O protocolo atual apresenta um método rápido, eficiente e suave para isolar células únicas adequadas para análise de RNA-seq unicelular a partir de um incisivo de rato em crescimento contínuo, molar de rato e dentes humanos.
Os dentes de camundongos e humanos representam órgãos desafiadores para o isolamento rápido e eficiente das células para transcrição unicelular ou outras aplicações. O tecido de polpa dentária, rico na matriz extracelular, requer um longo e tedioso processo de dissociação que é tipicamente além do tempo razoável para transcrição de células únicas. Para evitar mudanças artificiais na expressão genética, o tempo decorrido da eutanásia de um animal até que a análise de células únicas precisa ser minimizada. Este trabalho apresenta um protocolo rápido que permite obter suspensão unicelular de dentes de camundongos e humanos em uma excelente qualidade adequada para scRNA-seq (sequenciamento de RNA unicelular). Este protocolo baseia-se em etapas aceleradas de isolamento tecidual, digestão enzimática e preparação subsequente da suspensão final de células únicas. Isso permite o processamento rápido e suave dos tecidos e permite o uso de mais amostras animais ou humanas para a obtenção de suspensões celulares com alta viabilidade e alterações transcricionais mínimas. Espera-se que este protocolo possa orientar pesquisadores interessados em realizar o scRNA-seq não apenas no rato ou dentes humanos, mas também em outros tecidos extracelulares ricos em matriz, incluindo cartilagem, tecido conjuntivo denso e dermis.
O sequenciamento de RNA unicelular é uma poderosa ferramenta para decifrar a estrutura populacional de células in vivo, hierarquia, interações e homeostase1,2. No entanto, seus resultados dependem fortemente do primeiro passo desta análise avançada – a preparação de uma suspensão unicelular de perfeita qualidade fora do tecido complexo e bem organizado. Isso engloba manter as células vivas e prevenir mudanças artificiais indesejadas nos perfis de expressão genética das células3,4. Tais mudanças podem levar à caracterização imprecisa da estrutura populacional e à má interpretação dos dados coletados.
Protocolos específicos para o isolamento de uma ampla gama de tecidos foram desenvolvidos5,6,7,8. Eles geralmente empregam dissociação mecânica em combinação com mais incubação com várias enzimas proteolíticas. Estes geralmente incluem trippsina, colagens, despases, papain6,7,8,9, ou misturas enzimáticas disponíveis comercialmente, como Accutase, Tryple, etc.5. A parte mais crítica que afeta a qualidade do transcriptome é a digestão enzimática. Mostrou-se que a incubação prolongada com enzimas a 37 °C influencia a expressão genética e causa a regulação de muitos genes relacionados ao estresse10,11,12,13. O outro parâmetro crítico do processo de isolamento é o seu comprimento geral, como foi demonstrado que os transcriptomes celulares mudam após a isquemia tecidual14. Este protocolo apresenta um protocolo eficiente para o isolamento suave de células únicas de dentes de camundongos e humanos, mais rápido do que outros protocolos anteriormente utilizados para isolamento de células de tecidos complexos5,6,9,11,13,15,16.
Este protocolo apresenta como dissecar rapidamente o tecido mole do dente duro e preparar uma suspensão unicelular adequada para scRNA-seq. Este método emprega apenas uma etapa de centrifugação e minimiza o efeito de alterações transcricionais indesejadas, reduzindo o tempo de manuseio e digestão do tecido e mantendo o tecido e as células a 4 °C na maior parte do tempo. O procedimento mostra o isolamento das células dos incisivos de camundongos, molar e dentes do siso humano como exemplo, mas principalmente deve trabalhar para outros dentes em vários organismos. O protocolo completo é estrategicamente visualizado na Figura 1. Este protocolo tem sido usado recentemente para gerar um atlas tipo células odontológicas obtido a partir de dentes de camundongos e humanos1.
Estudar dentes e ossos no nível celular ou molecular é geralmente desafiador, uma vez que as células que formam esses tecidos são cercadas por diferentes tipos de matrizes duras19. Um dos principais objetivos para a realização de RNA-seq unicelulares no tecido dental é a necessidade de obter células de interesse rapidamente e sem alterações artificiais em seus transcriptomes. Para isso, foi desenvolvido um protocolo altamente eficiente adequado para isolar células de fábulas de dentes de camundongos e humanos, o que permite a rápida geração de suspensões unicelulares para todas as aplicações transcriômicas. Isso foi assegurado pelo isolamento rápido do tecido, minimizando os passos das manipulações teciduais e celulares, e agilizando a digestão mecânica e enzimática.
As etapas mais críticas deste protocolo são o processamento rápido do tecido e a preparação adequada de suspensão unicelular8,9. Uma abordagem manual é usada para obter polpas dentárias sem utilizar uma broca dentária ou outros dispositivos geradores de calor. O superaquecimento pode causar uma expressão artificial de proteínas de choque térmico e outros genes, levando, em última análise, aos padrões analisados de expressão genética não representativos do tecido original20. A colheita manual de tecidos pode ser um passo desafiador que provavelmente precisará de algum treinamento de antemão. A polpa é então cortada em pequenos pedaços e digerida enzimática a 37 °C. Com exceção dos 15-20 min de digestão enzimática, todo o protocolo é realizado a 4 °C. O processamento tecidual e especialmente a digestão enzimática foram minimizados ao menor tempo possível, uma vez que uma incubação mais prolongada a 37 °C pode causar alterações nos padrões de expressão genética10. Recomenda-se a remoção mecânica da dentina antes da digestão enzimática. A dentina e a predentina anexada à polpa contêm uma grande quantidade de colágeno, e sua presença excessiva pode diminuir a eficácia da solução de digestão. Após ser removido do corpo (ou morte de organismos), foi demonstrado que as células começam a modificar seus padrões de expressão genética rapidamente12. Portanto, o isolamento e o processamento das células devem ser realizados o mais rápido possível. O protocolo atual reduz o tempo de processamento para 35-45 minutos desde a isolação do tecido (animal eutanizador) até o preparo da suspensão unicelular.
