Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لتحسين نجاح التألق بين المراحل في الكشف عن التهجين في الموقع على مسحات نخاع العظم من مرضى المايلوما المتعددة.
Abstract
يعد الكشف عن التهجين الفلوري في الموقع (FISH) طريقة لا غنى عنها في التقسيم الطبقي للمخاطر الجينية في الورم النقوي المتعدد (MM) ، وهو أحد أكثر الأورام الخبيثة الدموية شيوعا. السمة المميزة ل MM هي خلايا البلازما الخبيثة المتراكمة في نخاع العظام. تركز تقارير FISH ل MM بشكل أساسي على خلايا البلازما النسيلية النقية أو المحددة ، بدلا من جميع الخلايا النووية ، عن طريق الفرز باستخدام الخرز المغناطيسي المضاد ل CD138 أو وضع علامة باستخدام سلسلة ضوء الغلوبولين المناعي السيتوبلازمي κ أو λ. عادة ما يتم الحصول على نوى نخاع العظم بين الأطوار من خلايا نخاع العظم الطازجة. ومع ذلك ، فإن التخصيب المرضي لعينات خلايا البلازما يتطلب كميات كبيرة من نخاع العظم الطازج المضاد للتخثر الهيبارين ، والذي لا يمكن الحصول عليه في حالة استخراج نخاع العظم الصعب أو الصنبور الجاف لنخاع العظم. هنا ، نقوم بإنشاء طريقة جديدة لتحسين نجاح اكتشاف FISH على مسحات نخاع العظم الملطخة أو غير الملطخة. من الأسهل الحصول على مسحات نخاع العظم من عينات نخاع العظم المضادة للتخثر.
Introduction
الورم النقوي المتعدد (MM) هو مرض خبيث في خلايا البلازما (PC) مع عدم تجانس بيولوجي قوي وفروق فردية كبيرة في الفعالية السريرية ، مع فترات بقاء تتراوح من أشهر إلى عقود. الخصائص الوراثية الخلوية هي مؤشرات تنبؤية مهمة ل MM. أصبح نظام التقسيم الطبقي للمخاطر والعلاجات الفردية القائمة على الخصائص الوراثية موضوعين ذوي اهتمام كبير في الأبحاث السريرية على MM1. تشمل انحرافات أجهزة الكمبيوتر التي تم اختبارها في لوحة التهجين الفلوري في الموقع (FISH) من نخاع العظم (BM) del 13q14 (RB1) و del 17p13 (TP53) و t(4;14) (IGH / FGFR3) و t (11;14) (IGH / MYEOV) و t (14;16) (IGH / MAF) و t (14:20) (IGH / MAFB) و 1q21 (CKS1B) الكسب / التضخيم و 1p (CDKN2C) الحذف.
يجب تضمين علم الوراثة الخلوية الطوري القياسي في التقييم الأولي لمرضى MM. على الرغم من أن النمط النووي التقليدي ذو النطاق G يوفر فائدة تحليل الكروموسوم الكامل، إلا أن انخفاض العائد لهذه الطريقة يؤدي إلى العديد من النتائج السلبية الخاطئة2. تقليديا ، كان ينظر إلى أجهزة الكمبيوتر الشخصية على أنها غير قادرة إلى حد كبير على الانقسام لأنها منتجات المرحلة النهائية من تمايز الخلايا الليمفاوية B. هذا يجعل من الصعب الحصول على صور مقسمة. قد يكون التحليل الوراثي الخلوي المحسن في MM مع الثقافات طويلة الأجل (6 أيام) وتحفيز الثقافات بواسطة السيتوكينات طريقة واعدة لتحديد التشوهات الوراثية الخلوية في مرضى MM الذين تم تشخيصهم حديثا3. حتى عندما تم إطالة وقت الزرع إلى 6 أيام ، ومع ذلك ، تم الإبلاغ عن تشوهات وراثية خلوية بدقة في 30٪ -50٪ من مرضى MM 4. علاوة على ذلك ، يتميز MM بانحرافات وراثية خلوية معقدة تعكس عدم تجانسه التنبؤي. ومع ذلك ، فإن دقة تقنية ربط الكروموسومات التقليدية منخفضة ، مما قد يؤدي بسهولة إلى عدم اكتشاف تشوهات الكروموسومات في MM.
لا غنى عن FISH Interphase ، ويفضل بعد فرز الكمبيوتر الشخصي القائم على الخرز المغناطيسي الإيجابي CD138 أو وضع علامة عليه باستخدام سلسلة ضوء الغلوبولين المناعي السيتوبلازمي κ / λ ، في تحليل MM5,6. يوصى بشدة باستخدام عينة مختارة إيجابية CD138 للحصول على العائد الأمثل للخلايا السرطانية. ومع ذلك ، فإن الكمية الدقيقة للانحرافات الجينية الخلوية تتطلب ما لا يقل عن 4 مل من BM المضاد للتخثر لفرز الكمبيوتر. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مجموعات فرز الخرزة المناعية المغناطيسية CD138 مع FISH أو الغلوبولين المناعي لسلسلة الضوء κ / λ السيتوبلازمية مع اختبار FISH (cIg-FISH) تزيد من العديد من التكاليف التجريبية وتستغرق وقتا طويلا.
عادة ، يتم تقييم نسبة الكمبيوتر الشخصي أولا من الفحص المورفولوجي لمسحات BM الملطخة أو أقسام خزعة BM 7,8. تستخدم عينات BM ذات الجودة العالية (عينات شفط النخاع الأولى) للاختبار المورفولوجي ، في حين أن العينات المرسلة ل FISH أو الكشف الآخر غالبا ما تكون عينات الشفط الثانوية ذات نسب عالية من التخفيف بالدم المحيطي.
في وقت مبكر من 1990s ، أظهرت دراسات متعددة أن مسحات BM يمكن استخدامها مباشرة لفحوصات FISH الخلالية ، والتي أثبتت أنها طريقة موثوقة وقابلة للتكرار 9. أكدت دراسة أنيقة تستند إلى مورفولوجيا الخلايا والكيمياء الخلوية الإستراز جنبا إلى جنب مع FISH من الدم المحيطي ومسحات BM أهميتها السريرية الكبيرة لتوضيح تشوهات الكروموسومات في المرضى الذين يعانون من سرطان الدم المحبب واللمفاوي 10.
هنا ، نقدم طريقة جديدة لتحسين نجاح الكشف عن FISH بين المراحل في مرضى MM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت هذه الدراسة وفقا لمبادئ إعلان هلسنكي ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات في مستشفى تشونغنان بجامعة ووهان (رقم 2019065). تم جمع العينات من مريض MM في قسم أمراض الدم ، مستشفى تشونغنان بجامعة ووهان (الصين).
1. إعداد مسحات BM
- ضع أول 0.2 مل من محلول BM على شريحة زجاجية نظيفة يمكن التخلص منها.
- انشر مسحات BM إلى سمك موحد مع ذيول حادة عن طريق إزالة BM بسرعة. ثم ، تجف بشكل طبيعي.
- قم بتغطية أفلام BM ب 1 مل من محلول Wright-Giemsa لمدة 10 ثوان تقريبا في درجة حرارة الغرفة.
- أضف 1 مل من المخزن المؤقت للفوسفات إلى الشرائح.
ملاحظة: احرص على منع محلول الصبغة من الجفاف أو التدفق من الشرائح. - امزج محلول الصبغة بلطف وحافظ عليه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- شطف الشرائح بالماء النظيف وتجفيفها في الهواء في درجة حرارة الغرفة.
- استخدم الفحص المجهري الضوئي الأمامي للكشف عن أجهزة الكمبيوتر الخبيثة. يجب أن تكون أجهزة الكمبيوتر مشتتة بشكل جيد.
2. الأسماك المعالجة المسبقة لمسحات BM
- قم بتغطية المنطقة الهجينة بمحلول مثبت لمدة 10 دقائق لتغيير لون أجهزة الكمبيوتر وإصلاحها.
- لإعداد محلول مثبت طازج ، امزج الميثانول مع حمض الخليك الجليدي بنسبة حجم 3: 1.
