マウス肺の自然免疫細胞および適応免疫細胞の同定のためのフローサイトメトリー分析
Summary
この研究では、マウス呼吸器系の免疫集団を単離するための効果的で再現可能なプロトコルを提示する。また、9色ベースのフローサイトメトリーパネルを使用して、健康なマウスの肺に存在するすべての自然免疫細胞および適応免疫細胞を同定する方法も提供しています。
Abstract
気道は外部環境と直接接触しており、環境抗原に対する望ましくない反応を抑制しながら保護を提供するために、正確に制御された免疫系を必要とする。肺は、免疫監視を提供するだけでなく、防御免疫応答を媒介する自然免疫細胞および適応免疫細胞のいくつかの集団を宿主とする。健康な肺免疫系のバランスを保つこれらの細胞は、喘息、感染症、自己免疫疾患、癌などのいくつかの病理学的状態にも関与しています。表面および細胞内タンパク質の選択的発現は、肺の免疫細胞にユニークな免疫表現型特性を提供する。その結果、フローサイトメトリーは、定常状態および病理学的状態におけるそのような細胞集団の同定において重要な役割を果たしている。この論文は、定常状態条件下で健康なマウスの肺に存在する免疫細胞を同定するための一貫した再現性のある方法を説明するプロトコルを提示する。しかし、このプロトコルは、肺免疫ランドスケープにおける疾患特異的変化の同定に役立つように、様々な疾患モデルにおけるこれらの細胞集団の変化を同定するためにも使用することができる。
Introduction
マウス気道には、病原体と戦い、免疫恒常性を維持するためのユニークな免疫系が含まれています。肺免疫系は、その表現型、機能、起源、および位置に有意な不均一性を有する細胞集団からなる。主に胎児単球に由来する常在歯槽マクロファージ(AM)は歯槽内腔1に存在し、骨髄由来間質マクロファージ(IM)は肺実質2に存在する。IMsは、CD206の発現によってさらに細分類することができる。CD206+ IMは気管支周囲および血管周囲領域に分布し、一方CD206-IMは肺胞間質3に位置する。IMのいくつかの下位分類が最近提案されています3,4,5,6。IMはAMよりも研究されていませんが、最近の証拠は肺の免疫系の調節におけるIMの重要な役割を支持しています7。加えて、CD206は、代替的に活性化されたAMs8においても発現される。
肺樹状細胞(DC)は、その機能的特性、位置、および起源に関して、肺免疫細胞の別の不均一なグループである。従来のCD103+ DC(cDC1としても知られる)、従来のCD11b+ DC(cDC2としても知られる)、単球由来DC(MoDC)、および形質細胞様DCs9、10、11、12、13の4つのサブカテゴリが肺に記載されています。最初の3つのサブクラスは、主要組織適合性複合体(MHC)II+CD11c+9,10,14,15として定義することができる。形質細胞様DCはMHC IIを発現し、CD11cに対して中間陽性であるが、高レベルのB220およびPDCA-19,13,16を発現する。ナイーブマウス肺では、CD103 DCおよびCD11b DCは気道間質に位置し、形質細胞様DCは肺胞間質に位置する17。
単球の2つの主要な集団は、定常状態の間肺に存在する:古典的単球および非古典的単球。古典的な単球はLy6C +であり、初期炎症反応に重要である。対照的に、非古典的単球はLy6C−であり、抗炎症細胞として広く見なされている3、16、18。最近、CD64+CD16.2+単球のさらなる集団が記載され、これはLy6C–単球に由来し、CD206+ IMs3を生じる。
好酸球は、主に蠕虫感染またはアレルギー状態の間に肺に現れる。しかしながら、定常状態時の肺実質には少数の好酸球が存在し、常在型好酸球として知られている。常在の好酸球とは対照的に、炎症性好酸球は肺間質および気管支肺胞洗浄(BAL)に見られる。ハウスダストダニ(HDM)のマウスモデルでは、抗原媒介刺激後に炎症性好酸球が肺に動員される。常在の好酸球は、HDM19に対するTヘルパー2(Th2)感作を阻害することによって、アレルギーにおいて調節的役割を有する可能性があることが提案されている。
他の肺骨髄系細胞とは対照的に、好中球はLy6Gを発現するがCD68は発現せず、CD68-Ly6G+免疫表現型のシグネチャーによって特徴付けられる16,20,21。可視化研究は、定常状態の間、肺が血管内区画に好中球のプールを留保し、かなりの数の血管外好中球を宿主とすることを示した22。好酸球と同様に、好中球は定常状態でBALには見出されない。しかし、LPSチャレンジ、喘息、肺炎などのいくつかの形態の免疫刺激は、好中球を肺胞内腔に誘導し、BAL21、22、23にそれらの存在をもたらす。
肺のかなりの数のCD45+細胞は、ナチュラルキラー(NK)、T細胞、およびB細胞を表し、ほとんどの骨髄系マーカーに対して陰性である24。ナイーブマウスの肺において、これら3つの細胞型は、CD11bおよびMHC II18の発現に基づいて同定することができる。肺CD45+細胞の約25%はB細胞であるが、NK細胞の割合は他のリンパ系および非リンパ系組織よりも肺内で高い24,25,26。肺T細胞のうち、かなりの画分がCD4-CD8-であり、呼吸器感染症において重要な役割を果たしている26。
肺は非常に複雑でユニークな免疫系を宿主としているため、肺免疫細胞を同定するためのいくつかのゲーティング戦略が開発され、報告されています16,18,20,27。本明細書に記載されるゲーティング戦略は、9つのマーカーを用いて最大12個の異なる肺骨髄系および非骨髄系免疫集団を同定するための包括的かつ再現可能な方法を提供する。追加のマーカーを使用して、結果を検証しています。さらに、細胞死を最小限に抑え、肺の免疫細胞区画の最も完全なプロファイルの同定を可能にする単一細胞懸濁液の調製のための詳細な方法が提供される。上皮細胞(CD45-CD326+CD31-)、内皮細胞(CD45-CD326-CD31+)、および線維芽細胞などの肺の非免疫細胞の同定には、異なるアプローチが必要であることに留意すべきである28,29。このような集団の同定は、本明細書に記載されるプロトコルおよび方法には含まれない。
