म्यूरीन फेफड़े की जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान के लिए फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण
Summary
इस अध्ययन में, हम मुरीन श्वसन प्रणाली की प्रतिरक्षा आबादी को अलग करने के लिए एक प्रभावी और पुन: प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम सभी जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान के लिए एक विधि भी प्रदान करते हैं जो स्वस्थ चूहों के फेफड़ों में रहते हैं, एक 9-रंग-आधारित प्रवाह साइटोमेट्री पैनल का उपयोग करके।
Abstract
श्वसन पथ बाहरी वातावरण के साथ सीधे संपर्क में है और पर्यावरणीय एंटीजन के लिए अवांछित प्रतिक्रियाओं को दबाते हुए सुरक्षा प्रदान करने के लिए एक सटीक विनियमित प्रतिरक्षा प्रणाली की आवश्यकता होती है। फेफड़े जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं की कई आबादी की मेजबानी करते हैं जो प्रतिरक्षा निगरानी प्रदान करते हैं लेकिन सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की मध्यस्थता भी करते हैं। ये कोशिकाएं, जो स्वस्थ फुफ्फुसीय प्रतिरक्षा प्रणाली को संतुलन में रखती हैं, अस्थमा, संक्रमण, ऑटोइम्यून बीमारियों और कैंसर जैसी कई रोग संबंधी स्थितियों में भी भाग लेती हैं। सतह और इंट्रासेल्युलर प्रोटीन की चयनात्मक अभिव्यक्ति फेफड़ों की प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अद्वितीय इम्यूनोफेनोटाइपिक गुण प्रदान करती है। नतीजतन, प्रवाह साइटोमेट्री स्थिर-राज्य और रोग संबंधी स्थितियों के दौरान ऐसी कोशिका आबादी की पहचान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह पेपर एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान करने के लिए एक सुसंगत और पुन: प्रस्तुत करने योग्य विधि का वर्णन करता है जो स्थिर-राज्य स्थितियों के तहत स्वस्थ चूहों के फेफड़ों में रहते हैं। हालांकि, इस प्रोटोकॉल का उपयोग फेफड़ों की प्रतिरक्षा परिदृश्य में रोग-विशिष्ट परिवर्तनों की पहचान करने में मदद करने के लिए विभिन्न रोग मॉडलों में इन कोशिका आबादी में परिवर्तनों की पहचान करने के लिए भी किया जा सकता है।
Introduction
मुरीन श्वसन पथ में रोगजनकों से लड़ने और प्रतिरक्षा होमियोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए जिम्मेदार एक अद्वितीय प्रतिरक्षा प्रणाली होती है। फुफ्फुसीय प्रतिरक्षा प्रणाली में सेलुलर आबादी होती है जिसमें उनके फेनोटाइप, कार्य, उत्पत्ति और स्थान में महत्वपूर्ण विषमता होती है। निवासी वायुकोशीय मैक्रोफेज (एएम), मुख्य रूप से भ्रूण मोनोसाइट्स से उत्पन्न होते हैं, वायुकोशीय लुमेन 1 में रहते हैं, जबकि अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न अंतरालीय मैक्रोफेज (आईएम) फेफड़ों के पैरेन्काइमा 2 में रहते हैं। आईएम को CD206 की अभिव्यक्ति द्वारा आगे उपवर्गीकृत किया जा सकता है। CD206+ IMs पेरिब्रोन्कियल और पेरिवैस्कुलर क्षेत्र को पॉप्युलेट करते हैं, जबकि CD206– IMs वायुकोशीय इंटरस्टिटियम 3 पर स्थित हैं। आईएम के कुछ उप-वर्गीकरण हाल ही में प्रस्तावित किए गए हैं3,4,5,6। हालांकि आईएम का एएम की तुलना में कम अध्ययन किया जाता है, हाल के सबूत फेफड़ों की प्रतिरक्षा प्रणाली के विनियमन में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका का समर्थन करते हैं। इसके अलावा, CD206 को वैकल्पिक रूप से सक्रिय AMs8 में भी व्यक्त किया जाता है।
