर्तनशीलता है (मतलब सीवी 46%), लेकिन फिर भी, समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर देखा जा सकता है, इस प्रकार पुष्टि करता है कि रक्त हानि और रक्तस्राव के समय में मनाया गया प्रभाव एफवीआईआईआई की प्लाज्मा एकाग्रता पर निर्भर है। सभी वाहन इलाज चूहों परख (2 यू / एल) के लिए मात्रा की निचली सीमा से नीचे मापा जाता है और इस मूल्य के साथ प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। डब्ल्यूटी चूहों को मापा नहीं गया था क्योंकि लागू एफवीआईआईआई परख मानव एफवीआईआईआई का पता लगाने के लिए विशिष्ट है।

प्लेटलेट काउंट और हेमटोक्रिट रक्तस्राव के बाद एकत्र किए गए रक्त के नमूनों का उपयोग करके सभी समूहों के लिए निर्धारित किए गए थे (चित्रा 7 और एक हेमेटोलॉजिकल विश्लेषक (सामग्री की तालिका) के साथ मापा जाता है। प्लेटलेट काउंट में समूहों के बीच कोई भिन्नता नहीं थी, यह दर्शाता है कि प्लेटलेट संख्या प्रभावित नहीं होती है, और चूहे, इसलिए, प्राथमिक हेमोस्टेसिस में सक्षम रहते हैं। हेमटोक्रिट माप के लिए, मध्यम और उच्च एफवीआईआईआई खुराक (5 आईयू / किग्रा, 10 आईयू / किग्रा, और 20 आईयू / किग्रा) प्राप्त करने वाले जानवरों में सामान्य स्तर देखा गया था, जबकि वाहन और 1 आईयू / किग्रा उपचारित समूहों (डब्ल्यूटी जानवरों की तुलना में) में काफी कम स्तर देखा गया था। यह भारी रक्तस्राव के बाद हीमोफिलिक जानवरों में लगातार अवलोकन है।

