Durchflusszytometrische Analyse zur Identifizierung der angeborenen und adaptiven Immunzellen der murinen Lunge

Summary

In dieser Studie stellen wir ein effektives und reproduzierbares Protokoll zur Isolierung der Immunpopulationen der murinen Atemwege vor. Wir bieten auch eine Methode zur Identifizierung aller angeborenen und adaptiven Immunzellen, die sich in den Lungen gesunder Mäuse befinden, unter Verwendung eines 9-farbbasierten Durchflusszytometrie-Panels.

Abstract

Die Atemwege stehen in direktem Kontakt mit der äußeren Umgebung und benötigen ein präzise reguliertes Immunsystem, um Schutz zu bieten und gleichzeitig unerwünschte Reaktionen auf Umweltantigene zu unterdrücken. Lungen beherbergen mehrere Populationen von angeborenen und adaptiven Immunzellen, die Immunüberwachung bieten, aber auch schützende Immunantworten vermitteln. Diese Zellen, die das gesunde Lungenimmunsystem im Gleichgewicht halten, nehmen auch an mehreren pathologischen Zuständen wie Asthma, Infektionen, Autoimmunerkrankungen und Krebs teil. Die selektive Expression von Oberflächen- und intrazellulären Proteinen verleiht den Immunzellen der Lunge einzigartige immunphänotypische Eigenschaften. Folglich spielt die Durchflusszytometrie eine entscheidende Rolle bei der Identifizierung solcher Zellpopulationen während stationärer und pathologischer Zustände. Dieses Papier stellt ein Protokoll vor, das eine konsistente und reproduzierbare Methode beschreibt, um die Immunzellen zu identifizieren, die sich in den Lungen gesunder Mäuse unter stationären Bedingungen befinden. Dieses Protokoll kann jedoch auch verwendet werden, um Veränderungen in diesen Zellpopulationen in verschiedenen Krankheitsmodellen zu identifizieren, um krankheitsspezifische Veränderungen in der Lungenimmunlandschaft zu identifizieren.

Introduction

Die murinen Atemwege enthalten ein einzigartiges Immunsystem, das für die Bekämpfung von Krankheitserregern und die Aufrechterhaltung der Immunhomöostase verantwortlich ist. Das pulmonale Immunsystem besteht aus zellulären Populationen mit signifikanter Heterogenität in ihrem Phänotyp, ihrer Funktion, ihrem Ursprung und ihrem Standort. Residente alveoläre Makrophagen (AMs), die hauptsächlich aus fetalen Monozyten stammen, befinden sich im alveolären ^Lumen1, während sich aus dem Knochenmark stammende interstitielle Makrophagen (IMs) im Lungenparenchym ^befinden2. Sofortnachrichten können durch den Ausdruck CD206 weiter unterteilt werden. CD206⁺ IMs bevölkern den peribronchialen und perivaskulären Bereich, während sich CD206-IMs am alveolären Interstitium ^befinden3. In jüngster Zeit wurden einige Unterklassifizierungen von Sofortnachrichten vorgeschlagen3,4,5,6. Obwohl IMs weniger untersucht werden als AMs, unterstützen jüngste Beweise ihre entscheidende Rolle bei der Regulierung des Immunsystems der ^Lunge7. Darüber hinaus wird CD206 auch in alternativ aktivierten ^AMs8 ausgedrückt.

Pulmonale dendritische Zellen (DCs) sind eine weitere heterogene Gruppe von Lungenimmunzellen in Bezug auf ihre funktionellen Eigenschaften, ihren Ort und ihre Herkunft. Vier Unterkategorien von DCs wurden in der Lunge beschrieben: konventionelle CD103+ DCs (auch bekannt als cDC1), konventionelle CD11b⁺ DCs (auch bekannt als cDC2), Monozyten-abgeleitete DCs (MoDCs) und plasmazytoide DCs9,10,11,12,13. Die ersten drei Unterklassen können als Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) ^II+CD11c⁺9,10,14,15 definiert werden. Plasmazytoide DCs exprimieren MHC II und sind mittelmäßig positiv für CD11c, exprimieren aber hohe Konzentrationen von B220 und ^{PDCA-19,13,16}. In naiven murinen Lungen befinden sich CD103-DCs und CD11b-DCs im Interstitium der Atemwege, während sich plasmazytoide DCs im alveolären Interstitium ^befinden17.