फुफ्फुसीय डेंड्राइटिक कोशिकाएं (डीसी) फेफड़ों की प्रतिरक्षा कोशिकाओं का एक और विषम समूह हैं जो उनके कार्यात्मक गुणों, स्थान और मूल के संबंध में हैं। फेफड़ों में डीसी की चार उपश्रेणियों का वर्णन किया गया है: पारंपरिक CD103 + DCs (जिसे cDC1 के रूप में भी जाना जाता है), पारंपरिक CD11b + DC (जिसे cDC2 के रूप में भी जाना जाता है), मोनोसाइट-व्युत्पन्न डीसी (MoDCs), और plasmacytoid DCs9,10,11,12,13। पहले तीन उपवर्गों को प्रमुख हिस्टोकम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स (एमएचसी) II + CD11c + 9,10,14,15 के रूप में परिभाषित किया जा सकता है। Plasmacytoid डीसी एमएचसी द्वितीय व्यक्त करते हैं और CD11c के लिए मध्यवर्ती रूप से सकारात्मक हैं, लेकिन B220 और PDCA-19,13,16 के उच्च स्तर को व्यक्त करते हैं। भोले मुरीन फेफड़ों में, CD103 डीसी और CD11b डीसी वायुमार्ग इंटरस्टिटियम में स्थित हैं, जबकि plasmacytoid डीसी वायुकोशीय interstitium17 में स्थित हैं।
मोनोसाइट्स की दो प्रमुख आबादी स्थिर स्थिति के दौरान फेफड़ों में रहती है: शास्त्रीय मोनोसाइट्स और गैर-शास्त्रीय मोनोसाइट्स। शास्त्रीय monocytes Ly6C + हैं और प्रारंभिक भड़काऊ प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसके विपरीत, गैर-शास्त्रीय मोनोसाइट्स Ly6C हैं– और व्यापक रूप से विरोधी भड़काऊ कोशिकाओं 3,16,18 के रूप में देखा गया है। हाल ही में, CD64 + CD16.2 + मोनोसाइट्स की एक अतिरिक्त आबादी का वर्णन किया गया था, जो Ly6C– मोनोसाइट्स से उत्पन्न होता है और CD206 + IMs3 को जन्म देता है।
ईोसिनोफिल मुख्य रूप से हेल्मिंथ संक्रमण या एलर्जी की स्थिति के दौरान फेफड़ों में दिखाई देते हैं। हालांकि, स्थिर अवस्था के दौरान फुफ्फुसीय पैरेन्काइमा में ईोसिनोफिल की एक छोटी संख्या होती है, जिसे निवासी ईोसिनोफिल के रूप में जाना जाता है। निवासी ईोसिनोफिल के विपरीत, भड़काऊ ईोसिनोफिल फेफड़ों के इंटरस्टिटियम और ब्रोन्कोएल्वोलर लैवेज (बीएएल) में पाए जाते हैं। घर की धूल घुन (एचडीएम) के माउस मॉडल में, भड़काऊ ईोसिनोफिल को एंटीजन-मध्यस्थता उत्तेजना के बाद फेफड़ों में भर्ती किया जाता है। यह प्रस्तावित किया गया है कि निवासी ईोसिनोफिल की एचडीएम 19 के लिए टी हेल्पर 2 (टी 2) संवेदीकरण को रोककर एलर्जी में नियामक भूमिका हो सकती है।
बाकी फुफ्फुसीय माइलॉयड कोशिकाओं के विपरीत, न्यूट्रोफिल Ly6G व्यक्त करते हैं लेकिन CD68 नहीं और CD68-Ly6G + immunophenotype16,20,21 के हस्ताक्षर की विशेषता है। विज़ुअलाइज़ेशन अध्ययनों से पता चला है कि स्थिर स्थिति के दौरान, फेफड़े इंट्रावैस्कुलर डिब्बे में न्यूट्रोफिल का एक पूल आरक्षित करते हैं और काफी संख्या में एक्स्ट्रावैस्कुलर न्यूट्रोफिल 22 की मेजबानी करते हैं। ईोसिनोफिल के समान, न्यूट्रोफिल स्थिर अवस्था में बीएएल में नहीं पाए जाते हैं; हालांकि, प्रतिरक्षा उत्तेजना के कई रूप, जैसे कि एलपीएस चुनौती, अस्थमा, या निमोनिया, वायुकोशीय लुमेन में न्यूट्रोफिल चलाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप BAL21,22,23 में उनकी उपस्थिति होती है।
फेफड़ों की CD45+ कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या प्राकृतिक हत्यारा (एनके), टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करती है और अधिकांश माइलॉयड मार्करों 24 के लिए नकारात्मक होती है। भोले चूहों के फेफड़ों में, इन तीन सेल प्रकारों को CD11b और MHC II18 की अभिव्यक्ति के आधार पर पहचाना जा सकता है। फुफ्फुसीय सीडी 45 + कोशिकाओं का लगभग 25% बी कोशिकाएं हैं, जबकि एनके कोशिकाओं का प्रतिशत अन्य लिम्फोइड और गैर-लिम्फोइड ऊतकों की तुलना में फेफड़ों में अधिक है24,25,26। फुफ्फुसीय टी कोशिकाओं में, एक काफी अंश CD4-CD8 है– और श्वसन संक्रमण 26 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।
