يعمل البروتوكول الحالي على تحسين طرق التروية / إزالة الخلايا في الكبد في الموقع وطرق الفحص المجهري ثنائي الفوتون لإنشاء منصة موثوقة لتصور ديناميكيات إعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية (ECM) أثناء التهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH).
التهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH) هو أكثر أمراض الكبد المزمنة شيوعا في الولايات المتحدة ، حيث يصيب أكثر من 70 مليون أمريكي. يمكن أن يتطور التهاب الكبد الدهني غير الكحولي إلى التليف وفي النهاية إلى تليف الكبد ، وهو عامل خطر كبير لسرطان الخلايا الكبدية. توفر المصفوفة خارج الخلية (ECM) الدعم الهيكلي وتحافظ على توازن الكبد عبر إشارات الخلايا الأمومية. ينتج تليف الكبد عن خلل في عملية إعادة تشكيل ECM الديناميكية ويتميز بالتراكم المفرط للعناصر الهيكلية والتغيرات المرتبطة بها في الجليكوزامينوجليكان. يطلق على نمط التليف النموذجي ل NASH اسم “سلك الدجاج” ، والذي يتكون عادة من تليف المنطقة 3 حول الجيوب الأنفية / حول الخلايا ، بناء على الميزات التي لاحظتها صبغة ماسون ثلاثية الألوان وبقع بيكروسيروس الحمراء. ومع ذلك ، فإن تقنيات التصوير التقليدية القائمة على شرائح الأنسجة الرقيقة ثنائية الأبعاد (2D) لا يمكنها إظهار التغييرات الهيكلية التفصيلية ثلاثية الأبعاد (3D) ECM ، مما يحد من فهم إعادة تشكيل ECM الديناميكي في تليف الكبد.
قام العمل الحالي بتحسين بروتوكول سريع وفعال لتصوير بنية ECM الأصلية في الكبد عن طريق إزالة الخلايا لمواجهة التحديات المذكورة أعلاه. تم تغذية الفئران إما بحمية تشاو أو الوجبات السريعة لمدة 14 أسبوعا. تم إجراء إزالة الخلايا بعد نضح الوريد البابي في الموقع ، وتم تطبيق تقنيات الفحص المجهري ثنائي الفوتون على الصورة وتحليل التغيرات في ECM الأصلي. تم إعادة تشكيل وتحليل صور 3D للكبد الطبيعي و NASH. قدم إجراء إزالة التروية الخلوية في الموقع وتحليل السقالة بواسطة المجهر ثنائي الفوتون منصة عملية وموثوقة لتصور إعادة تشكيل ECM الديناميكي في الكبد.
مرض الكبد الدهني غير الكحولي (NAFLD) هو أكثر أمراض الكبد شيوعا ، حيث يصيب 20٪ -25٪ من السكان البالغين. يتقدم 25٪ من مرضى NAFLD إلى التهاب الكبد الدهني غير الكحولي (NASH) ، حيث يزداد خطر الإصابة بتليف الكبد وفشل الكبدوسرطان الخلايا الكبدية 1. في السنوات العشرين المقبلة ، تشير التقديرات إلى أن NASH ستمثل 2 مليون حالة وفاة مرتبطة بالكبد في الولايات المتحدة2. نظرا لعدم وجود علاجات معتمدة ، هناك حاجة ملحة لفك رموز الآليات التي تسبب تليف الكبد لدى مرضى التهاب الكبد الدهني غير الكحولي وتطوير علاج مستهدف3.
المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي بيئة دقيقة ديناميكية ومعقدة تمارس اتصالا ثنائي الاتجاه مع الخلايا لتنظيم توازن الأنسجة4. يتكون ECM للكبد من عناصر هيكلية مثل البروتيوغليكان والكولاجين والفبرونيكتين والإيلاستين والبروتينات غير الهيكلية الأخرى (مثل olfactomedin و thrombospondin) لتوفير الدعم المادي والهيكلي4.
