Etablering av en mus Alvorlig Akutt Pankreatitt Modell ved hjelp av Retrograd Injeksjon av Natrium Taurocholate i Biliopankreatisk Kanal
Summary
En musemodell med alvorlig akutt pankreatitt er beskrevet heri. Prosedyren som presenteres her er veldig rask, enkel og tilgjengelig, og dermed potensielt tillate studiet av molekylære mekanismer og forskjellige terapeutiske intervensjoner i akutt pankreatitt på en praktisk måte.
Abstract
Utbredelsen av akutt pankreatitt (AP), spesielt alvorlig akutt pankreatitt (SAP), øker i yngre aldersgrupper årlig. Det er imidlertid mangel på effektive behandlinger i dagens kliniske praksis. Med enkel tilgjengelighet av transgene og knockout-stammer og deres lille størrelse, noe som tillater minimale doser medikamenter som kreves for in vivo-evaluering , er en veletablert eksperimentell modell hos mus foretrukket for AP-forskning. Videre er SAP indusert gjennom natrium taurocholat (TC) for tiden en av de mest brukte og best karakteriserte modellene. Denne modellen har blitt undersøkt for nye terapier og mulige molekylære hendelser under AP-prosessen. Her presenterer vi genereringen av en AP-musemodell ved hjelp av natrium taurocholat og en enkel hjemmelaget mikrosyringe. Videre tilbyr vi også metodikken for den påfølgende histologien og serologisk testing.
Introduction
Akutt pankreatitt (AP) er en akutt betennelse i bukspyttkjertelen preget av obstruksjon av hovedkanalen i bukspyttkjertelen med påfølgende ductal distensjon og bukspyttkjertel autodigestion av sine unormalt aktiverte enzymer. Dens kliniske manifestasjoner inkluderer lokal eller systemisk betennelse, magesmerter og forhøyelse av serum amylase1,2. I henhold til alvorlighetsgradsklassifiseringen3 kan AP presentere i milde, moderate og alvorlige former, og blant dem er alvorlig akutt pankreatitt (SAP) den mest bekymringsfulle tilstanden på grunn av sin høye dødelighet på mer enn 30%4. I USA er AP en av de vanligste årsakene til sykehusinnleggelse, som rammer over 200.000 pasienter5. Videre øker AP, spesielt SAP, årlig og påvirker yngre aldersgrupper6. Det er imidlertid mangel på effektive behandlingsalternativer i dagens kliniske praksis6,7. Derfor er det nødvendig å utforske de molekylære mekanismene som er involvert i AP, og dermed legge til rette for behandlingsforbedring.
Veletablerte eksperimentelle dyremodeller er nødvendig for å studere mekanismene som er involvert i AP og evaluere effektiviteten av ulike behandlingsmodaliteter. Med enkel tilgjengelighet av transgene og knockout-stammer og deres lille størrelse, noe som minimerer dosene av legemidler som kreves for in vivo-evaluering, foretrekkes mus for AP-forskning. Derfor er flere modeller av AP utviklet hos mus8,9.
Niederau et al. utviklet en SAP-musemodell presentert med acinarcellenekrose indusert ved hjelp av samme legemiddel og injeksjonsrute11. Selv om denne modellen har flere fordeler, inkludert ikke-invasivitet, rask induksjon, bred reproduserbarhet og anvendbarhet, er den største ulempen at bare en mild form for AP utvikles i de fleste tilfeller, og dermed begrenser den kliniske relevansen. Alkohol regnes som en av de viktigste etiologiske faktorene i AP; Foitzik et al. rapporterte imidlertid at det bare forårsaker bukspyttkjertelskade når det kombineres med andre faktorer, for eksempel eksokrin hyperstimulering12. Videre, selv om alkoholinduserte AP-modeller utviklet seg via forskjellige administrasjonsruter, og legemiddeldoser har blitt rapportert13,14,15, er deres største ulempe vanskeligheten med å reprodusere dem. Intraperitoneal administrering av L-arginin kan også indusere AP hos mus16; Den lave kliniske relevansen hindrer imidlertid anvendelsen. Taurocholate, et gallesalt, ble først foreslått av Creutzfeld et al. i 1965 for å indusere en tilstand som ligner menneskelig AP via bukspyttkjertelkanalinfusjon17. Selv om det er kontroverser om den kliniske relevansen i patofysiologi18,19, er taurocholatindusert pankreatitt fortsatt en uunnværlig modell for SAP.
