Análise Citométrica de Fluxo para Identificação das Células Imunes Inatas e Adaptativas do Pulmão murino

Summary

Neste estudo, apresentamos um protocolo eficaz e reprodutível para isolar as populações imunes do sistema respiratório murino. Também fornecemos um método para a identificação de todas as células imunes inatas e adaptativas que residem nos pulmões de camundongos saudáveis, usando um painel de citometria de fluxo baseado em 9 cores.

Abstract

O trato respiratório está em contato direto com o ambiente externo e requer um sistema imunológico precisamente regulado para fornecer proteção enquanto suprime reações indesejadas a antígenos ambientais. Os pulmões abrigam várias populações de células imunes inatas e adaptáveis que fornecem vigilância imunológica, mas também mediam respostas imunes protetoras. Essas células, que mantêm o sistema imunológico pulmonar saudável em equilíbrio, também participam de várias condições patológicas, como asma, infecções, doenças autoimunes e câncer. A expressão seletiva de proteínas superficiais e intracelulares fornece propriedades imunofenópicas únicas às células imunes do pulmão. Consequentemente, a citometria de fluxo tem um papel fundamental na identificação dessas populações celulares durante condições de estado estável e patológico. Este artigo apresenta um protocolo que descreve um método consistente e reprodutível para identificar as células imunes que residem nos pulmões de camundongos saudáveis em condições de estado estável. No entanto, este protocolo também pode ser usado para identificar alterações nessas populações celulares em vários modelos de doenças para ajudar a identificar alterações específicas da doença na paisagem imunológica pulmonar.

Introduction

O trato respiratório murino contém um sistema imunológico único responsável por combater patógenos e manter a homeostase imunológica. O sistema imunológico pulmonar consiste em populações celulares com heterogeneidade significativa em seu fenótipo, função, origem e localização. Os macrófagos alveolares residentes (AMs), originados principalmente de monócitos fetais, residem no lúmen ^{1 alveolar}, enquanto macrófagos intersticiais (IMs) derivados da medula óssea residem no pulmão parenchyma2. Os IMs podem ser ainda mais subclassificados pela expressão do CD206. Os IMs CD206⁺ povoam a área peribronquial e perivascular, enquanto os IMs CD206-IMs estão localizados no interstício alveolar3. Algumas subclassificações de IMs foram propostas recentemente 3,4,5,6. Embora os IMs sejam menos estudados do que as AMs, evidências recentes apoiam seu papel crucial na regulação do sistema imunológico do ^pulmão7. Além disso, o CD206 também é expresso em AMs8 ativados alternativamente.

As células dendríticas pulmonares (DCs) são outro grupo heterogêneo de células imunes pulmonares em relação às suas propriedades funcionais, localização e origem. Quatro subcategorias de DCs foram descritas no pulmão: DCs cd103⁺ convencionais (também conhecidos como cDC1), CD11b⁺ DCs convencionais (também conhecidos como cDC2), DCs derivados de monocitoides (MoDCs) e DCs 9,10,11,12,13. As três primeiras subclasses podem ser definidas como principais complexos de histocompatibilidade (MHC) II⁺CD11c⁺9,10,14,15. Os DCs plasmacitóides expressam MHC II e são intermediavelmente positivos para CD11c, mas expressam altos níveis de B220 e PDCA-19,13,16. Em pulmões murinos ingênuos, os DCs CD103 e os DCs CD11b estão localizados no interstício das vias aéreas, enquanto os DCs plasmacitóides estão localizados no interstício ^alveolar17.

Duas grandes populações de monócitos residem no pulmão durante o estado estável: monócitos clássicos e monócitos não clássicos. Os monócitos clássicos são Ly6C⁺ e são críticos para a resposta inflamatória inicial. Em contraste, os monócitos não clássicos são ^{Ly6C e} têm sido amplamente vistos como células anti-inflamatórias3,16,18. Recentemente, foi descrita uma população adicional de monócitos CD64⁺CD16.2⁺, que se originam ^de monócitos Ly6C e dão origem ^a IMs3 CD206⁺.

Os eosinófilos aparecem principalmente nos pulmões durante a infecção por helminto ou condições alérgicas. No entanto, há um pequeno número de eosinófilos no parenchyma pulmonar durante o estado estável, conhecidos como eosinófilos residentes. Ao contrário dos eosinófilos residentes, eosinófilos inflamatórios são encontrados no interstício pulmonar e na lavagem broncoalveolar (BAL). Em modelos de camundongos de ácaro de poeira doméstica (HDM), eosinófilos inflamatórios são recrutados para o pulmão após estimulação mediada por antígeno. Foi proposto que os eosinófilos residentes possam ter um papel regulatório na alergia, inibindo a sensibilização do auxiliar T 2 (Th2) para o ^HDM19.

Em contraste com o resto das células mielóides pulmonares, os neutrófilos expressam Ly6G, mas não CD68, e são caracterizados por uma assinatura do imunofenótipo CD68-Ly6G⁺16,20,21. Estudos de visualização mostraram que, durante o estado estável, o pulmão reserva um pool de neutrófilos no compartimento intravascular e hospeda um número considerável de neutrófilos ^{extravasculares22}. Semelhante aos eosinófilos, os neutrófilos não são encontrados em BAL em estado estável; no entanto, várias formas de estimulação imunológica, como desafio LPS, asma ou pneumonia, levam os neutrófilos para o lúmen alveolar, resultando em sua presença em BAL21,22,23.

Um número substancial de células CD45⁺ do pulmão representam o assassino natural (NK), células T e células B e são negativos para a maioria dos marcadores mieloides24. Nos pulmões de camundongos ingênuos, esses três tipos de células podem ser identificados com base na expressão de CD11b e MHC ^II18. Cerca de 25% das células CD45⁺ pulmonares são células B, enquanto a porcentagem de células NK é maior no pulmão do que outros tecidos linfoides e não linfoides24,25,26. Entre as células T pulmonares, uma fração considerável é ^CD4-CD8– e desempenha um papel importante nas infecções ^{respiratórias26}.

Como o pulmão possui um sistema imunológico muito complexo e único, várias estratégias de gating para a identificação de células imunes pulmonares foram desenvolvidas e relatadas16,18,20,27. A estratégia de gating descrita aqui fornece uma maneira abrangente e reprodutível de identificar até 12 populações imunes mielóides pulmonares e não mieloides usando 9 marcadores. Marcadores adicionais foram usados para validar os resultados. Além disso, é fornecido um método detalhado para a preparação de uma suspensão unicelular que minimize a morte celular e permita a identificação do perfil mais completo do compartimento de células imunes do pulmão. Deve-se notar que a identificação de células não imunes do pulmão, como células epiteliais (CD45-CD326⁺CD31^–), células endoteliais (CD45-CD326-CD31⁺) e fibroblastos requer uma abordagem ^{diferente28,29}. A identificação dessas populações não está incluída no protocolo e método aqui descrito.

Protocol

Todos os estudos e experimentos descritos neste protocolo foram conduzidos sob diretrizes de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Beth Israel Deaconess Medical Center. De seis a dez semanas de idade, os ratos C57BL/6 de ambos os sexos foram usados para desenvolver este protocolo. 1. Excisão cirúrgica e preparação tecidual Eutanize o mouse injetando 1 mL de tribromoetanol (preparado de acordo com o protocolo padrão; Tabela de Materiai…

Representative Results

Estratégia gatingO primeiro passo da nossa estratégia de gating é a exclusão dos detritos e dobras (Figura 1A). A exclusão cuidadosa dos doublets é fundamental para evitar populações falso-positivas (Figura Suplementar S2). Em seguida, as células imunes são identificadas usando CD45+, um marcador para células hematopoiéticas (Figura 1B). A mancha morta pode ser adicionada para excluir células mortas. …

Discussion

A identificação de células imunes pulmonares pode ser desafiadora devido aos múltiplos tipos de células imunes residentes no pulmão e suas características imunofenópicas únicas em comparação com suas contrapartes residentes em outros tecidos. Em várias condições patológicas, células com características fenotípicas distintas aparecem nos pulmões. Por exemplo, a lesão pulmonar induzida pela bleomicina resulta no recrutamento de macrófagos derivados de monócitos circulantes no espaço alveolar, onde po…

Materials

10 mL syringe plunger	EXELINT	26265
18 G needles	BD Precision Glide Needle	305165
21 G needles	BD Precision Glide Needle	305195
50 mL conical tubes	Falcon	3520
70 μm cell strainer	ThermoFisher	22363548
96-well plates	Falcon/corning	3799
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A10492-01
anti-mouse CD11b	Biolegend	101215	For details see Table 2
anti-mouse CD11c	Biolegend	117339 / 117337	For details see Table 2
anti-mouse CD45	Biolegend	103115	For details see Table 2
anti-mouse CD64	Biolegend	139319	For details see Table 2
anti-mouse CD68	Biolegend	137009	For details see Table 2
anti-mouse GR-1	Biolegend	108433	For details see Table 2
anti-mouse Siglec F	Biolegend	155503	For details see Table 2
AVERTIN	Sigma-Aldrich	240486
B220	Biolegend	103228	For details see Table 2
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8
CD103	Biolegend	121405 / 121419	For details see Table 2
CD24	Biolegend	138503	For details see Table 2
CD3	Biolegend	100205	For details see Table 2
Centrifuge
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical Corp	LS004196
CX3CR1	Biolegend	149005	For details see Table 2
DNase I	Millipore Sigma	10104159001
Ethanol
F4/80	Biolegend	123133	For details see Table 2
FcBlock (CD16/32)	Biolegend	101301	For details see Table 2
Fetal Bovine Serum	R&D Systems
Fine Serrated Forceps	Roboz Surgical Instrument Co
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	00-5523-00
Futura Safety Scalpel	Merit Medical Systems	SMS210
Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34973	For details see Table 2
MERTK	Biolegend	151505	For details see Table 2
MHC-II	Biolegend	107621	For details see Table 2
NK1.1	Biolegend	108705	For details see Table 2
Orbital Shaker	VWR	Model 200
Petri dish	Falcon	351029
Refrigerated benchtop centrifuge	SORVAL ST 16R
Small curved scissor	Roboz Surgical Instrument Co