تليف الكبد هو استجابة مزمنة لالتئام الجروح لتلف الكبد من مسببات مختلفة ، بما في ذلك NASH3. ينتج عن خلل في عملية إعادة تشكيل مصفوفة ECM الديناميكية ويتميز بالبروتينات الهيكلية المفرطة في الكبد المصاب4. يعتمد تكوين الألياف على الاتصال الديناميكي بين الخلايا الخلوية بين أنواع الخلايا الكبدية المختلفة. تتمايز الخلايا النجمية الكبدية (HSCs) ، عند تنشيطها ، إلى خلايا تشبه الخلايا الشبيهة بالخلايا الليفية الليفية العضلية التي تعبر عن Smooth Muscle Alpha 2 وتهاجر وتتكاثر وتوليف بروتينات ECM كإجراء لإغلاق الجرح. HSCs المنشطة هي الخلايا المركزية المنتجة للكولاجين في الكبد1.
الآلية الجزيئية لإعادة تشكيل ECM ، وأنماط التليف ، وعلاقتها بالأحداث الخلوية ليست واضحة. لا تزال هناك حاجة إلى فهم أفضل لهيكل ECM ثلاثي الأبعاد (3D) ، على الرغم من أن تقنيات قياس الطيف الكتلي ساعدت في تحليل تكوين بروتين ECM4. تقليديا ، تم إجراء صبغة ماسون ثلاثية الألوان ، وبقع Picro Sirius Red ، وتصوير الجيل التوافقي الثاني (SHG) على أقسام الكبد الرقيقة ثنائية الأبعاد (2D). يسمى نمط التليف النموذجي ل NASH “سلك الدجاج” ، والذي يمتد إلى المنطقة 3 وهو تليف حول الجيوب الأنفية / حول الخلايا 5,6. ومع ذلك ، كان هناك نقص في الدراسات التي تركز على بنية 3D للكبد الأصلي ، وخاصة تلك التي لا تنطوي على تقسيم الأنسجة. من شأن أساليب التصوير القوية لتحديد أنماط وخصائص التليف من خلال إعادة تشكيل ECM الديناميكي في تليف الكبد أن يعزز بشكل كبير فهم آليات NASH وتحديد أهداف علاجية جديدة.
لمواجهة هذه التحديات ، تم تحسين بروتوكول سريع وفعال لتصوير ECM للكبد الأصلي عبر إزالة الخلايا7. إزالة الخلايا من الكبد الكامل هو نهج لإزالة المحتوى الخلوي الكبدي مع الحفاظ على شبكة 3D ECM الأصلية من خلال نضح المنظفات. تم تغذية الفئران إما تشاو أو حمية الوجبات السريعة (FFD) لمدة 14 أسبوعا. تم إجراء إزالة الخلايا بعد نضح الوريد البابي في الموقع بمنظف معتدل ومعدلات تدفق منخفضة للحفاظ على هياكل الكولاجين الليفي الحلزوني الثلاثي والأصلي. تم تطبيق الفحص المجهري ثنائي الفوتون لتحليل التغيرات في هياكل الكولاجين في ECM. تم إعادة تشكيل وتحليل صور 3D لهيكل ECM الأصلي في الكبد الطبيعي و NASH. يوفر إجراء إزالة التروية الخلوية في الموقع وتحليل السقالة بواسطة المجهر ثنائي الفوتون منصة عملية وبأسعار معقولة لتصور إعادة تشكيل ECM الديناميكي في الكبد.
يوضح البروتوكول الحالي أن إزالة الخلايا من خلال معدل تدفق منخفض DOC في التروية في الموقع تحافظ على هياكل الكولاجين الليفي الثلاثي الحلزوني والأصلي القابلة للكسر ، مما يوفر منصة موثوقة وفعالة من حيث التكلفة لالتقاط إعادة تشكيل ECM الديناميكي في تليف الكبد NASH. على الرغم من إجراء إزالة ال?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر حديقة Hyesuk على المساعدة الفنية. تم دعم هذا البحث بتمويل من المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (NIDDK) ، والمعاهد الوطنية للصحة (R01 2DK083283 ، إلى NJT) ، والمعهد الوطني للشيخوخة (NIA) ، والمعاهد الوطنية للصحة (1R01AG060726 ، إلى NJT). نحن نقدر بامتنان جون مولهولاند وكيتي لي من مرفق تصوير علوم الخلية في مركز بيكمان للمساعدة الفنية في التصوير المجهري ثنائي الفوتون.
4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 – 10 mL – vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |