Analyse cytométrique en flux pour l’identification des cellules immunitaires innées et adaptatives du poumon murin

Summary

Dans cette étude, nous présentons un protocole efficace et reproductible pour isoler les populations immunitaires du système respiratoire murin. Nous fournissons également une méthode pour l’identification de toutes les cellules immunitaires innées et adaptatives qui résident dans les poumons de souris saines, en utilisant un panel de cytométrie en flux à base de 9 couleurs.

Abstract

Les voies respiratoires sont en contact direct avec l’environnement extérieur et nécessitent un système immunitaire régulé avec précision pour fournir une protection tout en supprimant les réactions indésirables aux antigènes environnementaux. Les poumons hébergent plusieurs populations de cellules immunitaires innées et adaptatives qui assurent la surveillance immunitaire mais interviennent également dans les réponses immunitaires protectrices. Ces cellules, qui maintiennent le système immunitaire pulmonaire sain en équilibre, participent également à plusieurs conditions pathologiques telles que l’asthme, les infections, les maladies auto-immunes et le cancer. L’expression sélective des protéines de surface et intracellulaires fournit des propriétés immunophénotypiques uniques aux cellules immunitaires du poumon. Par conséquent, la cytométrie en flux joue un rôle déterminant dans l’identification de ces populations cellulaires dans des conditions d’équilibre et pathologiques. Cet article présente un protocole qui décrit une méthode cohérente et reproductible pour identifier les cellules immunitaires qui résident dans les poumons de souris saines dans des conditions d’équilibre. Cependant, ce protocole peut également être utilisé pour identifier les changements dans ces populations cellulaires dans divers modèles de maladie afin d’aider à identifier les changements spécifiques à la maladie dans le paysage immunitaire pulmonaire.

Introduction

Les voies respiratoires murines contiennent un système immunitaire unique responsable de la lutte contre les agents pathogènes et du maintien de l’homéostasie immunitaire. Le système immunitaire pulmonaire se compose de populations cellulaires avec une hétérogénéité significative dans leur phénotype, leur fonction, leur origine et leur emplacement. Les macrophages alvéolaires résidents (AM), provenant principalement de monocytes fœtaux, résident dans la lumière alvéolaire1, tandis que les macrophages interstitiels dérivés de la moelle osseuse (IM) résident dans le parenchyme ^pulmonaire2. Les MESSAGES instantanés peuvent être subclassés par l’expression CD206. Les IM CD206⁺ peuplent la région péribronchique et périvasculaire, tandis que les IM CD206^– sont situés à l’interstitium alvéolaire3. Quelques sous-classifications des GI ont été proposées récemment3,4,5,6. Bien que les MI soient moins étudiées que les AM, des preuves récentes soutiennent leur rôle crucial dans la régulation du système immunitaire du ^poumon7. En outre, CD206 est également exprimé dans AMs8 activé alternativement.

Les cellules dendritiques pulmonaires (DC) sont un autre groupe hétérogène de cellules immunitaires pulmonaires en ce qui concerne leurs propriétés fonctionnelles, leur emplacement et leur origine. Quatre sous-catégories de DC ont été décrites dans les poumons : les DC CD103⁺ conventionnels (également connus sous le nom de cDC1), les DC CD11b⁺ conventionnels (également connus sous le nom de cDC2), les DC dérivés de monocytes (MoDC) et les DC plasmocytoïdes9,10,11,12,13. Les trois premières sous-classes peuvent être définies comme complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) II⁺CD11c⁺9,10,14,15. Les DC plasmocytoïdes expriment le CMH II et sont moyennement positifs pour cd11c, mais expriment des niveaux élevés de B220 et de PDCA-19,13,16. Dans les poumons murins naïfs, les DC CD103 et CD11b sont situés dans l’interstitium des voies respiratoires, tandis que les DC plasmocytoïdes sont situés dans l’interstitium ^{alvéolaire17}.

Deux grandes populations de monocytes résident dans le poumon pendant l’état d’équilibre: les monocytes classiques et les monocytes non classiques. Les monocytes classiques sont Ly6C⁺ et sont essentiels pour la réponse inflammatoire initiale. En revanche, les monocytes non classiques sont Ly6C^– et ont été largement considérés comme des cellules anti-inflammatoires3,16,18. Récemment, une population supplémentaire de monocytes CD64⁺CD16.2⁺ a été décrite, qui proviennent de monocytes Ly6C^– et donnent naissance à CD206⁺ IMs3.

Les éosinophiles apparaissent principalement dans les poumons lors d’une infection à helminthes ou de conditions allergiques. Cependant, il y a un petit nombre d’éosinophiles dans le parenchyme pulmonaire pendant l’état d’équilibre, connus sous le nom d’éosinophiles résidents. Contrairement aux éosinophiles résidents, les éosinophiles inflammatoires se trouvent dans l’interstitium pulmonaire et le lavage broncho-alvéolaire (BAL). Dans les modèles murins d’acariens de la poussière domestique (HDM), les éosinophiles inflammatoires sont recrutés dans les poumons après une stimulation médiée par l’antigène. Il a été proposé que les éosinophiles résidents pourraient avoir un rôle régulateur dans l’allergie en inhibant la sensibilisation de T helper 2 (Th2) à ^HDM19.

