I denna studie presenterar vi ett effektivt och reproducerbart protokoll för att isolera immunpopulationerna i murin andningsorganen. Vi tillhandahåller också en metod för identifiering av alla medfödda och adaptiva immunceller som finns i lungorna hos friska möss, med hjälp av en 9-färgbaserad flödescytometripanel.
Luftvägarna är i direkt kontakt med omvärlden och kräver ett exakt reglerat immunsystem för att ge skydd samtidigt som oönskade reaktioner på miljöantigener undertrycks. Lungor är värd för flera populationer av medfödda och adaptiva immunceller som ger immunövervakning men också förmedlar skyddande immunsvar. Dessa celler, som håller det friska lungimmunsystemet i balans, deltar också i flera patologiska tillstånd som astma, infektioner, autoimmuna sjukdomar och cancer. Selektivt uttryck av ytan och intracellulära proteiner ger unika immunophenotypic egenskaper till immuncellerna i lungan. Följaktligen har flöde cytometri en avgörande roll i identifieringen av sådana cellpopulationer under steady-state och patologiska villkor. Detta dokument presenterar ett protokoll som beskriver en konsekvent och reproducerbar metod för att identifiera immunceller som finns i lungorna hos friska möss under steady-state förhållanden. Detta protokoll kan dock också användas för att identifiera förändringar i dessa cellpopulationer i olika sjukdomsmodeller för att identifiera sjukdomsspecifika förändringar i lungens immunlandskap.
Murin luftvägarna innehåller ett unikt immunsystem som ansvarar för att bekämpa patogener och upprätthålla immun homeostas. Lungimmunsystemet består av cellulära populationer med betydande heterogenitet i deras fenotyp, funktion, ursprung och plats. Resident alveolar makrofager (AMs), härrör främst från fetala monocyter, bor i alveolar lumen1, medan benmärg-härledda interstitial makrofager (IMs) bor i lung parenchyma2. IM kan ytterligare underklassificeras genom uttrycket av CD206. CD206+ IMs fyller peribronchial- och perivascular-området, medan CD206-IMs finns vid alveolar interstitium3. Några underklassificeringar av IM har föreslagits nyligen3,4,5,6. Även om IM är mindre studerade än AMs, stöder nya bevis deras avgörande roll i regleringen av immunsystemet i lung7. Dessutom uttrycks CD206 också i alternativt aktiverade AMs8.
Lung dendritiska celler (DCs) är en annan heterogen grupp av lung immunceller med avseende på deras funktionella egenskaper, plats och ursprung. Fyra underkategorier av DCs har beskrivits i lungan: konventionella CD103 + DCs (även känd som cDC1), konventionella CD11b + DCs (även känd som cDC2), monocyt-härledda DCs (MoDC) och plasmacytoid DCs9,10,11,12,13. De tre första underklasserna kan definieras som större histokompatibilitetskomplex (MHC) II+CD11c+9,10,14,15. Plasmacytoid DCs uttrycker MHC II och är mellanliggande positiva för CD11c men uttrycker höga nivåer av B220 och PDCA-19,13,16. I naiva murin lungor, CD103 DCs och CD11b DCs finns i luftvägarna interstitium, medan plasmacytoid DCs finns i alveolar interstitium17.
Två stora populationer av monocyter bor i lungan under steady state: klassiska monocyter och icke-klassiska monocyter. Klassiska monocyter är Ly6C+ och är kritiska för det första inflammatoriska svaret. Däremot är icke-klassiska monocyter Ly6C– och har allmänt setts som antiinflammatoriska celler3,16,18. Nyligen beskrevs en ytterligare population av CD64 + CD16.2 + monocyter, som härstammar från Ly6C– monocyter och ger upphov till CD206 + IMs3.
Eosinofiler förekommer främst i lungorna under helminthinfektion eller allergiska tillstånd. Det finns dock ett litet antal eosinofiler i lungparenkym under steady state, känd som bosatta eosinofiler. I motsats till de bosatta eosinofilerna finns inflammatoriska eosinofiler i lunginterstitium och bronchoalveolar lavage (BAL). I musmodeller av husdammmyt (HDM) rekryteras inflammatoriska eosinofiler i lungan efter antigenmedierad stimulering. Det har föreslagits att bosatta eosinofiler kan ha en regulatorisk roll i allergi genom att hämma T helper 2 (Th2) sensibilisering till HDM19.
