Etablierung eines Mausmodells für schwere akute Pankreatitis mittels retrograder Injektion von Natriumtaurocholat in den Gallengang
Summary
Ein Mausmodell der schweren akuten Pankreatitis wird hierin beschrieben. Das hier vorgestellte Verfahren ist sehr schnell, einfach und zugänglich und ermöglicht so möglicherweise die Untersuchung der molekularen Mechanismen und verschiedener therapeutischer Interventionen bei akuter Pankreatitis auf bequeme Weise.
Abstract
Die Prävalenz der akuten Pankreatitis (AP), insbesondere der schweren akuten Pankreatitis (SAP), nimmt in jüngeren Altersgruppen jährlich zu. In der aktuellen klinischen Praxis mangelt es jedoch an wirksamen Behandlungen. Mit der leichten Zugänglichkeit von transgenen und Knockout-Stämmen und ihrer geringen Größe, die minimale Dosen von Medikamenten ermöglicht, die für die In-vivo-Bewertung erforderlich sind, wird ein gut etabliertes experimentelles Modell an Mäusen für die AP-Forschung bevorzugt. Darüber hinaus ist SAP induziert durch Natriumtaurocholat (TC) derzeit eines der am weitesten verbreiteten und am besten charakterisierten Modelle. Dieses Modell wurde auf neuartige Therapien und mögliche molekulare Ereignisse während des AP-Prozesses untersucht. Hier stellen wir die Generierung eines AP-Mausmodells unter Verwendung von Natriumtarocholat und einer einfachen hausgemachten Mikrospritze vor. Darüber hinaus stellen wir auch die Methodik für die anschließende Histologie und serologische Untersuchung zur Verfügung.
Introduction
Akute Pankreatitis (AP) ist eine akute Entzündung der Bauchspeicheldrüse, die durch eine Obstruktion des Hauptgangs der Bauchspeicheldrüse mit anschließender duktaler Dehnung und Pankreas-Autodigestion durch ihre abnormal aktivierten Enzyme gekennzeichnet ist. Zu seinen klinischen Manifestationen gehören lokale oder systemische Entzündungen, Bauchschmerzen und eine Erhöhung der Serumamylase1,2. Gemäß der Schweregradklassifikation3 kann AP in leichten, mittelschweren und schweren Formen auftreten, und unter ihnen ist die schwere akute Pankreatitis (SAP) aufgrund ihrer hohen Sterblichkeitsrate von mehr als 30%4 die besorgniserregendste Erkrankung. In den Vereinigten Staaten ist AP einer der häufigsten Gründe für einen Krankenhausaufenthalt und betrifft über 200.000 Patienten5. Darüber hinaus nimmt apen, insbesondere SAP, jährlich zu und betrifft jüngere Altersgruppen6. Allerdings mangelt es in der aktuellen klinischen Praxis an wirksamen Behandlungsmöglichkeiten6,7. Daher ist es notwendig, die molekularen Mechanismen zu erforschen, die an AP beteiligt sind, um so die Verbesserung der Behandlung zu erleichtern.
Gut etablierte experimentelle Tiermodelle sind erforderlich, um die an AP beteiligten Mechanismen zu untersuchen und die Wirksamkeit verschiedener Behandlungsmodalitäten zu bewerten. Mit der leichten Zugänglichkeit von transgenen und Knockout-Stämmen und ihrer geringen Größe, die die für die In-vivo-Bewertung erforderlichen Dosen von Medikamenten minimiert, werden Mäuse für die AP-Forschung bevorzugt. Daher wurden mehrere Modelle von AP an Mäusen entwickelt8,9.
Niederau et al. arbeiteten aus einem Rattenmodell mit leichter Pankreatitis, das durch die intravenöse Verabreichung von Caerulein10 induziert wurde, ein SAP-Mausmodell mit aznarer Zellnekrose, die mit demselben Medikament und injektionsweg induziert wurde11. Obwohl dieses Modell mehrere Vorteile besitzt, darunter Nichtinvasivität, schnelle Induktion, breite Reproduzierbarkeit und Anwendbarkeit, besteht der Hauptnachteil darin, dass in den meisten Fällen nur eine milde Form von AP entwickelt wird, wodurch seine klinische Relevanz eingeschränkt wird. Alkohol gilt als einer der wichtigsten ätiologischen Faktoren von AP; Foitzik et al. berichteten jedoch, dass es nur in Kombination mit anderen Faktoren wie exokriner Hyperstimulation eine Pankreasverletzung verursacht12. Obwohl alkoholinduzierte AP-Modelle, die über verschiedene Verabreichungswege entwickelt wurden, und Arzneimitteldosen berichtet wurden13,14,15, ist ihr Hauptnachteil die Schwierigkeit, sie zu reproduzieren. Die intraperitoneale Verabreichung von L-Arginin kann bei Mäusen auch AP induzieren16; Seine geringe klinische Relevanz behindert jedoch seine Anwendung. Taurocholat, ein Gallensalz, wurde erstmals 1965 von Creutzfeld et al. vorgeschlagen, um einen Zustand zu induzieren, der der menschlichen AP über pankreatische Ganginfusion ähnelt17. Obwohl kontroversen über ihre klinische Relevanz in der Pathophysiologie bestehen18,19, bleibt die Taurocholat-induzierte Pankreatitis ein unverzichtbares Modell für SAP.