Uma modificação alternativa desta técnica é a preservação celular para uso posterior. Isso é conseguido pela fixação do metanol. A suspensão celular fixada com metanol pode ser armazenada por até 1 mês a -80 °C, conforme descrito no protocolo21. No entanto, sempre que possível, execute o scRNA-seq diretamente, uma vez que foi demonstrado que os dados unicelulares de suspensões unicelulares fixas por metanol podem sofrer de aumento da expressão de genes relacionados ao estresse e contaminação com RNA22 ambiente. Esta etapa pode precisar de modificações adicionais de acordo com os protocolos do fabricante.
Antes da primeira aplicação deste protocolo, recomenda-se a realização de várias etapas de validação para testar a técnica. Pela nossa experiência, sugerimos testar as etapas críticas acima mencionadas do protocolo. Além disso, sugerimos testar a eficácia da solução P de colagenase e testar o manuseio da etapa de dissociação tecidual. Especificamente, cerca de 5 minutos após o início da incubação P de colagem, os pedaços de tecido devem se agregar juntos. Esta é uma situação comum. Os agregados são desintegrados a cada 3-4 min usando uma pipeta de 1 mL, e com o tempo crescente, eles devem ficar menores até que mal visíveis.
Além disso, recomenda-se realizar a contagem de células em uma câmara de contagem de células antes da centrifugação e antes e depois da filtragem para detectar possíveis perdas celulares devido à remoção de supernantes subótimos. Se a suspensão única final precisar ser purificada, o FACS pode ser usado. A classificação celular permite não apenas remover detritos ou células mortas, mas, importante, permite enriquecer a suspensão final com células fluorescentes rotuladas13,19. Para evitar o estresse da tesoura ou entupimento do classificador de células, é utilizado um bocal largo (85 μm ou 100 μm). Isso melhorará ainda mais a viabilidade das células classificadas.
Esta técnica foi projetada e testada em dentes humanos e de camundongos. O principal fator limitante é o pequeno número de células nas polpas dentárias reduzidas dos dentes de camundongos mais velhos (molares) e humanos. Suponha que um número maior de células precise ser obtida ou células dos dentes de pacientes mais velhos devem ser adquiridas. Uma solução possível é processar um número maior de dentes e mesclá-los em um único lote, posteriormente processados como uma amostra.
As células vivas da polpa dentária humana foram isoladas há mais de vinte anos usando uma mistura enzimática de colagemnase I e dispase23. Desde então, os isolamentos das células de polpa dentária tornaram-se amplamente utilizados, e várias técnicas têm sido utilizadas5,6,7,8. O significado crítico do método aqui apresentado é a adaptação de todas as etapas de isolamento para tornar o isolamento rápido e suave para garantir a alta qualidade da suspensão celular final para scRNA-seq. O maior rendimento celular pode ser obtido por uma incubação mais prolongada com enzimas. Este protocolo fornece uma solução eficiente para a obtenção rápida de células únicas a partir de dentes de camundongos e humanos de qualidade adequada para sequenciamento de RNA unicelular. Espera-se que esta técnica seja amplamente utilizada para outros tecidos ou organismos com apenas pequenas modificações técnicas.
The authors have nothing to disclose.
J.K. foi apoiado pela Agência de Subvenção da Universidade de Masaryk (MUNI/H/1615/2018) e por fundos da Faculdade de Medicina MU para pesquisador júnior. J.L. foi apoiado pela Agência de Subvenção da Universidade de Masaryk, (MUNI/IGA/1532/2020) e é Bolsista de Talentos de Doutorado de Brno – Financiado pela Prefeitura municipal de Brno. T.B. foi apoiado pelo Fundo Austríaco de Ciência (bolsa Lise Meitner: M2688-B28). Agradecemos a Lydie Izakovicova Holla e Veronika Kovar Matejova pela ajuda na obtenção de dentes humanos. Finalmente, agradecemos a Radek Fedr e Karel Soucek por sua gentil assistência com a classificação FACS.
APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
CellTrics 50 µm, sterile | Sysmex | 04-004-2327 | |
Collagenase P (COLLP-PRO) | Roche | 11213857001 | |
CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 10 | AESCULAP | 16600495 | |
CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 11 | AESCULAP | 16600509 | |
Fetal Bovine Serum (South America), Ultra low Endotoxin | Biosera | FB-1101/500 | |
Hank's balanced salt solution (HBSS) without Ca2+ and Mg2+ | SIGMA | H6648 | |
Industrial low lint wipes, MAX60 | Dirteeze | MAX60B176 | |
Industrial strong tweezers, style 660, bent serrated pointed tips, 150mm | Value-Tec | 50-014366 | |
Methyl alcohol A.G. | Penta | 21210-11000 | |
Propidium Iodide Solution | BioLegend | 421301 | |
Scalpel handle | CM Instrumente | AG-013-10 | |
Serological pipettes 10mL, individually wrapped, 200 pcs. | CAPP | SP-10-C | |
Stereo microscope | Leica | EZ4 | |
Surgical scissors (9cm) | CM Instrumente | AI-430-09Y | |
Tissue culture dish Ø 100 mm | TPP | 93100 |