शास्त्रीय रूप से, जानवरों के अध्ययन में जानवरों के केवल एक लिंग (आमतौर पर नर) का उपयोग किया गया है, और यह टीवीटी उत्तरजीविता मॉडल 8,9,11,12 के लिए भी वर्णित है। भविष्य के अध्ययनों (प्रजनन और अध्ययन के लिए) में आवश्यक हीमोफिलिक चूहों की कुल संख्या को कम करने का प्रयास करते हुए, दोनों लिंगों का उपयोग किया गया था। इस अनुकूलित मॉडल (चित्रा 8) में लिंग के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, रक्त हानि और रक्तस्राव समय परिणाम दोनों कारकों के रूप में लिंग और खुराक के साथ दो-तरफा एनोवा विश्लेषण के अधीन थे। इस विश्लेषण में, rFVIII खुराक का प्रभाव सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था (पी < 0.0001), लेकिन माउस लिंग ने परिणामों (पी 0.35) को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं किया, और मापदंडों के बीच कोई महत्वपूर्ण बातचीत नहीं मिली, यह दर्शाता है कि उपचार की प्रतिक्रियाएं लिंगों के बीच भिन्न नहीं थीं।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक सेटअप के अस्थायी डिजाइन। पूंछ शिरा ट्रांससेक्शन (टीवीटी) से पहले चरण में संज्ञाहरण प्रेरण, खारा में पूंछ को गर्म करना और खुराक शामिल है। टीवीटी चोट के बाद, संज्ञाहरण के तहत रक्तस्राव की निगरानी के 40 मिनट, हर 10 मिनट में बाद की चुनौतियों के साथ, प्रदर्शन किया जाता है। प्रायोगिक प्रक्रिया रक्त के नमूनों और इच्छामृत्यु के संग्रह द्वारा निष्कर्ष निकाली जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: अंतःशिरा प्रशासन के बाद आरएफवीआईआईआई का प्रभाव। एफ 8-केओ चूहों के कुल रक्त हानि (बाएं पैनल) और कुल रक्तस्राव समय (दाएं पैनल)। प्रत्येक माउस को व्यक्तिगत टिप्पणियों और माध्य ± एसईएम के रूप में दिखाया गया है। आरएफवीआईआईआई की विभिन्न परीक्षण खुराक एक्स-अक्ष में दर्शाई जाती हैं। कई तुलनाओं के लिए समायोजित करने के लिए डनेट के परीक्षण को लागू करने वाले ब्राउन-फोर्सिथ और वेल्च एनोवा द्वारा डेटा का विश्लेषण किया गया था। पी < 0.0001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: रक्त हानि और रक्तस्राव समय के लिए खुराक-प्रतिक्रिया घटता है। रक्त हानि (बाएं पैनल) और रक्तस्राव का समय (दायां पैनल)। ग्रे क्षेत्र 6 अनुपचारित जंगली प्रकार सी 57 बीएल / 6 चूहों के मूल्यों से 95% सीआई का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: रक्त हानि और रक्तस्राव समय के लिए सहसंबंध साजिश। आर2 = 0.8755, पी < 0.0001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: जंगली प्रकार, वाहन, 1 आईयू / किग्रा, 5 आईयू / किग्रा, 10 आईयू / किग्रा, और 20 आईयू / किग्रा आरएफवीआईआईआई उपचारित चूहों में व्यक्तिगत रक्तस्राव प्रोफाइल। प्रत्येक पंक्ति एक माउस के रक्तस्राव प्रोफ़ाइल का प्रतिनिधित्व करती है, जबकि प्रत्येक बिंदीदार पट्टी एक रक्तस्राव प्रकरण का प्रतिनिधित्व करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: आरएफवीआईआईआई के लिए एक्सपोजर। प्लाज्मा में एफवीआईआईआई एकाग्रता को मानव एफवीआईआईआई का पता लगाने के लिए ल्यूमिनेसेंट ऑक्सीजन चैनलिंग परख (एलओसीआई) द्वारा मापा गया था। वाहन चूहों मात्रात्मकता (एलएलओक्यू) की निचली सीमा के तहत थे और इसलिए एलएलओक्यू मूल्य (2 यू / एल) के साथ प्लॉट किए गए थे। डब्ल्यूटी जानवरों को मापा नहीं गया था क्योंकि लागू एफवीआईआईआई परख मानव एफवीआईआईआई का पता लगाने के लिए विशिष्ट है। आरएफवीआईआईआई और डब्ल्यूटी नियंत्रण की विभिन्न परीक्षण खुराक एक्स-अक्ष में दर्शाई जाती हैं। ** पी < 0.01, *** पी < 0.001 और **** पी < 0.0001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: हेमेटोलॉजिकल डेटा। एफ 8-केओ चूहों के प्लेटलेट काउंट (बाएं पैनल) और हेमटोक्रिट (दाएं पैनल) को एसईएम के साथ व्यक्तिगत टिप्पणियों के रूप में दिखाया गया है। आरएफवीआईआईआई और डब्ल्यूटी नियंत्रण की विभिन्न परीक्षण खुराक एक्स-अक्ष पर दर्शाई जाती हैं। कई तुलनाओं के लिए समायोजित करने के लिए डनेट के परीक्षण को लागू करने वाले ब्राउन-फोर्सिथ और वेल्च एनोवा द्वारा डेटा का विश्लेषण किया गया था। ** पी 0.01 < और *** पी < 0.001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्र 8. लिंग का प्रभाव। उपचार द्वारा वर्गीकृत रक्त हानि (बाएं पैनल) और रक्तस्राव समय (दाएं पैनल) को एसईएम ± मतलब के साथ व्यक्तिगत टिप्पणियों के रूप में दिखाया गया है। डेटा का विश्लेषण दो-तरफा एनोवा द्वारा कई तुलनाओं के लिए समायोजित करने के लिए बोनफेरोनी सुधार को लागू करने के लिए किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ईडी 50 रक्तस्राव समय (आईयू / ईडी 50 रक्त हानि (आईयू / ईडी 50 उत्तरजीविता (आईयू /
संज्ञाहरण के तहत मॉडल अनुकूलित पूंछ नस ट्रांससेक्शन मॉडल 2.6 ± 2.8 2.4 ± 1.7 प्रासंगिक नहीं है
वेना सैफेना मॉडल30 8.1 ± 2.2 5.1 ± 2.1 प्रासंगिक नहीं है
मध्यम पूंछ क्लिप (एल = 3 मिमी)27 रिपोर्ट नहीं की गई 4.6 ± 0.5 प्रासंगिक नहीं है
मध्यम पूंछ क्लिप (एल = 4 मिमी)28 39 28 प्रासंगिक नहीं है
मध्यम पूंछ क्लिप (एल = 4 मिमी)20 रिपोर्ट नहीं की गई 53 प्रासंगिक नहीं है
उत्तरजीविता मॉडल पूंछ नस ट्रांससेक्शन उत्तरजीविता मॉडल36 रिपोर्ट नहीं की गई रिपोर्ट नहीं की गई 58
पूंछ नस ट्रांससेक्शन उत्तरजीविता मॉडल10 रिपोर्ट नहीं की गई रिपोर्ट नहीं की गई 21

तालिका 1: ईडी50 मान। "चूहों में हीमोफिलिया अध्ययन के लिए विभिन्न उपलब्ध रक्तस्राव मॉडल के ईडी50 मूल्यों की तुलना"." डेटा उद्धृत लेखों [संदर्भ सुपरस्क्रिप्ट] से निकाला जाता है और ईडी50 (आईयू /

पूरक चित्रा 1: टेम्पलेट को मापना। एल्यूमीनियम में उत्पादित। आकार विनिर्देशों: 20 मिमी x 40 मिमी x 10 मिमी (एल एक्स डब्ल्यू एक्स एच)। नाली: 2.5 मिमी गहराई और 2.5 मिमी चौड़ाई; त्रिज्या 1.25 मिमी. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: टेम्पलेट काटना। स्टेनलेस स्टील में उत्पादित। आकार विनिर्देशों: 20 मिमी x 40 मिमी x 10 मिमी (एल एक्स डब्ल्यू एक्स एच)। नाली: 3 मिमी गहराई और 3 मिमी चौड़ाई; त्रिज्या 1.5 मिमी . कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

पूंछ नस ट्रांससेक्शन (टीवीटी) की इस अनुकूलित विधि में टीवीटी उत्तरजीविता विधि की तुलना में कई फायदे हैं। जानवरों को पूरे अध्ययन अवधि के लिए पूरी तरह से संवेदनाहारी किया जाता है, जो माउस हैंडलिंग को आसान बनाता है और जानवरों की भलाई को बढ़ाता है। इसके अलावा, टीवीटी उत्तरजीविता मॉडल के विपरीत, रातोंरात अवलोकन की आवश्यकता नहीं है, और यह अनुकूलित मॉडल रक्त हानि को मापने और 40 मिनट से अधिक सटीक रक्तस्राव समय का अवलोकन करने की संभावना प्रदान करता है। इसके अलावा, जागरूक जानवरों में रक्तस्राव की लंबी अवधि बहिष्कार से मृत्यु का कारण बन सकती है, जिससे जानवरों में दर्द और संकट और शायद तनाव हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप संभावित रूप से भिन्नता में वृद्धि हो सकतीहै 14. रक्त हानि और रक्तस्राव के समय को सफलतापूर्वक चिह्नित किया गया है और समापन बिंदुओं के रूप में मान्य किया गया है, मृत्यु या निकट-मृत्यु के समय की जगह। वास्तविक पूंछ की चोट को अच्छी तरह से परिभाषित और मानकीकृत किया गया है क्योंकि यह टीवीटी करने के लिए एक कटिंग ब्लॉक गाइड का उपयोग करता है, एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कटौती हासिल करता है, प्रक्रिया की कठिनाई और तकनीकी परिवर्तनशीलता को कम करता है। इसलिए, उच्च मॉडल मजबूती प्राप्त की जा सकती है, जिससे आवश्यक जानवरों की संख्या कम हो जाती है। इसके अलावा, डेटा ने प्रदर्शित किया है कि नर और मादा चूहों दोनों का उपयोग करना संभव है, इस प्रकार 3 आर सिद्धांतों के अनुसार, नस्ल के जानवरों की कुल संख्या को कम करना। इन टिप्पणियों के साथ, एक प्रवृत्ति है कि मादा चूहों को थोड़ा कम खून बहता है और उच्च रक्तस्राव वाले समूहों में थोड़ा अधिक भिन्न होता है, लेकिन कम रक्तस्राव वाले समूहों में नहीं। कम रक्त हानि के उपाय छोटे आकार वाली महिलाओं से जुड़े हो सकते हैं, और इसलिए समान आयु वर्ग के पुरुषों की तुलना में कम रक्त की मात्रा।

हीमोफिलिक रोगियों में सहज रक्तस्राव आमतौर पर आंतरिक होते हैं, विशेष रूप से मस्कुलोस्केलेटल, नरम ऊतक और श्लेष्म रक्तस्राव शामिल होते हैं, जबकि बाहरी चोटें (जैसे मामूली कटौती) विस्तारित रक्तस्राव का सबसे आम कारण नहीं हैं, हालांकि अधिक गंभीर कटौती और आघात जीवन के लिए खतरा हो सकता है40,41। यह अनुकूलित मॉडल शिरापरक-केवल रक्तस्राव को प्रेरित करता है, जबकि अन्य मॉडल, जैसे पूंछ क्लिप, धमनी-शिरापरक रक्तस्राव के मिश्रण को प्रेरित करते हैं। चूंकि वर्णित मॉडल एक शिरापरक-केवल मॉडल है, इसलिए इस टीवीटी मॉडल में प्रोकोआगुलेंट खुराक-प्रभाव अधिक गंभीर धमनी की चोट में प्रभाव को प्रतिबिंबित नहीं कर सकता है; इस प्रकार, अन्य रक्तस्राव मॉडल का उपयोग किया जाना चाहिए यदि ऐसे रक्तस्राव फोकस में हैं।

