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Bioengineering

用于秀丽隐杆线虫长期生长和成像的简单微流控芯片

Published: April 11, 2022 doi: 10.3791/63136
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,5, 2
1National Centre for Biological Sciences, TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR, 3InSTEM, 4Manipal Academy of Higher Education, 5Department of Mechanical Engineering, The University of Texas at Austin

Summary

该协议描述了一种简单的微流控芯片设计和微加工方法，用于在连续食物供应的情况下生长秀 丽隐杆线虫 长达36小时。生长和成像设备还可以在发育过程中对细胞和亚细胞过程进行数天的间歇性长期高分辨率成像。

Abstract

秀丽隐杆线虫（秀丽隐杆线虫）已被证明是研究发育和细胞生物学过程的宝贵模型系统。了解这些生物过程通常需要对同一动物进行长期和重复的成像。在琼脂垫上进行的传统固定方法相关的长恢复时间对动物健康有不利影响，因此不适合长时间重复对同一只动物进行成像。本文描述了一种微流控芯片设计、制造方法、片上秀丽隐杆线虫培养方案，以及用于研究个体动物发育过程的三个长期成像示例。该芯片由聚二甲基硅氧烷制成并粘合在盖玻片上，使用使用氮气偏转的弹性膜将动物固定在玻璃基板上。秀丽隐杆线虫的完全固定能够以无麻醉的方式对细胞和亚细胞事件进行可靠的延时成像。具有大横截面的通道几何形状允许动物在两个部分密封的隔离膜内自由移动，从而允许在通道中连续食物供应生长。使用这种简单的芯片，可以对发育现象进行成像，例如当动物在通道内生长时，PVD感觉神经元中的神经元突生长，外阴发育和树突状树枝状化。长期生长和成像芯片使用单一压力管路运行，无需外部阀门，廉价的流体耗材，并利用标准蠕虫处理协议，其他实验室使用秀丽隐杆线虫可以轻松适应。

Introduction

秀丽隐杆线虫已被证明是研究细胞生物学、衰老、发育生物学和神经生物学的强大模式生物。诸如透明的身体，较短的生命周期，易于维护，确定数量的细胞，与多个人类基因的同源性以及经过充分研究的遗传学等优点使秀丽隐杆线虫成为基础生物学发现和应用研究的流行模型1，2。通过对个体动物的反复长期观察来了解细胞的生物学和发育过程可以证明是有益的。传统上，秀丽隐杆线虫在琼脂垫上麻醉并在显微镜下成像。麻醉剂对动物健康的不利影响限制了麻醉动物对同一动物进行长期和重复间歇成像的使用3，4。微流体技术的最新进展及其对秀丽隐杆线虫无麻醉诱捕的适应性，可以忽略不计的健康危害，从而能够在短时间内对同一只动物进行高分辨率成像。

微流控芯片已被设计用于秀丽隐杆线虫5高通量筛选6，7，8，捕获和分配9，药物筛选10，11，具有高分辨率成像的神经元刺激12和动物的高分辨率成像12，13，14。还开发了用于固定在载玻片上的超薄微流体片15。已经使用在液体培养物中生长的动物的低分辨率图像对秀丽隐杆线虫进行了长期研究，以观察生长，钙动力学，药物对其行为的影响16，17，18，19，寿命和衰老20。已经使用高分辨率显微镜进行了长期研究，以评估突触发育21，神经元再生22和线粒体添加23。在多通道设备中已经完成了细胞命运和分化的长期高分辨率成像和追踪24，25。几个细胞和亚细胞事件发生在几个小时的时间尺度上，需要在其发育过程中的不同时间点捕获同一个个体，以表征过程中的所有中间步骤，以了解体内细胞动力学。为了成像器官发生、神经元发育和细胞迁移等生物过程，需要在多个时间点以相同的方向固定动物。我们之前已经发表了一个协议，用于对秀丽隐杆线虫进行超过 36 小时的高分辨率成像，以确定线粒体沿触摸受体神经元 （TRN） 添加的位置23。

本文提供了一种协议，用于建立基于微流体的重复高分辨率成像方法。该设备具有单个流道，最适合每个设备对单个动物进行重复成像。为了提高通量并同时对许多动物进行成像，可以将多个设备连接到同一压力管线，但使用单独的三路连接器控制每个设备中的单个动物。该设计适用于需要高分辨率延时图像的研究，例如胚胎后发育过程、细胞迁移、细胞器运输、基因表达研究等。该技术可能会限制某些应用，例如需要对许多晚期动物进行平行生长和成像的寿命和衰老研究。聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体由于其生物稳定性26，生物相容性27，28，透气性29，30和可调弹性模量31而用于制造该装置。这种两层装置允许在微流体通道中连续供应食物的动物生长，并通过使用氮气的PDMS膜压缩捕获单个秀丽隐杆线虫。该设备是先前发布的设备的扩展，具有在连续食物供应下在微通道中生长和成像同一动物的优点3。额外的隔离膜网络和 2 mm 宽的捕获膜能够有效地固定发育中的动物。该装置已被用于观察感觉PVD神经元中的神经元发育，外阴发育和树突状树枝化。动物在装置中生长时不会对健康产生不利影响，并且可以反复固定以促进在其发育过程中对同一动物的亚细胞事件进行成像。