- شطف الشريحة بالماء منزوع الأيونات (dH2O) وجففها في الهواء في درجة حرارة الغرفة.
- سخني جرة تحتوي على 2x SSC عازل إلى 56 درجة مئوية في حمام مائي. قم بتخفيف المخزن المؤقت حديثا إلى 20x SSC قبل الاستخدام.
- لإعداد 20x SSC ، امزج جيدا 176 جم من كلوريد الصوديوم و 88 جم من سترات الصوديوم مع 800 مل من dH2O. قم بقياس الرقم الهيدروجيني واضبط على الرقم الهيدروجيني 5.3 ± 0.2. ثم أضف dH2O ليصل الحجم النهائي إلى 1 لتر.
- اغسل مسحة BM المحضرة في المخزن المؤقت 2x SSC المسخن مسبقا لمدة 10 دقائق ، متبوعا بغمسه في ماء منزوع الأيونات في درجة حرارة الغرفة.
- تجفيف اللطاخة في تدرج الإيثانول (70 ٪ ، 85 ٪ ، و 100 ٪ من الإيثانول ، لكل منها لمدة 1 دقيقة). جفف اللطاخة في الهواء لمدة 10 دقائق.
3. BM تشويه الأسماك والغسيل
ملاحظة: تم تنفيذ جميع الخطوات في غرفة مظلمة لمنع التبريد الفلوري.
- أضف خليط مسبار TP53 / centromere من الكروموسوم 17 (CEP17) إلى منطقة التهجين وقم بتغطيته بغطاء. اضغط برفق باستخدام ملاقط مدببة بدقة لإزالة فقاعات الهواء من الأسفل.
- أغلق جميع جوانب الغطاء بالأسمنت المطاطي لضمان ضيق جيد.
- بعد تصلب الأسمنت المطاطي ، ضع الشريحة على آلة FISH أوتوماتيكية. قم بإجراء تمسخ عند 78 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، يليه التهجين عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- التقط الشريحة من آلة FISH. استخدم ملاقط مدببة بدقة لإزالة الأسمنت المطاطي بلطف.
- اغمر الشريحة في 2x SSC في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 أو 2 دقيقة تقريبا لغسل الغطاء.
- اغسل الشريحة في 68 درجة مئوية محمى من الفئة العمرية 0.4x SSC / 0.3٪ NP-40 في حمام مائي لمدة دقيقتين.
- قم بإعداد محلول 0.4x SSC / 0.3٪ NP-40 عن طريق خلط 20 مل من 20x SSC (درجة الحموضة 5.3) مع 950 مل من dH2O. ثم ، أضف 3 مل من NP-40 واخلطه جيدا حتى يذوب تماما. قياس الرقم الهيدروجيني والتكيف مع 7.0-7.5 مع NaOH. ثم أضف dH2O ليصل الحجم النهائي للحل الكلي إلى 1 لتر.
- اغسل الشرائح باستخدام 2x SSC في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. ضعيه في وضع مستقيم في الظلام ليجف جيدا لمدة 10 دقائق.
- أضف 10 ميكرولتر من DAPI إلى المنطقة الهجينة وقم بتغطيتها بغطاء.
4. تحليل الأسماك وتصويرها
- شاهد الشريحة الهجينة باستخدام مرشح مناسب مضبوط على مجهر فلوري.
- استخدم مرشحا بصريا فلوروفوريا أزرق أحادي اللون لمراقبة شدة التألق في نواة الخلية. التقط صورا لنواة الخلية ضمن مجموعة مرشحات DAPI.
- استخدم مسبار الكروموسوم المركزي لإظهار عدد الكروموسومات التي تحتوي عليها الخلية. تسمية CEP17 مع التألق الأخضر. استخدم مرشحا بصريا فلوريا أخضر الطيف لمراقبة موقع CEP17. التقط صورة إشارات CEP17 أسفل مجموعة المرشحات الخضراء.
- قم بتسمية جين TP53 بالتألق البرتقالي. استخدم مرشحا بصريا فلوروفوريا برتقاليا لمراقبة TP53. التقط صورة إشارات TP53 ضمن هذه المجموعة.