जैसा कि व्यक्तिगत रक्तस्राव प्रोफ़ाइल द्वारा दिखाया गया है, प्राथमिक रक्तस्राव सभी समूहों में बहुत समान है जो दर्शाता है कि प्राथमिक हेमोस्टेसिस, यानी, सक्रिय प्लेटलेट्स का एकत्रीकरण, हीमोफीलिया ए सेटिंग42 में बरकरार है। एक स्थिर चोट में, यहां तक कि गंभीर हीमोफिलिया के तहत, प्लेटलेट एकत्रीकरण रक्तस्राव को कम करने के लिए पर्याप्त हो सकता है। इस कारण से, अनुभवजन्य अध्ययनों के माध्यम से, हमने पाया है कि सक्रिय प्लेटलेट्स के समुच्चय को बाधित करने के लिए हर 10 मिनट में रक्तस्राव की चुनौती को प्रेरित करना प्रोटोकॉल में एक आवश्यक कदम है, जो कार्यात्मक जमावट से फाइब्रिन पीढ़ी के बिना भी रक्तस्राव को रोकने के लिए पर्याप्त मजबूत हो सकता है। चूंकि पूरी तरह से संवेदनाहारी चूहे आगे नहीं बढ़ते हैं और शारीरिक रूप से चोट को चुनौती नहीं दे सकते हैं क्योंकि यह गैर-संवेदनाहारी टीवीटी उत्तरजीविता मॉडल में होता है, इसलिए रक्तस्राव को कम करने से अकेले प्लेटलेट एकत्रीकरण को रोकने के लिए चुनौतीपूर्ण कदमों को पेश करना आवश्यक था। कुछ अनुपचारित हीमोफिलिक चूहों ने चुनौती से पहले अनायास फिर से खून बहाया, लेकिन पहली चुनौती के बाद, अधिकांश अनुपचारित हीमोफिलिक चूहों में सहज पुन: रक्तस्राव होता है, और दूसरी चुनौती के बाद, कई प्रयोग के अंत तक लगातार खून बहते हैं। जैसा कि अपेक्षित था, डब्ल्यूटी चूहों की तुलना में वाहन एफ 8-केओ चूहों में रक्तस्राव में वृद्धि हुई थी। आरएफवीआईआईआई की बढ़ी हुई खुराक के साथ इलाज किए गए चूहों ने रक्त हानि और रक्तस्राव के समय दोनों में खुराक-निर्भर कमी दिखाई। किग्रा और उससे ऊपर की खुराक (वाहन-उपचारित चूहों की तुलना में) पर रक्तस्राव पर महत्वपूर्ण प्रभाव देखा गया था। दो उच्चतम खुराक ने रक्तस्राव को जंगली प्रकार के रक्तस्राव प्रतिक्रिया के काफी करीब के स्तर तक कम कर दिया, जो रक्तस्राव के सामान्यीकरण या निकट-सामान्यीकरण का संकेत देता है।

तालिका 1 में, हम अध्ययन किए गए समापन बिंदुओं द्वारा वर्गीकृत कई रक्तस्राव मॉडल के लिए विभिन्न ईडी50 मूल्यों की तुलना प्रस्तुत करते हैं। इस अनुकूलित मॉडल में, हमने रक्त हानि और रक्तस्राव समय के लिए तुलनीय ईडी50 मूल्यों (क्रमशः 2.4 ± 1.7 आईयू / किग्रा और 2.6 ± 2.8 आईयू / किग्रा) का अवलोकन किया। आरएफवीआईआईए का अध्ययन करने वाले एक ही मॉडल का उपयोग करते हुए, रक्त हानि और रक्तस्राव के समय के लिए ईडी50 मान क्रमशः 0.42 मिलीग्राम / किग्रा और 0.39 मिलीग्राम / किग्रा थे। यह संज्ञाहरण के तहत पहले वर्णित रक्तस्राव मॉडल की तुलना में औषधीय हस्तक्षेप के लिए अधिक संवेदनशीलता है, जैसे कि पूंछ क्लिप मॉडल, एफवीआईआईआई ईडी50 के साथ 4.6 ± 0.5 आईयू / किग्रा27, 28 आईयू / किग्रा28, और 53 आईयू / किग्रा20 के रक्त हानि के लिए। इसके अलावा, विभिन्न पूंछ क्लिप मॉडल20,27,28 में ईडी50 मूल्यों की एक उच्च परिवर्तनशीलता है। संज्ञाहरण के तहत एक और मॉडल गंभीर पूंछ क्लिप मॉडल है। यह एक तेज़ विधि है क्योंकि अवलोकन अवधि केवल 20 मिनट है, लेकिन यह प्रोकोआगुलेंट गतिविधि के प्रति कम संवेदनशील है। एफवीआईआईआई के 200 आईयू / किग्रा से अधिक खुराक वाहन-उपचारित जानवरों की तुलना में रक्त हानि की सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण कमी प्राप्त करने के लिए आवश्यक थे25. वेना सैफेना मॉडल30 में, रक्तस्राव के समय के लिए ईडी50 मूल्य 8.1 ± 2.2 आईयू / किग्रा था, और औसत रक्त हानि के लिए ईडी50 5.1 ± 2.1 आईयू / किग्रा था, दोनों मापदंडों के संबंध में हमारे परिष्कृत मॉडल की तुलना में भी कम संवेदनशील था। इसके अलावा, इस मॉडल को पोत की चोट और कई दोहराए गए हस्तक्षेपों को करने के लिए नाजुक काम की आवश्यकता होती है, जो यदि प्रजनन रूप से नहीं किया जाता है, तो परिणाम को प्रभावित कर सकता है।

पारंपरिक टीवीटी उत्तरजीविता मॉडल में, खुराक के बाद 24 घंटे की अवधि के लिए जीवित रहने का मूल्यांकन किया जाता है, जिसके दौरान रक्तस्राव या फिर से रक्तस्राव किसी भी समय हो सकता है। इस प्रकार, टीवीटी उत्तरजीविता मॉडल में प्रभावकारिता के लिए उपचार के प्रोकोआगुलेंट प्रभाव को कम से कम 24-घंटे अवलोकन अवधि के बहुमत तक जारी रखने की आवश्यकता होती है। यहां प्रस्तुत विधि में, हम खुराक के बाद 5 मिनट और 40 मिनट के बीच तीव्र प्रभाव का आकलन करते हैं; इस प्रकार, ईडी50 मूल्यों की सीधी तुलना स्थापित करना मुश्किल है क्योंकि अवलोकन अवधि के उत्तरार्ध के दौरान हेमोस्टैटिक कवरेज बनाए रखने के लिए उत्तरजीविता मॉडल में उच्च खुराक की आवश्यकता होगी। हालांकि, यदि वांछित है, तो अनुकूलित टीवीटी मॉडल का उपयोग खुराक और रक्तस्राव प्रक्रिया के बीच देरी शुरू करके हेमोस्टैटिक कवरेज की अवधि का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। यह हमारे अनुकूलित टीवीटी मॉडल के पिछले संस्करण के लिए वर्णित किया गया है जहां खुराक के बाद टीवीटी 24घंटे का प्रदर्शन करने के परिणामस्वरूप असंशोधित आरएफवीआईआईआई26 के लिए लगभग 10-15 आईयू / जैसा कि तालिका 1 में उल्लेख किया गया है, एक समापन बिंदु के रूप में 24-एच अस्तित्व के साथ पूंछ-ट्रांससेक्शन मॉडल में, 21 आईयू / किग्रा 9 के ईडी50 मूल्यों और आरएफवीआईआईआई के 58 आईयू / किग्रा36 की सूचना दी गई है। इसी तरह, पूंछ क्लिप उत्तरजीविता मॉडल8 को भी अपने तीव्र समकक्षों की तुलना में उच्च प्रोकोआगुलेंट खुराक की आवश्यकता होती है।

परिप्रेक्ष्य में, कई अलग-अलग जमावट कारक (एफवीआईआईआई, एफवीआईआईए, फिक्स) और डेरिवेटिव, जिनमें से कुछ अब विपणन किए जाते हैं, का मूल्यांकन विभिन्न हीमोफिलिक माउस उपभेदों 26,38,43,44,45,46,47 का उपयोग करके अनुकूलित मॉडल के साथ किया गया है। हम पहली चुनौती से ठीक पहले, ट्रांससेक्शन के बाद खुराक द्वारा ऑन-डिमांड हस्तक्षेप के अध्ययन के लिए मॉडल को अनुकूलित करने में भी सक्षम हैं। इसके अलावा, हमने सफलतापूर्वक इस मॉडल का उपयोग प्रोकोआगुलेंट गतिविधि (ओस्टरगार्ड एट अल, रक्त में प्रकाशन के लिए स्वीकार किए जाते हैं) के साथ द्वि-विशिष्ट एंटीबॉडी का मूल्यांकन करने के लिए किया है, मानव फिक्स और मानव एफएक्स की खुराक द्वारा प्रजातियों की क्रॉस-रिएक्टिविटी चुनौतियों पर काबू पाने के लिए। यह हीमोफीलिया क्षेत्र में नई दवाओं के विकास में मॉडल की बहुमुखी प्रतिभा और अनुवाद मूल्य को दर्शाता है, जैसे प्लेटलेट-लक्षित रणनीतियां48. एएवी-आधारित या जीनोम संपादन रणनीतियों का मूल्यांकन उन मामलों में भी किया जा सकता है जहां एक सरोगेट है जो चूहों में औषधीय रूप से सक्रिय है। इसलिए, यह अनुकूलित टीवीटी रक्तस्राव मॉडल पूंछ नस ट्रांससेक्शन और पूंछ क्लिप उत्तरजीविता मॉडल का एक विकल्प है, साथ ही संज्ञाहरण के तहत अन्य रक्तस्राव मॉडल के लिए एक मूल्यवान विकल्प है। यह मॉडल उत्तरजीविता मॉडल की तुलना में अधिक मानवीय है और शोधन का एक उदाहरण है क्योंकि जानवरों को दर्द और पीड़ा का अनुभव नहीं होता है। हमारे विचार में, नैदानिक रूप से प्रासंगिक खुराक के स्तर, सापेक्ष तकनीकी सादगी, और समापन बिंदुओं के रूप में मृत्यु / निकट-मृत्यु से बचने की संवेदनशीलता महत्वपूर्ण फायदे हैं।

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Disclosures

लेखक उस समय नोवो नॉर्डिस्क ए / एस के कर्मचारी और / या शेयरधारक थे जब यह शोध किया गया था।

Acknowledgments

एस्तेर ब्लोएम और थॉमस निगार्ड को प्लाज्मा में एफवीआईआईआई के माप के साथ समर्थन के लिए स्वीकार किया जाता है। बो अल्स्टेड को टेम्पलेट को ड्राइंग और मशीनिंग और कटिंग ब्लॉक के लिए स्वीकार किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#11 Scalpel blade Swann-Morton 503
15 mL centrifuge tubes Greiner Bio-One, Austria 188271
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe 320830
Advate Takeda, Japan Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII)
Alcohol pads 70% ethanol Hartmann, Soft-Zellin 999 979
Centrifuge Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech
Cutting template (Stainless steel) Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm
Erythrocytes (RBC) lysing solution Lysebio, ABX Diagnostics 906012
Gauze
Haematological analyser Sysmex CT-2000iv
Heating lamp on stand Phillips IR250
Heating pad with thermostat CMA model 150
Hemoglobin standards and controls - 8.81 mmol / l batch dependent HemoCue, Denmark HemoCue calibrator, 707037 Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH).
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box Sigma Delta Dameca
Isoflurane Baxter 26675-46-7
Magnifier with lights Eschenbach
Measuring template (Aluminum) Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm
Micropipettes + tips Finnpipette
Photometer Molecular Devices Corporation, CA, USA SpectraMax 340 photometer
Prism Software GraphPad, San Diego, CA, USA Version 9.0.1
Saline 0.9% NaCl Fresenius Kabi, Sweden 883264
Special tail marker block for TVT tail cut
Tail holder
Vacuum liquid suction Vacusafe comfort, IBS
Waterbath and thermostat TYP 3/8 Julabo