Contrairement au reste des cellules myéloïdes pulmonaires, les neutrophiles expriment Ly6G mais pas CD68 et sont caractérisés par une signature de l’immunophénotype CD68-Ly6G⁺16,20,21. Des études de visualisation ont montré qu’à l’état d’équilibre, le poumon réserve un pool de neutrophiles dans le compartiment intravasculaire et héberge un nombre considérable de neutrophiles extravasculaires22. Semblable aux éosinophiles, les neutrophiles ne se trouvent pas dans BAL à l’état d’équilibre; cependant, plusieurs formes de stimulation immunitaire, telles que le défi LPS, l’asthme ou la pneumonie, conduisent les neutrophiles dans la lumière alvéolaire, ce qui entraîne leur présence dans BAL21,22,23.

Un nombre important de cellules CD45⁺ du poumon représentent un tueur naturel (NK), des cellules T et des cellules B et sont négatives pour la plupart des marqueurs myéloïdes24. Dans les poumons de souris naïves, ces trois types de cellules peuvent être identifiés sur la base de l’expression de CD11b et de CMH ^II18. Environ 25% des cellules PULMONAIREs CD45^{+ sont des} cellules B, tandis que le pourcentage de cellules NK est plus élevé dans les poumons que les autres tissus lymphoïdes et non lymphoïdes24,25,26. Parmi les lymphocytes T pulmonaires, une fraction considérable est ^CD4-CD8– et joue un rôle important dans les infections ^{respiratoires26}.

Parce que le poumon héberge un système immunitaire très complexe et unique, plusieurs stratégies de contrôle pour l’identification des cellules immunitaires pulmonaires ont été développées et rapportées16,18,20,27. La stratégie de contrôle décrite ici fournit un moyen complet et reproductible d’identifier jusqu’à 12 populations immunitaires myéloïdes et non myéloïdes pulmonaires différentes à l’aide de 9 marqueurs. Des marqueurs supplémentaires ont été utilisés pour valider les résultats. En outre, une méthode détaillée est fournie pour la préparation d’une suspension unicellulaire qui minimise la mort cellulaire et permet l’identification du profil le plus complet du compartiment cellulaire immunitaire du poumon. Il convient de noter que l’identification des cellules non immunitaires du poumon, telles que les cellules épithéliales (CD45-CD326⁺CD31^–), les cellules endothéliales (CD45-CD326-CD31⁺) et les fibroblastes nécessite une approche ^{différente28,29}. L’identification de ces populations n’est pas incluse dans le protocole et la méthode décrits ici.

Protocol

Toutes les études et expériences décrites dans ce protocole ont été menées selon les directives du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Beth Israel Deaconess Medical Center. Des souris C57BL/6 âgées de six à dix semaines de l’un ou l’autre sexe ont été utilisées pour développer ce protocole. 1. Excision chirurgicale et préparation des tissus Euthanasier la souris par injection intrapéritonéale de 1 mL de tribromoéthanol (prép…

Representative Results

Stratégie de contrôleLa première étape de notre stratégie de contrôle est l’exclusion des débris et des doublets (Figure 1A). Une exclusion prudente des doublets est essentielle pour éviter les populations faussement positives (figure supplémentaire S2). Ensuite, les cellules immunitaires sont identifiées à l’aide de CD45+, un marqueur des cellules hématopoïétiques (Figure 1B). La tache morte viv…

Discussion

L’identification des cellules immunitaires pulmonaires peut être difficile en raison des multiples types de cellules immunitaires résidant dans le poumon et de leurs caractéristiques immunophénotypiques uniques par rapport à leurs homologues résidant dans d’autres tissus. Dans plusieurs conditions pathologiques, des cellules présentant des caractéristiques phénotypiques distinctes apparaissent dans les poumons. Par exemple, les lésions pulmonaires induites par la bléomycine entraînent le recrutement de ma…

Materials

10 mL syringe plunger	EXELINT	26265
18 G needles	BD Precision Glide Needle	305165
21 G needles	BD Precision Glide Needle	305195
50 mL conical tubes	Falcon	3520
70 μm cell strainer	ThermoFisher	22363548
96-well plates	Falcon/corning	3799
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A10492-01
anti-mouse CD11b	Biolegend	101215	For details see Table 2
anti-mouse CD11c	Biolegend	117339 / 117337	For details see Table 2
anti-mouse CD45	Biolegend	103115	For details see Table 2
anti-mouse CD64	Biolegend	139319	For details see Table 2
anti-mouse CD68	Biolegend	137009	For details see Table 2
anti-mouse GR-1	Biolegend	108433	For details see Table 2
anti-mouse Siglec F	Biolegend	155503	For details see Table 2
AVERTIN	Sigma-Aldrich	240486
B220	Biolegend	103228	For details see Table 2
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8
CD103	Biolegend	121405 / 121419	For details see Table 2
CD24	Biolegend	138503	For details see Table 2
CD3	Biolegend	100205	For details see Table 2
Centrifuge
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical Corp	LS004196
CX3CR1	Biolegend	149005	For details see Table 2
DNase I	Millipore Sigma	10104159001
Ethanol
F4/80	Biolegend	123133	For details see Table 2
FcBlock (CD16/32)	Biolegend	101301	For details see Table 2
Fetal Bovine Serum	R&D Systems
Fine Serrated Forceps	Roboz Surgical Instrument Co
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	00-5523-00
Futura Safety Scalpel	Merit Medical Systems	SMS210
Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34973	For details see Table 2
MERTK	Biolegend	151505	For details see Table 2
MHC-II	Biolegend	107621	For details see Table 2
NK1.1	Biolegend	108705	For details see Table 2
Orbital Shaker	VWR	Model 200
Petri dish	Falcon	351029
Refrigerated benchtop centrifuge	SORVAL ST 16R
Small curved scissor	Roboz Surgical Instrument Co