- ادمج هذه الصور الثلاث وافحصها بحثا عن تشوهات عددية.
ملاحظة: في خلية طبيعية بين الأطوار ، لوحظت إشارتان برتقاليتان وإشارتان خضراوان داخل نواة ذات تألق أزرق ، مما يشير إلى زوج واحد من الكروموسوم الطبيعي 17 (الشكل 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في التقييم المورفولوجي الأولي لمريض MM تم تشخيصه حديثا ، وجد أن 15٪ من أجهزة الكمبيوتر الشخصية في مسحة BM تحتوي على نوى أكبر وأكثر قتامة إلى جانب كميات أكبر من السيتوبلازم من أجهزة الكمبيوتر العادية (الشكل 2A). كشف الأنبوب الأول من BM المضاد للتخثر الهيبارين الذي تم اكتشافه بواسطة تقنية النمط الظاهري المناعي عن 2.3٪ فقط من أجهزة الكمبيوتر الشاذة وحيدة النسيلة. ومع ذلك ، فإن BM المستنشق محدود في حالة كونه صنبورا جافا. تم استخدام مسحات BM لاختبار FISH بين المراحل. تم توطين جهاز كمبيوتر تمثيلي ثنائي النواة في فيلم BM بواسطة مرحلة المجهر الفلوري Vernier الفرجار (الشكل 2B). تم تطبيق FISH على مسحات BM لاختبار TP53 و CEP17 . أظهرت نتائج FISH أربع إشارات برتقالية وأربع إشارات خضراء في نواة كمبيوتر واحدة بين الأطوار (الشكل 2C) ، مما يشير إلى أن أربع نسخ من الكروموسوم 17 تم توطينها في نوى الكمبيوتر الشخصي الطورية الفوقية. تم الحصول على نتائج النمط النووي عن طريق تمديد وقت الاستزراع حتى 3 أيام وتحليلها بشكل أكبر باستخدام برنامج تحليل FISH (الشكل 2D). تم التحقق بشكل أكبر من دقة نتائج FISH بين المراحل على مسحات BM.
الشكل 1: الإشارات الطبيعية لمسبار TP53/CEP17 FISH للخلايا البينية (1000x). كانت شدة التألق لنواة الخلية زرقاء ، وكان TP53 برتقاليا ، وكان CEP17 أخضر. في تلك الخلايا البينية الطبيعية ال 3 ، ظهرت إشارتان برتقاليتان و إشارتان خضراوان داخل النواة الزرقاء المتألقة ، مما يشير إلى زوجين من الكروموسوم الطبيعي 17. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: المورفولوجيا والصور الجينية لنخاع العظم (BM) في مرضى المايلوما المتعددة (MM). (أ) خلايا المايلوما ذات التوزيع العنقودي المشار إليه بالأسهم () بعد تلطيخ رايت جيمسا لمسحة BM (
1000×). (ب) خلايا البلازما ثنائية النواة المشار إليها بالأسهم () على صورة رمادية التقطتها كاميرا بالأبيض والأسود على مجهر فلوري (
1000×). (C) TP53 / centromere من الكروموسوم 17 (CEP17) اختبار مسبار التهجين في الموقع (FISH) لمسحة BM. يكشف FISH عن أربع إشارات TP53 وأربع إشارات CEP17 في كل نواة (→) (1000×). (د) يظهر كاريوجرام الكروموسوم غير الطبيعي زوجين من الكروموسوم 17 في نواة واحدة (
). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ومن الضروري تطبيق FISH على التقسيم الطبقي للمخاطر الجينية في MM. الجزء الحاسم من تقارير FISH ليس كل الخلايا النواة ، ولكن أجهزة الكمبيوتر النسيلة التي تم تنقيتها أو تحديدها على وجه التحديد عن طريق الفرز باستخدام الخرز المغناطيسي المضاد ل CD138 أو وضع علامة باستخدام سلسلة ضوء الغلوبولين المناعي السيتوبلازمي κ أو λ. وجد أن FISH بين المراحل بعد فرز الكمبيوتر الشخصي أو cIg-FISH مهم في تشخيص MM بسبب النسبة المنخفضة نسبيا من أجهزة الكمبيوتر في BM. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب لديها بعض أوجه القصور ، بما في ذلك العمليات المعقدة ، وارتفاع متطلبات العينات ، وارتفاع التكاليف التجريبية. يمكن تحديد موقع خمسين جهاز كمبيوتر بسرعة بواسطة فرجار Vernier في مرحلة المجهر. الحصول على مسحات BM أسهل بكثير من عينات BM المضادة للتخثر لأن الحصول على BM المضاد للتخثر يتطلب إجراءات معقدة للحصول على النواة. وفقا لذلك ، أنشأنا طريقة مقنعة لتشويه BM FISH للكشف عن خلايا MM.
أولا ، يجب إجراء مسحات BM من قبل محلل مورفولوجي متمرس. لنشر BM في مسحات ، يتم وضع الموزع أمام الشفط بزاوية 30 درجة -45 درجة وسحبه للخلف للاتصال بالسائل11. بعد ذلك ، يتم تحريك الموزع إلى الأمام بشكل موحد في حركة ثابتة. يجب تصميم كثافة مسحة BM بحيث يبلغ طولها حوالي ثلاثة أرباع الشريحة12. يجب أن يكون فيلم BM أضيق من الشريحة لضمان إمكانية اكتشاف الخلايا الموجودة على جميع الحواف13. كان اختيار منطقة التهجين وتوطين أجهزة الكمبيوتر أمرا بالغ الأهمية في بروتوكولنا ، وهذا يتطلب محللا مورفولوجيا متمرسا. بالنسبة لمسحات BM التي تحتوي على عدد أقل من أجهزة الكمبيوتر ، يجب تحديد موقع أجهزة الكمبيوتر باستخدام هدف غمر زيت المجهر الفلوري الأمامي وفرجار Vernier في المرحلة الموضوعية ، ويمكن التقاط صورها بواسطة لقطات أحادية اللون. على سبيل المثال ، إذا كانت أجهزة الكمبيوتر تمثل 3٪ فقط من إجمالي الخلايا النووية في فيلم BM عن طريق الفحص المورفولوجي ، فيجب أن تحتوي المنطقة الهجينة المنتشرة جيدا من 8 مم × 8 مم على ما لا يقل عن 50 جهاز كمبيوتر لاختبار FISH. بعد تهجين FISH ، يجب حساب إشارات التألق في 50 جهاز كمبيوتر على الأقل من قبل محلل متمرس14.
ومع ذلك ، فإن أحد قيود هذه التقنية هو شرط مسحات BM الطازجة. إذا تم تخزين مسحات BM لأكثر من 2 سنوات ، فقد تكون صور FISH الناتجة غامضة ، مما يؤدي إلى سوء تفسير.
مجتمعة ، يمكن استخدام BM smear FISH المذكور أعلاه على نطاق واسع للمرضى الذين يعانون من الأورام الخبيثة الدموية عندما يكون استخراج BM صعبا أو يحدث الصنبور الجاف BM ، حتى في الأمراض الناقصة التكاثر مع عدد أقل من الخلايا النووية. نأمل أن يتمكن المزيد من المرضى الذين يعانون من الأورام الخبيثة الدموية من الاستفادة من هذه الطريقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا المشروع من قبل صندوق الابتكار التابع ل WNLO 2018WNLOKF023.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
References
- Sonneveld, P., et al. Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group. Blood. 127, 2955-2962 (2016).
- Radbruch, A., et al. Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell. Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).
- Lai, J. L., et al. Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis. Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).
- Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process. Blood. 91, 3-21 (1998).
- Munsh, N. C., et al. Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2. Blood. 117, 4696-4700 (2011).
- Gole, L., et al. cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma - A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service. Blood. 120, 4792-4792 (2012).
- Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).
- Štifter, S., et al. Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma. Diagnostic Pathology. 5, 30 (2010).
- Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears. Pathology. 27, 86-90 (1995).
- Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).
- Dunning, K., Safo, A. The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making. Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).
- Woronzoff-Dashkoff, K. K. The wright-giemsa stain. Secrets revealed. Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).
- McPherson, R. A., Pincus, M. R. Henry's Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
- Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