整个协议分为五个部分。第 1 部分描述了生长和成像芯片的器件制造。第 2 部分介绍如何为 PDMS 膜偏转设置压力系统，以固定和隔离单个 秀丽隐杆线虫。第 3 部分介绍如何在线虫生长培养基 （NGM） 板上同步秀 丽隐杆线 虫以进行设备成像。第4部分介绍如何在设备中加载单个动物并在微流体装置内将动物生长数天。第 5 部分介绍如何在多个时间点固定单个动物，使用不同的物镜捕获高分辨率图像，并使用斐济分析图像。

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Protocol

1. 生长成像装置的制造

  1. SU8模具制造
    1. 在文字处理软件（或计算机辅助设计CAD软件）中使用矩形设计图案1（流层）和2（控制层），并在激光绘图仪的帮助下在聚酯基薄膜上打印光掩模，最小特征尺寸为8μm（图1）。
    2. 将硅晶片切成 2.5 厘米× 2.5 厘米片，并用 20% KOH 清洁 1 分钟。用去离子 （DI） 水冲洗晶圆。流量和控制层各使用一个晶圆。
      注意：KOH具有腐蚀性，应小心处理。
    3. 用14psi压缩氮气干燥碎片，然后在120°C的热板上脱水4小时。在继续下一步之前，将两块冷却至室温。
    4. 取一块硅片，将其放在旋涂机的卡盘上，然后打开真空以将晶圆固定到位。在硅片上，放入 ~20 μL 六甲基二硅烷 （HMDS），并使用旋涂机以每分钟 500 转 （rpm） 的速度涂覆 5 秒，然后以 3，000 rpm 的速度涂覆 30 秒。
      注意：此步骤应在黄灯下执行。请勿在室内使用白光。
    5. 为了获得~40μm的均匀光刻胶厚度（特定于流动层;适用于成像早期幼虫阶段1至阶段3（L1 - L3）动物），使用旋涂机在硅晶片上涂覆~1.5mL负光刻胶-1，转速为500 rpm，持续5秒，然后2，000 rpm，持续30秒。
    6. 对第二个晶片重复步骤1.1.4和1.1.5，以获得特定于控制层的~40μm的均匀光刻胶厚度。
    7. 或者，为了将老年动物的流动层厚度增加到~80μm，使用旋涂机以500rpm的速度涂覆硅晶片5秒，然后以2，000rpm的速度涂覆硅晶片30秒。该厚度适用于L3期至成年动物。
      注意：将硅晶圆放在两侧，以免损坏旋涂层。在此步骤中保持白灯关闭。
    8. 将光刻胶涂层的硅片（用于流动和控制层）在65°C的热板上烘烤1分钟，然后在95°C下烘烤10分钟。将烤好的块冷却至室温。
      注意：烘烤的硅片可以存放一天，然后再进行下一步。存放在黑暗中，不要暴露在白光下。
    9. 将软烤硅片放在紫外照明器的曝光台上，光刻胶涂层表面朝向紫外灯。使用200 W灯将两块分别暴露在紫外线下15秒，通过图案1和2的光掩模分别获得流动和控制层。
      注意：佩戴护目镜，避免直接暴露在紫外线下。在此阶段，请勿打开房间内的白灯。
    10. 烘烤两个暴露的硅片，涂层朝上，在65°C下，然后分别在95°C下烘烤1分钟和10分钟。将碎片冷却至室温，然后再继续下一步。
    11. 通过将硅片浸泡在光刻胶显影剂溶液中（显影剂在异丙醇中的1：3稀释）中20分钟来显影图案。一旦图案可见，用纯异丙醇 （IPA） 冲洗碎片，然后用氮气 （14 psi） 轻轻吹干。
      注意：使用通风良好的环境进行这种化学处理，以避免人类接触。仅在显影并用 IPA 冲洗特征后使用白光。
    12. 将硅片放在干燥器中，涂层表面朝上。将 50 μL 纯三氯（1H、1H、2H、2H-全氟辛基）硅烷倒在小塑料杯或载玻片上，将碎片暴露于硅烷蒸气中。将杯子/载玻片放入干燥器内并孵育2小时。
      注意：避免直接接触硅烷蒸气。始终使用密封室进行硅烷蒸汽处理。
      注意：如有必要，开发的硅片可以存储1-2天，然后再进行下一步。
  2. PDMS芯片制造
    1. 通过将弹性体基材与固化剂以 10：1 的比例混合，在塑料杯中制备 PDMS。通过不断搅拌3分钟将内容物充分混合。混合会在PDMS混合物中产生大量气泡。
    2. 将PDMS混合物在干燥器中脱气30分钟以除去所有气泡。
      注意：确保在将气泡倒入功能之前从PDMS混合物中去除气泡，因为气泡会导致设备有缺陷且无法正常工作。
    3. 将带有控制层（图案2）的硅晶片放入培养皿中。将 5 mm 厚的 PDMS 混合层轻轻倒在硅片上，避免形成任何气泡。
    4. 在干燥器中对PDMS混合物进行脱气，以去除PDMS浇注过程中形成的其他气泡。
    5. 将带有流动层（图案 1）的硅晶片放在旋转卡盘上，施加 200-500 mTorr 真空压力以保持晶圆。将 ~1 mL PDMS 倒在硅晶片上，并使用旋涂机以 500 rpm 的速度涂覆 5 秒，然后以 1，000 rpm 的速度涂覆 30 秒，以获得 ~80 μm 厚的层。
    6. 用旋涂的PDMS烘烤两个硅片，并在热空气对流烘箱中于50°C下倒入PDMS层6小时。烘烤后，等待碎片在室温下冷却。
    7. 使用锋利的刀片从控制层周围的硅片（图案 2）上切下 5 mm 厚的 PDMS 层，然后将其从硅衬底上剥离。
    8. 在PDMS块的储液罐上使用Harris打孔机打出两个直径~1 mm的孔，将固定通道和隔离通道入口连接到用于PDMS膜偏转的气体管线。
    9. 将带有旋涂PDMS层的硅片放在图案1（流动层）上，PDMS涂层表面朝上，放在塑料托盘上。将带有图案 2（控制层）的冲孔 PDMS 块放在托盘上，模制面朝上。
    10. 将塑料托盘放在等离子清洁剂内，并将两个PDMS表面暴露在18 W空气等离子体下在低真空（200-600 mTorr）下2分钟。施加真空，直到腔室变成亮紫色。在弱光下执行此步骤以查看等离子颜色变化。
    11. 取出两个等离子体处理的块，通过将图案 1 和 2 的等离子处理表面压在一起来轻轻地结合块。在热空气对流烤箱中在50°C下烘烤粘合图案2小时。
    12. 将粘合的设备从烤箱中取出。用图案 1 和图案 2 从硅晶圆上切割出粘合器件，并使用 Harris 打孔机在流动层的入口和出口储液器上打孔。
    13. 将粘合的PDMS块，使流动层朝上放在塑料托盘上。将干净的盖玻片 （#1.5） 放在同一个托盘上。将块和盖玻片暴露在18 W空气等离子体下2分钟。调整真空压力以查看紫色腔室。
      注意：此步骤应在弱光下完成，以查看等离子颜色变化。要清洁盖玻片，请用 IPA 清洗并使用 14 psi 的氮气吹干。
    14. 将等离子曝光的PDMS块放在盖玻片的顶部，并在50°C的烤箱中烘烤粘合结构2小时。将设备存放在洁净室中，以备将来进行任何实验。

