Imagem 3D da Matriz Extracelular Hepática em Modelo de Esteatohepatite Não Alcoólica em Camundongos
Summary
O presente protocolo otimiza os métodos de perfusão/decelularização hepática in situ e microscopia de dois fótons para estabelecer uma plataforma confiável para visualizar a dinâmica do remodelamento da matriz extracelular (MEC) durante a esteato-hepatite não alcoólica (EHNA).
Abstract
A esteatohepatite não alcoólica (EHNA) é a doença hepática crônica mais comum nos Estados Unidos, afetando mais de 70 milhões de americanos. A EHNA pode evoluir para fibrose e, eventualmente, para cirrose, um importante fator de risco para carcinoma hepatocelular. A matriz extracelular (MEC) fornece suporte estrutural e mantém a homeostase hepática via sinais matricelulares. A fibrose hepática resulta de um desequilíbrio no processo de remodelamento dinâmico da MEC e é caracterizada pelo acúmulo excessivo de elementos estruturais e alterações associadas nos glicosaminoglicanos. O padrão típico de fibrose da EHNA é chamado de “fio de galinha”, que geralmente consiste em fibrose perissinusoidal/pericelular da zona 3, com base nas características observadas pela coloração tricrômico de Masson e pelo vermelho de Picrosirius. No entanto, essas técnicas tradicionais de imagem em lâminas de tecido fino bidimensional (2D) não podem demonstrar as alterações estruturais detalhadas da MEC tridimensional (3D), limitando a compreensão do remodelamento dinâmico da MEC na fibrose hepática.
O trabalho atual otimizou um protocolo rápido e eficiente para obter imagens da estrutura nativa da MEC no fígado via decelularização para enfrentar os desafios acima. Os camundongos foram alimentados com ração ou dieta fast-food por 14 semanas. A descelularização foi realizada após perfusão in situ da veia porta, e as técnicas de microscopia de dois fótons foram aplicadas para imagear e analisar as alterações na MEC nativa. As imagens 3D dos fígados normal e NASH foram reconstituídas e analisadas. A realização da decelularização in situ da perfusão e a análise do arcabouço por microscopia de dois fótons forneceram uma plataforma prática e confiável para visualizar o remodelamento dinâmico da MEC no fígado.
Introduction
A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) é a doença hepática mais comum, afetando 20%-25% da população adulta. 25% dos pacientes com DHGNA evoluem para esteato-hepatite não alcoólica (EHNA), onde o risco de cirrose, insuficiência hepática e carcinoma hepatocelular aumenta1. Nos próximos 20 anos, estima-se que a EHNA será responsável por 2 milhões de mortes relacionadas ao fígado nos EUA2. Como não existem tratamentos aprovados, há uma necessidade urgente de decifrar os mecanismos que causam fibrose hepática em pacientes com EHNA e desenvolver tratamento direcionado3.
A matriz extracelular (MEC) é um microambiente dinâmico e complexo que exerce comunicação bidirecional com as células para regular a homeostasetecidual4. A MEC hepática é composta por elementos estruturais como proteoglicanos, colágenos, fibronectina, elastina e outras proteínas não estruturais (por exemplo, olfactomedina e trombospondina) para fornecer suporte físico e estrutural4.
A fibrose hepática é uma resposta crônica da cicatrização de feridas ao dano hepático de várias etiologias, incluindo a EHNA3. Resulta de um desequilíbrio no processo dinâmico de remodelamento da matriz da MEC e é caracterizada pelo excesso de proteínas estruturais no fígado lesado4. A fibrogênese depende da comunicação dinâmica célula-célula entre diferentes tipos de células hepáticas. As células estreladas hepáticas (CTHs), quando ativadas, diferenciam-se em células do músculo liso alfa 2 que expressam, migram e proliferam miofibroblastos como células e sintetizam proteínas da MEC como uma ação de fechamento da ferida. As CTHs ativadas são as células centrais produtoras de colágeno no fígado1.
O mecanismo molecular do remodelamento da MEC, os padrões de fibrose e sua relação com eventos celulares não estão claros. Um melhor entendimento da estrutura tridimensional (3D) da MEC ainda é necessário, embora técnicas de espectrometria de massa tenham ajudado a analisar a composição proteica da MEC4. Tradicionalmente, a coloração tricrômico de Masson, as colorações Picro Sirius Red e a imagem de segunda geração harmônica (SHG) têm sido realizadas em cortes bidimensionais (2D) finos do fígado. O padrão típico de fibrose da EHNA é denominado “fio de galinha”, que se estende até a zona 3 e é fibrose perissinusoidal/pericelular5,6. No entanto, há uma carência de estudos enfocando a estrutura 3D do fígado nativo, particularmente aqueles que não envolvem secção tecidual. Abordagens de imagem robustas para identificar padrões e características da fibrose ao longo do remodelamento dinâmico da MEC na fibrose hepática fortaleceriam significativamente a compreensão dos mecanismos da EHNA e identificariam novos alvos terapêuticos.
Para enfrentar esses desafios, um protocolo rápido e eficiente foi otimizado para obtenção de imagens da MEC hepática nativa via decelularização7. A descelularização do fígado total é uma abordagem para remover o conteúdo celular hepático enquanto mantém a rede nativa de MEC 3D através da perfusão em detergente. Os camundongos foram alimentados com ração ou dieta fast-food (FFD) por 14 semanas. A decelularização foi realizada após perfusão in situ da veia porta com detergente neutro e baixo fluxo, para preservar estruturas de colágeno fibrilar triplo-helicoidal e nativo. A microscopia de dois fótons foi aplicada para analisar as alterações nas estruturas do colágeno na MEC. As imagens 3D da estrutura da MEC nativa em fígados normais e NASH foram reconstituídas e analisadas. A realização da decelularização da perfusão in situ e a análise do arcabouço por microscopia de dois fótons fornecem uma plataforma prática e acessível para visualizar o remodelamento dinâmico da MEC no fígado.
Protocol
Representative Results
Discussion
O presente protocolo mostra que a decelularização através de uma perfusão in situ de COD de baixa taxa de fluxo preserva as estruturas frangíveis de colágeno fibrilar triplo-helicoidal e nativo, fornecendo uma plataforma confiável e econômica para capturar o remodelamento dinâmico da MEC na fibrose hepática da EHNA. Embora a descelularização tenha sido realizada em fígados normais e fibróticos antes da identificação dos componentes da MEC ou da geração de scaffolds biológicos para cultura celu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Hyesuk Park pela ajuda técnica. Esta pesquisa foi apoiada pelo financiamento do Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, para NJT), o Instituto Nacional de Envelhecimento (NIA), NIH (1R01AG060726, para NJT). Agradecemos a Jon Mulholland e Kitty Lee, do Cell Sciences Imaging Facility do Beckman Center, pela assistência técnica com a imagem de microscopia de dois fótons.
Materials
| 4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
| 4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
| AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
| Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
| Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
| Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 – 10 mL – vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
| Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
| Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
| Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
| Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
| Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
| Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |
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