Da dieses Modell einfach zu realisieren ist und auch bei Mäusen wirksam ist, ist es heute eines der am häufigsten verwendeten AP-Modelle für Kleintier-In-vivo-Studien. Perides et al. verwendeten Natriumtaurocholat (TC), um SAP bei Mäusen zu induzieren20 und lieferten Einblicke in das Verständnis seiner Pathologie. In Kombination mit genetischen Modifikationstechniken hat uns dieses Modell ermöglicht, mehrere spezifische Gene zu bestätigen, die an AP beteiligt sind. Zum Beispiel zeigten Bicozo et al., dass ein Knockout des CD38-Gens vor einem Modell der TC-Infusions-Pankreatitis schützte und die Mechanismen auf Veränderungen in der intrazellulären Ca2+-Signalgebung zurückführte21. Fanczal et al. untersuchten die physiologischen Implikationen der TRPM2-Expression in der Plasmamembran von Pankreas-Acinar- und duktalen Zellen der Maus und zeigten einen reduzierten Schweregrad von TC-induziertem SAP bei TRPM2-Knockout-Mäusen22. Darüber hinaus bietet dieses Modell auch eine einfache und effektive Möglichkeit, viele neuartige Medikamente in vivo zu testen. Diese Methode ermöglichte beispielsweise die Validierung der therapeutischen Wirkungen von Koffein23, Dehydrocholsäure24 und verschiedenen Antioxidantien und Antikoagulanzien25,26. Diese Evidenz zeigt die Vielseitigkeit des TC-induzierten SAP-Modells. Obwohl Wittel et al. ein ähnliches Mausmodell27 beschrieben, könnte ein Mangel an Details zu den Implementierungsverfahren dazu führen, dass die Ergebnisse nicht reproduziert werden können. In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf Methoden mit einer einfachen hausgemachten Mikrospritze und untersuchen TC-induziertes SAP und bieten damit eine mögliche Anleitung nicht nur für die weitere Untersuchung der Pathogenese und Behandlung von AP, sondern auch für eine perfekt anpassungsfähige experimentelle Methode für viele andere Substanzen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das TC-induzierte SAP-Modell ist ein hervorragendes Forschungsinstrument. Wie in dieser Studie gezeigt, ist dieses Modell in allgemeinen Labors sehr einfach zu realisieren, ohne spezielle Geräte zu verwenden. In Kombination mit Histologie und biochemischer Analyse bietet es einen kosten- (kostengünstige Reagenzien) und zeitsparenden (24 h Zeitfenster) Ansatz zur Induktion und Bewertung von AP. Die Anpassung der TC-Konzentration bietet auch die Möglichkeit, milde und moderate AP zu erzeugen. Perides et al. verwendeten …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar für die Unterstützung durch die folgenden Stipendien: ein Translational Research Grant des NCRCH [2020WSA01], ein KJXW Scientific Grant der Suzhou Commission of Health for Young Scholars [KJXW2020002], ein Wissenschafts- und Technologieplan der Stadt Suzhou (SKY2021038 und SKJY2021050), ein Zuschuss aus dem Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) und ein Primary Research & Social Development Plan der Provinz Jiangsu (BE2018659).
Materials
| 0.5% iodophor | Shanghai Likang Disinfectant | 310102 | 4 mL/mouse |
| 0.9% sodium chloride | Sinopharm Group Co., Ltd. | 10019318 | 0.8 mL/mouse |
| 1% Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 0.2 -0.25 mL/mouse |
| 25 μL flat tip Microliter syringe | Gaoge, Shanghai | A124019 | |
| 4% Paraformaldehyde | Beyotime, Nantong, China | P0099-500ml | |
| 5% sodium taurocholate (TC) | Aladdin | S100834-5g | 10 μL/SAP mouse |
| 6-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (1/2 circle) | Cheng-He | 20093 | |
| 75% alcohol | Sinopharm Group Co., Ltd. | 10009218 | 4 mL/mouse |
| 8-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (3/8 circle) | Cheng-He | 19064 | |
| ALT Activity Assay Kit | EPNK, Anhui, China | ALT0012 | |
| Amylase Assay Kit | EPNK, Anhui, China | AMY0012 | |
| Angled small bulldog clamp with 12 mm jaw (3 cm) | Cheng-He | HC-X022 | |
| aspen shavings or shreds for mouse bedding | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | VR03015 | |
| AST Activity Assay Kit | EPNK, Anhui, China | AST0012 | |
| Blood Urea Nitrogen (BUN) Assay Kit | EPNK, Anhui, China | BUN0011 | |
| C57BL/6 mouse | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | 213 | |
| Creatine Assay Kit | EPNK, Anhui, China | CRE0012 | |
| Feature microtome blade | Beyotime, Nantong, China | E0994 | |
| Hemostatic Forceps (9.5 cm, Curved) | JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. | JC3901 | |
| Lipase Assay Kit | Jiancheng, Nanjing, China | A054-2-1 | |
| Microtome | Leica biosystem, Germany | RM2245 | |
| Mindray biochemistry analyzer | Mindray, Shenzhen, China | BS-420 | |
| MPO Assay Kit | Jiancheng, Nanjing, China | A044-1-1 | |
| Normal mouse chow | Trophic, Nantong, China | LAD 1000 | |
| Phosphate buffered saline | Beyotime, Nantong, China | C0221A | |
| Straight micro-bulldog clamp with 5 mm jaw (1.5 cm) | JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. | W40130 | |
| Straight or curved forceps (11.0 cm) | Cheng-He | HC-X091A or HC-X090A | |
| Straight Scissors (10.0 cm) | Cheng-He, Ningbo, China | HC-J039102 | |
| Thermo Scientific Centrifuge | Thermo Scientific, USA | Multifuge X1R |
References
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