Imaging 3D della matrice extracellulare del fegato in un modello murino di steatoepatite non alcolica
Summary
Il presente protocollo ottimizza i metodi di perfusione/decellularizzazione del fegato in situ e microscopia a due fotoni per stabilire una piattaforma affidabile per visualizzare la dinamica del rimodellamento della matrice extracellulare (ECM) durante la steatoepatite non alcolica (NASH).
Abstract
La steatoepatite non alcolica (NASH) è la malattia epatica cronica più comune negli Stati Uniti, che colpisce oltre 70 milioni di americani. La NASH può progredire verso la fibrosi e, infine, verso la cirrosi, un fattore di rischio significativo per il carcinoma epatocellulare. La matrice extracellulare (ECM) fornisce supporto strutturale e mantiene l’omeostasi epatica tramite segnali matricellulari. La fibrosi epatica deriva da uno squilibrio nel processo dinamico di rimodellamento della MEC ed è caratterizzata da un eccessivo accumulo di elementi strutturali e cambiamenti associati nei glicosaminoglicani. Il tipico modello di fibrosi della NASH è chiamato “filo di pollo”, che di solito consiste nella fibrosi perisinusoidale / pericellulare della zona 3, basata sulle caratteristiche osservate dalla colorazione tricromica di Masson e dalle macchie rosse di Picrosirius. Tuttavia, queste tradizionali tecniche di imaging basate su vetrini tissutali sottili (2D) non possono dimostrare i cambiamenti strutturali dettagliati tridimensionali (3D) della ECM, limitando la comprensione del rimodellamento dinamico dell’ECM nella fibrosi epatica.
Il lavoro attuale ha ottimizzato un protocollo rapido ed efficiente per visualizzare la struttura ECM nativa nel fegato tramite demilitarizzazione per affrontare le sfide di cui sopra. I topi sono stati nutriti con chow o dieta fast-food per 14 settimane. La decellularizzazione è stata eseguita dopo la perfusione della vena porta in situ e le tecniche di microscopia a due fotoni sono state applicate per visualizzare e analizzare i cambiamenti nella ECM nativa. Le immagini 3D dei fegati normali e NASH sono state ricostituite e analizzate. L’esecuzione della decellularizzazione della perfusione in situ e l’analisi dello scaffold mediante microscopia a due fotoni hanno fornito una piattaforma pratica e affidabile per visualizzare il rimodellamento dinamico dell’ECM nel fegato.
Introduction
La steatosi epatica non alcolica (NAFLD) è la malattia epatica più comune, che colpisce il 20% -25% della popolazione adulta. Il 25% dei pazienti con NAFLD progredisce verso la steatoepatite non alcolica (NASH), dove aumenta il rischio di cirrosi, insufficienza epatica e carcinoma epatocellulare1. Nei prossimi 20 anni, si stima che la NASH rappresenterà 2 milioni di decessi correlati al fegato negli Stati Uniti2. Poiché non esistono trattamenti approvati, vi è un urgente bisogno di decifrare i meccanismi che causano la fibrosi epatica nei pazienti con NASH e sviluppare un trattamento mirato3.
La matrice extracellulare (ECM) è un microambiente dinamico e complesso che esercita una comunicazione bidirezionale con le cellule per regolare l’omeostasi tissutale4. La ECM epatica è composta da elementi strutturali come proteoglicani, collagene, fibronectina, elastina e altre proteine non strutturali (ad esempio, olfattomadina e trombospondina) per fornire supporto fisico e strutturale4.
La fibrosi epatica è una risposta cronica di guarigione delle ferite al danno epatico di varie eziologie, tra cui la NASH3. Deriva da uno squilibrio nel processo dinamico di rimodellamento della matrice ECM ed è caratterizzato da eccessive proteine strutturali nel fegato danneggiato4. La fibrogenesi dipende dalla comunicazione dinamica cellula-cellula tra diversi tipi di cellule epatiche. Le cellule stellate epatiche (HSC), quando attivate, si differenziano in cellule simili ai miofibroblasti alfa 2 che esprimono l’actina, migrano e proliferano e sintetizzano le proteine ECM come azione di chiusura della ferita. Le HSC attivate sono le cellule centrali produttrici di collagene nel fegato1.
Il meccanismo molecolare del rimodellamento della ECM, i modelli di fibrosi e la loro relazione con gli eventi cellulari non sono chiari. È ancora necessaria una migliore comprensione della struttura tridimensionale (3D) della ECM, anche se le tecniche di spettrometria di massa hanno contribuito ad analizzare la composizione della proteina ECM4. Tradizionalmente, la colorazione tricromatica di Masson, le macchie Picro Sirius Red e l’imaging di seconda generazione armonica (SHG) sono stati eseguiti su sezioni di fegato sottili bidimensionali (2D). Il tipico modello di fibrosi della NASH è chiamato “filo di pollo”, che si estende alla zona 3 ed è la fibrosi perisinusoidale / pericellulare 5,6. Tuttavia, c’è stata una mancanza di studi incentrati sulla struttura 3D del fegato nativo, in particolare quelli che non coinvolgono il sezionamento dei tessuti. Robusti approcci di imaging per identificare modelli e caratteristiche della fibrosi attraverso il rimodellamento dinamico della ECM nella fibrosi epatica rafforzerebbero significativamente la comprensione dei meccanismi della NASH e identificherebbero nuovi bersagli terapeutici.
Per affrontare queste sfide, è stato ottimizzato un protocollo rapido ed efficiente per visualizzare l’ECM epatica nativa tramite decellularizzazione7. La decellularizzazione dell’intero fegato è un approccio per rimuovere il contenuto cellulare epatico mantenendo la rete ECM 3D nativa attraverso la perfusione di detergenti. I topi sono stati nutriti con chow o dieta fast-food (FFD) per 14 settimane. La decellularizzazione è stata eseguita dopo perfusione venosa porta in situ con detergente delicato e basse portate per preservare le strutture di collagene fibrillare a tripla elica e nativa. La microscopia a due fotoni è stata applicata per analizzare i cambiamenti nelle strutture del collagene nell’ECM. Le immagini 3D della struttura ECM nativa nei fegati normali e NASH sono state ricostituite e analizzate. L’esecuzione della decellularizzazione della perfusione in situ e l’analisi dello scaffold mediante microscopia a due fotoni fornisce una piattaforma pratica e conveniente per visualizzare il rimodellamento dinamico dell’ECM nel fegato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il presente protocollo mostra che la decellularizzazione attraverso una perfusione DOC in situ a bassa portata preserva le strutture frangibili di collagene fibrillare a tripla elica e nativa, fornendo una piattaforma affidabile ed economica per catturare il rimodellamento dinamico dell’ECM nella fibrosi epatica NASH. Sebbene la decellularizzazione sia stata eseguita in fegati normali e fibrotici prima di identificare i componenti della ECM o generare scaffold biologici per la coltura cellulare, la dinamica del …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Hyesuk Park per l’aiuto tecnico. Questa ricerca è stata sostenuta dal finanziamento del National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, a NJT), National Institute on Aging (NIA), NIH (1R01AG060726, a NJT). Ringraziamo Jon Mulholland e Kitty Lee del Cell Sciences Imaging Facility del Beckman Center per l’assistenza tecnica con l’imaging al microscopio a due fotoni.
Materials
| 4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
| 4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
| AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
| Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
| Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
| Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 – 10 mL – vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
| Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
| Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
| Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
| Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
| Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
| Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |
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