I motsats till resten av lung myeloiska celler uttrycker neutrofiler Ly6G men inte CD68 och kännetecknas av en signatur av CD68-Ly6G + immunophenotype16,20,21. Visualiseringsstudier har visat att under steady state reserverar lungan en pool av neutrofiler i det intravaskulära utrymmet och är värd för ett stort antal extravaskulära neutrofiler22. I likhet med eosinofiler finns neutrofiler inte i BAL i stabilt tillstånd; emellertid, flera former av immunstimulering, såsom LPS utmaning, astma eller lunginflammation, driva neutrofiler i alveolar lumen, vilket resulterar i deras närvaro i BAL21,22,23.
Ett betydande antal CD45 + celler i lungan representerar naturliga mördare (NK), T-celler och B celler och är negativa för de flesta myeloiska markörer24. I lungorna hos naiva möss kan dessa tre celltyper identifieras baserat på uttrycket av CD11b och MHC II18. Omkring 25% av lung-CD45+-cellerna är B-celler, medan andelen NK-celler är högre i lungan än andra lymfoida och icke-lymfoida vävnader24,25,26. Bland lung-T-celler är en betydande fraktion CD4-CD8– och spelar en viktig roll vid luftvägsinfektioner26.
Eftersom lungan är värd för ett mycket komplext och unikt immunsystem har flera gating strategier för identifiering av lung immunceller utvecklats och rapporterats16,18,20,27. Gating strategi beskrivs häri ger ett omfattande och reproducerbart sätt att identifiera upp till 12 olika pulmonell myeloiska och icke-myeloiska immunpopulationer med 9 markörer. Ytterligare markörer har använts för att validera resultaten. Dessutom tillhandahålls en detaljerad metod för beredning av en encellssuspension som minimerar celldöd och gör det möjligt att identifiera den mest kompletta profilen av lungens immuncellsfack. Det bör noteras att identifiering av icke-immuna celler i lungan, såsom epitelceller (CD45-CD326+CD31–), endotelceller (CD45-CD326-CD31+) och fibroblaster kräver ett annat tillvägagångssätt28,29. Identifiering av sådana populationer ingår inte i det protokoll och den metod som beskrivs här.
Identifiering av lung immunceller kan vara utmanande på grund av de flera immun celltyper som finns i lungan och deras unika immunophenotypic egenskaper jämfört med deras motsvarigheter som bor i andra vävnader. I flera patologiska förhållanden uppträder celler med distinkta fenotypiska funktioner i lungorna. Till exempel resulterar bleomycin-inducerad lungskada i rekrytering av cirkulerande monocyt-härledda makrofager i alveolar utrymmet, där de kan förbli så länge som ett år och även kvarstå efter bleomy…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NIH-bidrag R01CA238263 och R01CA229784 (VAB).
10 mL syringe plunger | EXELINT | 26265 | |
18 G needles | BD Precision Glide Needle | 305165 | |
21 G needles | BD Precision Glide Needle | 305195 | |
50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
70 μm cell strainer | ThermoFisher | 22363548 | |
96-well plates | Falcon/corning | 3799 | |
ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A10492-01 | |
anti-mouse CD11b | Biolegend | 101215 | For details see Table 2 |
anti-mouse CD11c | Biolegend | 117339 / 117337 | For details see Table 2 |
anti-mouse CD45 | Biolegend | 103115 | For details see Table 2 |
anti-mouse CD64 | Biolegend | 139319 | For details see Table 2 |
anti-mouse CD68 | Biolegend | 137009 | For details see Table 2 |
anti-mouse GR-1 | Biolegend | 108433 | For details see Table 2 |
anti-mouse Siglec F | Biolegend | 155503 | For details see Table 2 |
AVERTIN | Sigma-Aldrich | 240486 | |
B220 | Biolegend | 103228 | For details see Table 2 |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
CD103 | Biolegend | 121405 / 121419 | For details see Table 2 |
CD24 | Biolegend | 138503 | For details see Table 2 |
CD3 | Biolegend | 100205 | For details see Table 2 |
Centrifuge | |||
Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
CX3CR1 | Biolegend | 149005 | For details see Table 2 |
DNase I | Millipore Sigma | 10104159001 | |
Ethanol | |||
F4/80 | Biolegend | 123133 | For details see Table 2 |
FcBlock (CD16/32) | Biolegend | 101301 | For details see Table 2 |
Fetal Bovine Serum | R&D Systems | ||
Fine Serrated Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | ||
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
Futura Safety Scalpel | Merit Medical Systems | SMS210 | |
Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34973 | For details see Table 2 |
MERTK | Biolegend | 151505 | For details see Table 2 |
MHC-II | Biolegend | 107621 | For details see Table 2 |
NK1.1 | Biolegend | 108705 | For details see Table 2 |
Orbital Shaker | VWR | Model 200 | |
Petri dish | Falcon | 351029 | |
Refrigerated benchtop centrifuge | SORVAL ST 16R | ||
Small curved scissor | Roboz Surgical Instrument Co |