Protocol
Representative Results
Discussion
肺免疫細胞の同定は、肺に存在する複数の免疫細胞型および他の組織に存在する対応するものと比較して、それらのユニークな免疫表現型特性のために困難な場合がある。いくつかの病理学的状態において、明確な表現型特徴を有する細胞が肺に現れる。例えば、ブレオマイシン誘発性肺損傷は、肺胞腔における循環単球由来マクロファージの動員をもたらし、そこでは、それらは1年間も持…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、NIH助成金R01CA238263およびR01CA229784(VAB)によって支援されました。
Materials
| 10 mL syringe plunger | EXELINT | 26265 | |
| 18 G needles | BD Precision Glide Needle | 305165 | |
| 21 G needles | BD Precision Glide Needle | 305195 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 70 μm cell strainer | ThermoFisher | 22363548 | |
| 96-well plates | Falcon/corning | 3799 | |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A10492-01 | |
| anti-mouse CD11b | Biolegend | 101215 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD11c | Biolegend | 117339 / 117337 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD45 | Biolegend | 103115 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD64 | Biolegend | 139319 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD68 | Biolegend | 137009 | For details see Table 2 |
| anti-mouse GR-1 | Biolegend | 108433 | For details see Table 2 |
| anti-mouse Siglec F | Biolegend | 155503 | For details see Table 2 |
| AVERTIN | Sigma-Aldrich | 240486 | |
| B220 | Biolegend | 103228 | For details see Table 2 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
| CD103 | Biolegend | 121405 / 121419 | For details see Table 2 |
| CD24 | Biolegend | 138503 | For details see Table 2 |
| CD3 | Biolegend | 100205 | For details see Table 2 |
| Centrifuge | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| CX3CR1 | Biolegend | 149005 | For details see Table 2 |
| DNase I | Millipore Sigma | 10104159001 | |
| Ethanol | |||
| F4/80 | Biolegend | 123133 | For details see Table 2 |
| FcBlock (CD16/32) | Biolegend | 101301 | For details see Table 2 |
| Fetal Bovine Serum | R&D Systems | ||
| Fine Serrated Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | ||
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| Futura Safety Scalpel | Merit Medical Systems | SMS210 | |
| Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34973 | For details see Table 2 |
| MERTK | Biolegend | 151505 | For details see Table 2 |
| MHC-II | Biolegend | 107621 | For details see Table 2 |
| NK1.1 | Biolegend | 108705 | For details see Table 2 |
| Orbital Shaker | VWR | Model 200 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SORVAL ST 16R | ||
| Small curved scissor | Roboz Surgical Instrument Co |
References
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