Siden denne modellen er enkel å realisere og også er effektiv hos mus, er den nå en av de mest brukte AP-modellene for små dyre in vivo-studier. Perides et al. brukte natrium taurocholat (TC) for å indusere SAP hos mus20, og ga innsikt for å forstå patologien. Kombinert med genetiske modifikasjonsteknikker har denne modellen gjort det mulig for oss å bekrefte flere spesifikke gener involvert i AP. For eksempel viste Bicozo et al. at en knockout av CD38-genet beskyttet mot en modell av TC-infusjon pankreatitt og tilskrev mekanismene til endringer i intracellulær Ca2 + signalering21. Fanczal et al. undersøkte den fysiologiske implikasjonen av TRPM2-uttrykket i plasmamembranen til pankreasatisk mus og kanalceller, og viste redusert alvorlighetsgrad av TC-indusert SAP i TRPM2 knockout mus22. Videre gir denne modellen også en enkel og effektiv måte å teste mange nye stoffer in vivo. For eksempel aktiverte denne metoden validering av de terapeutiske effektene av koffein23, dehydrokolsyre24 og ulike antioksidanter og antikoagulantia25,26. Dette beviset viser allsidigheten til den TC-induserte SAP-modellen. Selv om Wittel et al. beskrev en lignende musemodell27, kan mangel på detaljer om implementeringsprosedyrene føre til manglende evne til å reprodusere funnene. I denne artikkelen fokuserer vi på metoder ved hjelp av en enkel hjemmelaget mikrosyringe og studerer TC-indusert SAP, og gir dermed mulig veiledning ikke bare for videre studier av patogenese og behandling av AP, men også for en perfekt tilpasningsdyktig eksperimentell metode for mange andre stoffer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den TC-induserte SAP-modellen er et utmerket forskningsverktøy. Som vist i denne studien, er denne modellen veldig lett realisert i generelle laboratorier uten å bruke spesifikke enheter. Når den brukes i kombinasjon med histologi og biokjemisk analyse, gir den en kostnads- (billige reagenser) og tidsbesparende (24 timers tidsvindu) tilnærming for å indusere og evaluere AP. Justering av konsentrasjonen av TC gir også muligheten til å produsere mild og moderat AP. Perides et al. brukte også TC for å indusere SAP …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige for støtten fra følgende stipender: et translasjonelt forskningsstipend av NCRCH [2020WSA01], et KJXW Scientific Grant fra Suzhou Commission of Health for Young Scholars [KJXW2020002], en vitenskaps- og teknologiplan for Suzhou City (SKY2021038 og SKJY2021050), et stipend fra Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD), og en primær forsknings- og sosialutviklingsplan for Jiangsu-provinsen (BE2018659).