क्योंकि फेफड़े एक बहुत ही जटिल और अद्वितीय प्रतिरक्षा प्रणाली की मेजबानी करते हैं, फेफड़ों की प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान के लिए कई गेटिंग रणनीतियों को विकसित किया गया है और रिपोर्ट किया गया है16,18,20,27। यहां वर्णित गेटिंग रणनीति 9 मार्करों का उपयोग करके 12 अलग-अलग फुफ्फुसीय माइलॉयड और गैर-माइलॉयड प्रतिरक्षा आबादी की पहचान करने के लिए एक व्यापक और पुन: प्रस्तुत करने योग्य तरीका प्रदान करती है। परिणामों को सत्यापित करने के लिए अतिरिक्त मार्करों का उपयोग किया गया है। इसके अलावा, एक एकल-सेल निलंबन की तैयारी के लिए एक विस्तृत विधि प्रदान की जाती है जो सेल की मृत्यु को कम करती है और फेफड़ों के प्रतिरक्षा सेल डिब्बे के सबसे पूर्ण प्रोफ़ाइल की पहचान की अनुमति देती है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि फेफड़ों की गैर-प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान, जैसे कि उपकला कोशिकाएं (CD45-CD326+ CD31–), एंडोथेलियल कोशिकाएं (CD45-CD326-CD31+), और फाइब्रोब्लास्ट्स को एक अलग दृष्टिकोण 28,29 की आवश्यकता होती है। ऐसी आबादी की पहचान यहां वर्णित प्रोटोकॉल और विधि में शामिल नहीं है।
Protocol
Representative Results
Discussion
फुफ्फुसीय प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान चुनौतीपूर्ण हो सकती है क्योंकि फेफड़ों में रहने वाले कई प्रतिरक्षा सेल प्रकार और अन्य ऊतकों में रहने वाले उनके समकक्षों की तुलना में उनकी अद्वितीय इम्यूनोफेन…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को NIH अनुदान R01CA238263 और R01CA229784 (VAB) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 10 mL syringe plunger | EXELINT | 26265 | |
| 18 G needles | BD Precision Glide Needle | 305165 | |
| 21 G needles | BD Precision Glide Needle | 305195 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 70 μm cell strainer | ThermoFisher | 22363548 | |
| 96-well plates | Falcon/corning | 3799 | |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A10492-01 | |
| anti-mouse CD11b | Biolegend | 101215 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD11c | Biolegend | 117339 / 117337 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD45 | Biolegend | 103115 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD64 | Biolegend | 139319 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD68 | Biolegend | 137009 | For details see Table 2 |
| anti-mouse GR-1 | Biolegend | 108433 | For details see Table 2 |
| anti-mouse Siglec F | Biolegend | 155503 | For details see Table 2 |
| AVERTIN | Sigma-Aldrich | 240486 | |
| B220 | Biolegend | 103228 | For details see Table 2 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
| CD103 | Biolegend | 121405 / 121419 | For details see Table 2 |
| CD24 | Biolegend | 138503 | For details see Table 2 |
| CD3 | Biolegend | 100205 | For details see Table 2 |
| Centrifuge | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| CX3CR1 | Biolegend | 149005 | For details see Table 2 |
| DNase I | Millipore Sigma | 10104159001 | |
| Ethanol | |||
| F4/80 | Biolegend | 123133 | For details see Table 2 |
| FcBlock (CD16/32) | Biolegend | 101301 | For details see Table 2 |
| Fetal Bovine Serum | R&D Systems | ||
| Fine Serrated Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | ||
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| Futura Safety Scalpel | Merit Medical Systems | SMS210 | |
| Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34973 | For details see Table 2 |
| MERTK | Biolegend | 151505 | For details see Table 2 |
| MHC-II | Biolegend | 107621 | For details see Table 2 |
| NK1.1 | Biolegend | 108705 | For details see Table 2 |
| Orbital Shaker | VWR | Model 200 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SORVAL ST 16R | ||
| Small curved scissor | Roboz Surgical Instrument Co |
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