Zwei Hauptpopulationen von Monozyten befinden sich im stationären Zustand in der Lunge: klassische Monozyten und nicht-klassische Monozyten. Klassische Monozyten sind Ly6C ⁺ und sind entscheidend für die anfängliche Entzündungsreaktion. Im Gegensatz dazu sind nicht-klassische Monozyten Ly6C^– und wurden weithin als entzündungshemmende Zellen angesehen3,16,18^. Kürzlich wurde eine zusätzliche Population von CD64⁺CD16.2+ Monozyten beschrieben, die aus Ly6C^– Monozyten stammen und CD206^{+ IMs3} entstehen lassen.

Eosinophile treten hauptsächlich in der Lunge während einer Helmintheninfektion oder allergischen Erkrankungen auf. Es gibt jedoch eine kleine Anzahl von Eosinophilen im Lungenparenchym während des stationären Zustands, die als ansässige Eosinophile bekannt sind. Im Gegensatz zu den ansässigen Eosinophilen finden sich entzündliche Eosinophile im Lungeninterstitium und in der bronchoalveolären Lavage (BAL). In Mausmodellen der Hausstaubmilbe (HDM) werden entzündliche Eosinophile nach Antigen-vermittelter Stimulation in die Lunge rekrutiert. Es wurde vorgeschlagen, dass ansässige Eosinophile eine regulatorische Rolle bei der Allergie spielen könnten, indem sie die Sensibilisierung von T helper 2 (Th2) gegenüber ^HDM19 hemmen.

Im Gegensatz zum Rest der lungenmyeloischen Zellen exprimieren Neutrophile Ly6G, aber nicht CD68 und zeichnen sich durch eine Signatur des CD68-Ly6G+^–Immunphänotyps16,20,21 aus. Visualisierungsstudien haben gezeigt, dass die Lunge im stationären Zustand einen Pool von Neutrophilen im intravaskulären Kompartiment reserviert und eine beträchtliche Anzahl extravaskulärer Neutrophilen ^{beherbergt22.} Ähnlich wie Eosinophile werden Neutrophile in BAL im stationären Zustand nicht gefunden; Verschiedene Formen der Immunstimulation, wie LPS-Challenge, Asthma oder Lungenentzündung, treiben jedoch Neutrophile in das Alveolarlumen, was zu ihrer Anwesenheit in BAL21,22,23 führt.

Eine beträchtliche Anzahl von CD45⁺-Zellen der Lunge stellt einen natürlichen Killer (NK), T-Zellen und B-Zellen dar und ist für die meisten myeloischen Marker ^negativ24. In den Lungen naiver Mäuse können diese drei Zelltypen anhand der Expression von CD11b und MHC ^II18 identifiziert werden. Etwa 25% der pulmonalen CD45⁺-Zellen sind B-Zellen, während der Prozentsatz der NK-Zellen in der Lunge höher ist als bei anderen lymphatischen und nicht-lymphatischen Geweben24,25,26. Unter den pulmonalen ^T-Zellen ist ein beträchtlicher Anteil CD4-CD8^– und spielt eine wichtige Rolle bei Atemwegsinfektionen26.

Da die Lunge ein sehr komplexes und einzigartiges Immunsystem beherbergt, wurden mehrere Gating-Strategien zur Identifizierung von Lungenimmunzellen entwickelt und berichtet16,18,20,27. Die hierin beschriebene Gating-Strategie bietet eine umfassende und reproduzierbare Möglichkeit, bis zu 12 verschiedene pulmonale myeloische und nicht-myeloische Immunpopulationen mit 9 Markern zu identifizieren. Zusätzliche Marker wurden verwendet, um die Ergebnisse zu validieren. Darüber hinaus wird eine detaillierte Methode zur Herstellung einer Einzelzellsuspension bereitgestellt, die den Zelltod minimiert und die Identifizierung des vollständigsten Profils des Immunzellkompartiments der Lunge ermöglicht. Es sollte beachtet werden, dass die Identifizierung von Nicht-Immunzellen der Lunge, wie Epithelzellen (CD45-CD326⁺CD31^–), Endothelzellen (CD45-CD326-CD31⁺), und Fibroblasten einen anderen Ansatz ^{erfordert28,29}. Die Identifizierung solcher Populationen ist in dem hier beschriebenen Protokoll und Verfahren nicht enthalten.