Materials
| 0.5% iodophor | Shanghai Likang Disinfectant | 310102 | 4 mL/mouse |
| 0.9% sodium chloride | Sinopharm Group Co., Ltd. | 10019318 | 0.8 mL/mouse |
| 1% Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 0.2 -0.25 mL/mouse |
| 25 μL flat tip Microliter syringe | Gaoge, Shanghai | A124019 | |
| 4% Paraformaldehyde | Beyotime, Nantong, China | P0099-500ml | |
| 5% sodium taurocholate (TC) | Aladdin | S100834-5g | 10 μL/SAP mouse |
| 6-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (1/2 circle) | Cheng-He | 20093 | |
| 75% alcohol | Sinopharm Group Co., Ltd. | 10009218 | 4 mL/mouse |
| 8-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (3/8 circle) | Cheng-He | 19064 | |
| ALT Activity Assay Kit | EPNK, Anhui, China | ALT0012 | |
| Amylase Assay Kit | EPNK, Anhui, China | AMY0012 | |
| Angled small bulldog clamp with 12 mm jaw (3 cm) | Cheng-He | HC-X022 | |
| aspen shavings or shreds for mouse bedding | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | VR03015 | |
| AST Activity Assay Kit | EPNK, Anhui, China | AST0012 | |
| Blood Urea Nitrogen (BUN) Assay Kit | EPNK, Anhui, China | BUN0011 | |
| C57BL/6 mouse | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | 213 | |
| Creatine Assay Kit | EPNK, Anhui, China | CRE0012 | |
| Feature microtome blade | Beyotime, Nantong, China | E0994 | |
| Hemostatic Forceps (9.5 cm, Curved) | JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. | JC3901 | |
| Lipase Assay Kit | Jiancheng, Nanjing, China | A054-2-1 | |
| Microtome | Leica biosystem, Germany | RM2245 | |
| Mindray biochemistry analyzer | Mindray, Shenzhen, China | BS-420 | |
| MPO Assay Kit | Jiancheng, Nanjing, China | A044-1-1 | |
| Normal mouse chow | Trophic, Nantong, China | LAD 1000 | |
| Phosphate buffered saline | Beyotime, Nantong, China | C0221A | |
| Straight micro-bulldog clamp with 5 mm jaw (1.5 cm) | JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. | W40130 | |
| Straight or curved forceps (11.0 cm) | Cheng-He | HC-X091A or HC-X090A | |
| Straight Scissors (10.0 cm) | Cheng-He, Ningbo, China | HC-J039102 | |
| Thermo Scientific Centrifuge | Thermo Scientific, USA | Multifuge X1R |
References
- Lee, P. J., Papachristou, G. I. New insights into acute pancreatitis. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (8), 479-496 (2019).
- Mandalia, A., Wamsteker, E. J., DiMagno, M. J. Recent advances in understanding and managing acute pancreatitis. F1000Research. 7, 959 (2018).
- Banks, P. A., et al. Classification of acute pancreatitis-2012: revision of the Atlanta classification and definitions by international consensus. Gut. 62 (1), 102-111 (2013).
- Munir, F., et al. Advances in immunomodulatory therapy for severe acute pancreatitis. Immunology Letters. 217, 72-76 (2020).
- Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143 (5), 1179-1187 (2012).
- Hines, O. J., Pandol, S. J. Management of severe acute pancreatitis. BMJ. 367, 6227 (2019).
- James, T. W., Crockett, S. D. Management of acute pancreatitis in the first 72 hours. Current Opinion in Gastroenterology. 34 (5), 330-335 (2018).
- Silva-Vaz, P., et al. Murine models of acute pancreatitis: a critical appraisal of clinical relevance. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2794 (2019).
- Hyun, J. J., Lee, H. S. Experimental models of pancreatitis. Clinical Endoscopy. 47 (3), 212-216 (2014).
- Renner, I. G., Wisner, J. R., Rinderknecht, H. Protective effects of exogenous secretin on ceruletide-induced acute pancreatitis in the rat. Journal of Clinical Investigation. 72 (3), 1081-1092 (1983).
- Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88 (5), 1192-1204 (1985).
- Foitzik, T., et al. Exocrine hyperstimulation but not pancreatic duct obstruction increases the susceptibility to alcohol-related pancreatic injury. Archives in Surgery. 129 (10), 1081-1085 (1994).
- Schneider, L., Dieckmann, R., Hackert, T., Gebhard, M. M., Werner, J. Acute alcohol-induced pancreatic injury is similar with intravenous and intragastric routes of alcohol administration. Pancreas. 43 (1), 69-74 (2014).