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References

  1. Bi, L., et al. Targeted disruption of the mouse factor VIII gene produces a model of haemophilia A. Nature Genetics. 10 (1), 119-121 (1995).
  2. Bi, L., et al. Further characterization of factor VIII-deficient mice created by gene targeting: RNA and protein studies. Blood. 88 (9), 3446-3450 (1996).
  3. Stennicke, H. R., et al. A novel B-domain O-glycoPEGylated FVIII (N8-GP) demonstrates full efficacy and prolonged effect in hemophilic mice models. Blood. 121 (11), 2108-2116 (2013).
  4. Shapiro, A. D. Anti-hemophilic factor (recombinant), plasma/albumin-free method (octocog-alpha; ADVATE) in the management of hemophilia A. Vascular Health and Risk Management. 3 (5), 555-565 (2007).
  5. Recht, M., et al. Clinical evaluation of moroctocog alfa (AF-CC), a new generation of B-domain deleted recombinant factor VIII (BDDrFVIII) for treatment of haemophilia A: demonstration of safety, efficacy, and pharmacokinetic equivalence to full-length recombinant factor VIII. Haemophilia. 15 (4), 869-880 (2009).
  6. Miao, C. H., et al. CD4+FOXP3+ regulatory T cells confer long-term regulation of factor VIII-specific immune responses in plasmid-mediated gene therapy-treated hemophilia mice. Blood. 114 (19), 4034-4044 (2009).
  7. Milanov, P., et al. Engineered factor IX variants bypass FVIII and correct hemophilia A phenotype in mice. Blood. 119 (2), 602-611 (2012).
  8. Dumont, J. A., et al. Prolonged activity of a recombinant factor VIII-Fc fusion protein in hemophilia A mice and dogs. Blood. 119 (13), 3024-3030 (2012).
  9. Pan, J., et al. Enhanced efficacy of recombinant FVIII in noncovalent complex with PEGylated liposome in hemophilia A mice. Blood. 114 (13), 2802-2811 (2009).
  10. Liu, T., et al. Improved coagulation in bleeding disorders by Non-Anticoagulant Sulfated Polysaccharides (NASP). Journal of Thrombosis and Haemostasis. 95 (1), 68-76 (2006).
  11. Brooks, A. R., et al. Glycoengineered factor IX variants with improved pharmacokinetics and subcutaneous efficacy. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (9), 1699-1706 (2013).
  12. Baru, M., et al. Factor VIII efficient and specific non-covalent binding to PEGylated liposomes enables prolongation of its circulation time and haemostatic efficacy. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 93 (6), 1061-1068 (2005).
  13. Molina, E. S., Fujita, A., Sogayar, M. C., Demasi, M. A. A quantitative and humane tail bleeding assay for efficacy evaluation of antihaemophilic factors in haemophilia A mice. Haemophilia. 20 (6), 392-398 (2014).
  14. Broze, G. J., Yin, Z. F., Lasky, N. A tail vein bleeding time model and delayed bleeding in hemophiliac mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 85 (4), 747-748 (2001).
  15. Dejana, E., Callioni, A., Quintana, A., de Gaetano, G. Bleeding time in laboratory animals. II - A comparison of different assay conditions in rats. Thrombosis Research. 15 (1-2), 191-197 (1979).
  16. Girard, T. J., Lasky, N. M., Grunz, K., Broze, G. J. Suppressing protein Z-dependent inhibition of factor Xa improves coagulation in hemophilia A. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (1), 149-156 (2019).
  17. Zhang, J. P., et al. Curing hemophilia A by NHEJ-mediated ectopic F8 insertion in the mouse. Genome Biology. 20 (1), 276 (2019).
  18. Sambrano, G. R., Weiss, E. J., Zheng, Y. W., Huang, W., Coughlin, S. R. Role of thrombin signalling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature. 413 (6851), 74-78 (2001).
  19. Tranholm, M., et al. Improved hemostasis with superactive analogs of factor VIIa in a mouse model of hemophilia A. Blood. 102 (10), 3615-3620 (2003).
  20. Mei, B., et al. Rational design of a fully active, long-acting PEGylated factor VIII for hemophilia A treatment. Blood. 116 (2), 270-279 (2010).
  21. Karpf, D. M., et al. Prolonged half-life of glycoPEGylated rFVIIa variants compared to native rFVIIa. Thrombosis Research. 128 (2), 191-195 (2011).
  22. Ivanciu, L., et al. A zymogen-like factor Xa variant corrects the coagulation defect in hemophilia. Nature Biotechnology. 29 (11), 1028-1033 (2011).
  23. Ostergaard, H., et al. Prolonged half-life and preserved enzymatic properties of factor IX selectively PEGylated on native N-glycans in the activation peptide. Blood. 118 (8), 2333-2341 (2011).
  24. Maroney, S. A., et al. Absence of hematopoietic tissue factor pathway inhibitor mitigates bleeding in mice with hemophilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3927-3931 (2012).
  25. Holmberg, H. L., Lauritzen, B., Tranholm, M., Ezban, M. Faster onset of effect and greater efficacy of NN1731 compared with rFVIIa, aPCC and FVIII in tail bleeding in hemophilic mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 7 (9), 1517-1522 (2009).