Protocol

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Studien und Experimente wurden gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Beth Israel Deaconess Medical Center durchgeführt. Sechs bis zehn Wochen alte C57BL/6-Mäuse beiderlei Geschlechts wurden verwendet, um dieses Protokoll zu entwickeln. 1. Chirurgische Exzision und Gewebevorbereitung Euthanasie die Maus durch intraperitoneale Injektion von 1 ml Tribromethanol (hergestellt nach Standardprotokoll; <st…

Representative Results

Gating-StrategieDer erste Schritt unserer Gating-Strategie ist der Ausschluss der Ablagerungen und Dubletten (Abbildung 1A). Der sorgfältige Ausschluss von Dubletten ist entscheidend, um falsch-positive Populationen zu vermeiden (Ergänzende Abbildung S2). Anschließend werden Immunzellen mit CD45+, einem Marker für hämatopoetische Zellen, identifiziert (Abbildung 1B). Der lebende tote Fleck kann hinzugefügt w…

Discussion

Die Identifizierung pulmonaler Immunzellen kann aufgrund der in der Lunge lebenden multiplen Immunzelltypen und ihrer einzigartigen immunphänotypischen Eigenschaften im Vergleich zu ihren in anderen Geweben lebenden Gegenstücken eine Herausforderung darstellen. Unter verschiedenen pathologischen Bedingungen treten Zellen mit ausgeprägten phänotypischen Merkmalen in der Lunge auf. Zum Beispiel führt eine Bleomycin-induzierte Lungenverletzung zur Rekrutierung von zirkulierenden Monozyten-abgeleiteten Makrophagen im Al…

Materials

10 mL syringe plunger	EXELINT	26265
18 G needles	BD Precision Glide Needle	305165
21 G needles	BD Precision Glide Needle	305195
50 mL conical tubes	Falcon	3520
70 μm cell strainer	ThermoFisher	22363548
96-well plates	Falcon/corning	3799
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A10492-01
anti-mouse CD11b	Biolegend	101215	For details see Table 2
anti-mouse CD11c	Biolegend	117339 / 117337	For details see Table 2
anti-mouse CD45	Biolegend	103115	For details see Table 2
anti-mouse CD64	Biolegend	139319	For details see Table 2
anti-mouse CD68	Biolegend	137009	For details see Table 2
anti-mouse GR-1	Biolegend	108433	For details see Table 2
anti-mouse Siglec F	Biolegend	155503	For details see Table 2
AVERTIN	Sigma-Aldrich	240486
B220	Biolegend	103228	For details see Table 2
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8
CD103	Biolegend	121405 / 121419	For details see Table 2
CD24	Biolegend	138503	For details see Table 2
CD3	Biolegend	100205	For details see Table 2
Centrifuge
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical Corp	LS004196
CX3CR1	Biolegend	149005	For details see Table 2
DNase I	Millipore Sigma	10104159001
Ethanol
F4/80	Biolegend	123133	For details see Table 2
FcBlock (CD16/32)	Biolegend	101301	For details see Table 2
Fetal Bovine Serum	R&D Systems
Fine Serrated Forceps	Roboz Surgical Instrument Co
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	00-5523-00
Futura Safety Scalpel	Merit Medical Systems	SMS210
Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34973	For details see Table 2
MERTK	Biolegend	151505	For details see Table 2
MHC-II	Biolegend	107621	For details see Table 2
NK1.1	Biolegend	108705	For details see Table 2
Orbital Shaker	VWR	Model 200
Petri dish	Falcon	351029
Refrigerated benchtop centrifuge	SORVAL ST 16R
Small curved scissor	Roboz Surgical Instrument Co