- Huang, W., et al. Fatty acid ethyl ester synthase inhibition ameliorates ethanol-induced Ca2+-dependent mitochondrial dysfunction and acute pancreatitis. Gut. 63 (8), 1313-1324 (2014).
- Sun, J., et al. NRF2 mitigates acute alcohol-induced hepatic and pancreatic injury in mice. Food and Chemical Toxicology. 121, 495-503 (2018).
- Kui, B., et al. New insights into the methodology of L-arginine-induced acute pancreatitis. PLoS One. 10 (2), 0117588 (2015).
- Creutzfeldt, W., Schmidt, H., Horbach, I. Studies on the effects of a trypsin inhibitor (Trasylol) on Enzyme activities and morphology in taurocholate and calciphylaxis pancreatitis of the rat (a contribution to the pathogenesis of pancreatitis). Klin Wochenschr. 43, 15-22 (1965).
- Liu, Z. H., et al. A simple taurocholate-induced model of severe acute pancreatitis in rats. World Journal of Gastroenterology. 15 (45), 5732-5739 (2009).
- Cavdar, F., et al. Controversial issues in biliary pancreatitis: when should we perform MRCP and ERCP. Pancreatology. 14 (5), 411-414 (2014).
- Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5 (2), 335-341 (2010).
- Orabi, A. I., et al. Cluster of differentiation 38 (CD38) mediates bile acid-induced acinar cell injury and pancreatitis through cyclic ADP-ribose and intracellular calcium release. Journal of Biological Chemistry. 288 (38), 27128-27137 (2013).
- Fanczal, J., et al. TRPM2-mediated extracellular Ca(2+) entry promotes acinar cell necrosis in biliary acute pancreatitis. Journal of Physiology. 598 (6), 1253-1270 (2020).
- Huang, W., et al. Caffeine protects against experimental acute pancreatitis by inhibition of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor-mediated Ca2+ release. Gut. 66 (2), 301-313 (2017).
- Zhang, X., et al. Dehydrocholic acid ameliorates sodium taurocholate-induced acute biliary pancreatitis in mice. Biology and Pharmaceutical Bulletin. 43 (6), 985-993 (2020).
- Hagiwara, S., et al. Antithrombin III prevents cerulein-induced acute pancreatitis in rats. Pancreas. 38 (7), 746-751 (2009).
- Hagiwara, S., et al. Danaparoid sodium prevents cerulein-induced acute pancreatitis in rats. Shock. 32 (1), 94-99 (2009).
- Wittel, U. A., et al. Taurocholate-induced pancreatitis: a model of severe necrotizing pancreatitis in mice. Pancreas. 36 (2), 9-21 (2008).
- Barlass, U., et al. Morphine worsens the severity and prevents pancreatic regeneration in mouse models of acute pancreatitis. Gut. 67 (4), 600-602 (2018).
- Wu, D., et al. A systematic review of NSAIDs treatment for acute pancreatitis in animal studies and clinical trials. Clinical Research in Hepatology and Gastroenterology. 44, 100002 (2020).
- Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Annals in Surgery. 215 (1), 44-56 (1992).
- Junyuan, Z., et al. Quercetin protects against intestinal barrier disruption and inflammation in acute necrotizing pancreatitis through TLR4/MyD88/p38MAPK and ERS inhibition. Pancreatology. 18 (7), 742-752 (2018).
- Waldron, R. T., et al. The Orai Ca(2+) channel inhibitor CM4620 targets both parenchymal and immune cells to reduce inflammation in experimental acute pancreatitis. Journal of Physiology. 597 (12), 3085-3105 (2019).
- Petersen, O. H., Gerasimenko, J. V., Gerasimenko, O. V., Gryshchenko, O., Peng, S. The roles of calcium and ATP in the physiology and pathology of the exocrine pancreas. Physiological Reviews. 101 (4), 1691-1744 (2021).