  26. Johansen, P. B., Tranholm, M., Haaning, J., Knudsen, T. Development of a tail vein transection bleeding model in fully anaesthetized haemophilia A mice - characterization of two novel FVIII molecules. Haemophilia. 22 (4), 625-631 (2016).
  27. Ferrière, S., et al. A hemophilia A mouse model for the in vivo assessment of emicizumab function. Blood. 136 (6), 740-748 (2020).
  28. Elm, T., et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of a new recombinant FVIII (N8) in haemophilia A mice. Haemophilia. 18 (1), 139-145 (2012).
  29. Björkman, S. Prophylactic dosing of factor VIII and factor IX from a clinical pharmacokinetic perspective. Haemophilia. 9, Suppl 1 101-108 (2003).
  30. Pastoft, A. E., et al. A sensitive venous bleeding model in haemophilia A mice: effects of two recombinant FVIII products (N8 and Advate). Haemophilia. 18 (5), 782-788 (2012).
  31. Saito, M. S., et al. New approaches in tail-bleeding assay in mice: improving an important method for designing new anti-thrombotic agents. International Journal of Experimental Pathology. 97 (3), 285-292 (2016).
  32. Liu, Y., Jennings, N. L., Dart, A. M., Du, X. J. Standardizing a simpler, more sensitive and accurate tail bleeding assay in mice. World Journal of Experimental Medicine. 2 (2), 30-36 (2012).
  33. Greene, T. K., et al. Towards a standardization of the murine tail bleeding model. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (12), 2820-2822 (2010).
  34. Cerullo, V., et al. Correction of murine hemophilia A and immunological differences of factor VIII variants delivered by helper-dependent adenoviral vectors. Molecular Therapy. 15 (12), 2080-2087 (2007).
  35. Shi, Q., et al. Factor VIII ectopically targeted to platelets is therapeutic in hemophilia A with high-titer inhibitory antibodies. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1974-1982 (2006).
  36. Parker, E. T., Lollar, P. A quantitative measure of the efficacy of factor VIII in hemophilia A mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 89 (3), 480-485 (2003).
  37. Stokes, W. S. Reducing Unrelieved Pain and Distress in Laboratory Animals Using Humane Endpoints. ILAR Journal. 41 (2), 59-61 (2000).
  38. Stagaard, R., et al. Abrogating fibrinolysis does not improve bleeding or rFVIIa/rFVIII treatment in a non-mucosal venous injury model in haemophilic rodents. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (7), 1369-1382 (2018).
  39. Stagaard, R., et al. Absence of functional compensation between coagulation factor VIII and plasminogen in double-knockout mice. Blood Advances. 2 (22), 3126-3136 (2018).
  40. Bolton-Maggs, P. H., Pasi, K. J. Haemophilias A and B. Lancet. 361 (9371), 1801-1809 (2003).
  41. Lloyd Jones, M., Wight, J., Paisley, S., Knight, C. Control of bleeding in patients with haemophilia A with inhibitors: a systematic review. Haemophilia. 9 (4), 464-520 (2003).
  42. Sixma, J. J., vanden Berg, A. The haemostatic plug in haemophilia A: a morphological study of haemostatic plug formation in bleeding time skin wounds of patients with severe haemophilia A. British Journal of Haematology. 58 (4), 741-753 (1984).
  43. Proulle, V., et al. Recombinant activated factor VII-induced correction of bleeding tendency in genetically engineered von Willebrand disease type 2B mice evaluated using new tail transection bleeding models. International Society on Thrombosis and Haemostasis Congress. , (2017).
  44. Rode, F., et al. Preclinical pharmacokinetics and biodistribution of subcutaneously administered glycoPEGylated recombinant factor VIII (N8-GP) and development of a human pharmacokinetic prediction model. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (6), 1141-1152 (2018).
  45. Holmberg, H., et al. GlycoPEGylated rFVIIa (N7-GP) has a prolonged hemostatic effect in hemophilic mice compared with rFVIIa. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1070-1072 (2011).
  46. Kawecki, C., et al. Posters Abstracts - Thrombin-mediated Activation of Factor VIII is Insufficient to Produce All Necessary Cofactor Activity in vivo. Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3, 1 (2019).
  47. Johansen, P., et al. In vivo effect of recombinant FVIIA (NOVOSEVEN®) and RFIX in a refined tail vein transection bleeding model in mice with haemophilia A and B: PO147-MON. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13, (2015).
  48. Enoksson, M., et al. Enhanced potency of recombinant factor VIIa with increased affinity to activated platelets. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (1), 104-113 (2020).

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