スプライシング効率を監視するためのレポーターベースの細胞アッセイ
Summary
このプロトコルは、スプライシングに対する5′-スプライス部位変異の影響をモニターするためのミニジーンレポーターアッセイを記述し、変異誘発スプライシング阻害のレスキューのためのサプレッサーU1 snRNAを開発する。レポーターおよびサプレッサーU1 snRNA構築物をHeLa細胞で発現させ、スプライシングをプライマー伸長またはRT-PCRによって分析する。
Abstract
遺伝子発現中、プレmRNAスプライシングの重要なステップは、スプライス部位の正確な認識と、成熟mRNAの細胞質的輸出前にエクソンを結合し、イントロンを除去するためのスプライソソーム複合体の効率的な組み立てを含む。スプライシング効率は、スプライス部位における変異の存在、トランス作用型スプライシング因子の影響、または治療薬の活性によって変化させることができる。ここで、任意の所与のエクソンのスプライシング効率をモニターするために適用することができる細胞アッセイのためのプロトコルを記載する。アッセイは、3-エクソン/2-イントロンミニジーンレポーターにコードされる適応性プラスミドを使用し、これは一過性トランスフェクションによって哺乳動物細胞で発現させることができる。トランスフェクション後、全細胞RNAが単離され、レポーターmRNAにおけるエクソンスプライシングの効率は、プライマー伸長または半定量的逆転写酵素 – ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)のいずれかによって決定される。我々は、5’スプライス部位変異に関連する疾患の影響が、レポーターにそれらを導入することによってどのように決定され得るかを記述します。これらの変異の抑制が、プレmRNAのエキソン-イントロン接合部の5′-スプライス部位と塩基対する5’領域に代償性変異を有するU1小型核RNA(snRNA)構築物との同時トランスフェクションによって達成され得る方法。したがって、レポーターは、変異体5’スプライス部位の認識を改善するための治療用U1粒子の設計に使用することができる。スプライシングエンハンサーまたはサイレンサー配列などの シス作用調節部位のレポーターへの挿入は、特定の選択的スプライシング因子によって媒介される調節におけるU1 snRNPの役割を調べるためにも使用され得る。最後に、レポーター発現細胞を小分子と共にインキュベートして、構成的プレmRNAスプライシングまたは変異体5’スプライス部位を有するエクソンに対する潜在的な治療薬の効果を決定することができる。全体として、レポーターアッセイは、基本的なスプライシングメカニズムおよびスプライシング関連疾患を研究するために、様々な条件下でのスプライシング効率をモニターするために適用することができる。
Introduction
プレmRNAスプライシングは、非コードイントロンを除去し、コードエクソンを正確にライゲーションして成熟mRNAを形成する重要なプロセシングステップです。5′-スプライス部位および3‘-スプライス部位と呼ばれるエクソン-イントロン接合部におけるコンセンサス配列の認識は、スプライシング機構の構成要素によって開始される。U1小核リボヌクレオタンパク質(snRNP)は、U1 snRNAとプレmRNA1との塩基対形成によって5‘-スプライス部位を認識する。5‘スプライス部位配列を変化させる遺伝的に遺伝する変異は、多くの疾患と関連している2,3。U1 snRNAと変異型5‘スプライス部位との塩基対形成が失われると、異常なスプライシングが発生し、影響を受ける転写産物の翻訳が損なわれる可能性があると予測されています。スプライシング欠損を補正するための潜在的な治療的アプローチは、5‘-スプライス部位と塩基対するその5‘-領域に代償性ヌクレオチド変化を有する修飾U1 snRNAによる変異の抑制を含む。エクソン特異的U1 snRNAとも呼ばれるこのような修飾U1 snRNAは、スプライシング欠陥を逆転させるのに有効であり、救助されたmRNA4、5、6、7、8からのタンパク質発現の増加をもたらすことが見出されている。
ここでは、エクソンのスプライシングに対する5‘-ss変異の効果の評価を可能にし、エクソンインクルージョンのレスキューを可能にする修飾U1 snRNAの開発にも使用できるレポーターベースの細胞スプライシングアッセイであるU1 snRNP相補アッセイについて説明します。また、プライマー伸長およびRT-PCRによるスプライシングされたレポーター転写産物のモニタリング、およびプライマー伸長およびRT-qPCRによる修飾U1 snRNAの発現を決定するためのプロトコルも提供しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
このアッセイは、HeLa以外の細胞株におけるスプライシング分析に適合させることができますが、細胞のコンフルエンシーやDNAの量など、トランスフェクション効率に影響を与える要因を最適化する必要がある場合があります。レポーター対U1構築物比は、他の細胞型で観察される発現レベルに応じて決定する必要があるかもしれない別の重要なパラメータである。抽出されたRNAの品質は、ス?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所(R21CA170786およびR01GM127464)および米国癌協会(Institutional Research Grant 74-001-34-IRG)からのS.S.およびW..Mへの資金と、Valley Research Partnership Program(P1-4009およびVRP77)からのS.S.およびW.への資金によって支援された。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。
Materials
| Reagent Grade Deionized Water | ThermoFisher Scientific | 23-751628 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet | Gibco | 12100-046 | |
| Sodium Bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-22 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N | Sigma-Aldrich | S2567-16A | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0% | ThermoFisher Scientific | A144-500 | |
| Disposable PES Bottle Top Filters | ThermoFisher Scientific | FB12566510 | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | Amresco | 0105-2.5KG | |
| 2.5% Trypsin (10x), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| Potassium Chloride | Fisher Bioreagent | BP366-1 | |
| Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate | Fisher Bioreagent | BP332-1 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Fisher Bioreagent | BP362-1 | |
| Transfection medium – Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Transfection Reagent – Lipofectamine™ 2000 | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| TRIzol™ Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP1145-1 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2818-4 | |
| Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2618-212 | |
| Glycogen (5 mg/ml) | ThermoFisher Scientific | AM9510 | |
| Direct-zol RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R2052 | |
| ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi | PerkinElmer | NEG035C001MC | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | |
| Size exclusion beands – Sephadex® G-25 | Sigma-Aldrich | G2580-10G | |
| Size exclusion mini columns | USA Scientific | 1415-0600 | |
| pBR322 DNA-MspI Digest | New England Biolabs | N3032S | |
| Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt | Affymetrix | 76410 100 UL | |
| Rnase inactivating reagents – RNaseZAP™ | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | |
| dNTP Mix (10 mM ea) | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
| RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| Reverse Transcriptase – M-MLV Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 28025013 | used for primer extension |
| Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10342020 | |
| Random Hexamers (50 µM) | ThermoFisher Scientific | N8080127 | |
| Real time PCR mix – SYBR™ Select Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4472903 | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080093 | used for cDNA preparation |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| 5X First-Strand Buffer | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| Formamide (≥99.5%) | ThermoFisher Scientific | BP228-100 | Review Material Safety Data Sheets |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma-Aldrich | 114405-5G | |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | |
| Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP168-500 | |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP1406-1 | Review Material Safety Data Sheets |
| Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.) | ThermoFisher Scientific | BP169-212 | |
| Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade | VWR | M133-25G | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, Ultrapure | VWR | 0761-25ML | Review Material Safety Data Sheets |
| Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon | VWR | ASG-400 | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm | VWR | NGP-125NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm | VWR | NGP-200NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm | VWR | NGP-400NR | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE28-9564 | |
| Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular Imager | GE Healthcare | 28-9610-73 AB | |
| Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter | GMI | 8043-30-1194 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | ||
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems | ThermoFisher Scientific |
References
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