2. PDMS膜启动

  1. 拿起设备并将其放在体视显微镜上并连接管子。将微柔性管（内径 ~5 mm，外径 ~8 mm）连接到一端的压缩氮气管。连接另一端的三路连接器。三通连接器的管 1 和 2 将分别连接到捕集膜和隔离膜。
  2. 将两个微柔性管（内径 ~1.6 mm，外径 ~5 mm）连接到三通旋塞阀的两个出口。将两个管的另一端连接到 8 mm 长的 18 G 针头上。
  3. 使用微量移液器通过入口口用M9缓冲液填充流动层。通过连接到针头的一端用去离子水填充两个管子。将两根针插入打孔中，分别连接隔离膜和捕获膜。
  4. 在 14 psi 下打开氮气调节器，然后从管 1 转动三通阀，通过控制层（即捕集膜和隔离膜）中的微流体通道将水推入设备。
  5. 等到水充满通道，两个通道中都不存在任何空气滴。一旦通道完全充满水，通道就被认为是已启动的。
  6. 一旦通道充满水并注好底漆，就使用三通旋塞阀释放压力。灌注会导致流动层中出现气泡，通过流经流道的额外介质来去除气泡。

3. 秀丽隐杆线虫 的维护和同步

注意：秀丽隐杆线虫菌株：该研究使用以下转基因PS3239（dpy-20（e1282）syIs49 IV [MH86p（dpy-20（+） + pJB100（ZMP-1：：GFP）]）用于外阴发育32，jsIs609（mec7p：：MLS（线粒体基质定位信号）：：GFP）33用于触摸受体神经元（TRN）发育和线粒体转运成像，以及wdIs51（F49H12.4：：GFP + unc-119（+））跟踪PVD发育34。遵循标准秀丽隐杆线虫培养和维持方案35。

  1. 在线虫生长培养基（NGM）培养皿上生长秀 丽隐杆线虫 ，大 肠杆菌 OP50作为食物来源，温度为22°C。 通过反复转移一些雌雄同体或将少量琼脂与少数动物一起切块到带有OP50草坪的新NGM平板上来维持 秀丽隐杆线虫 菌株。
  2. 3-5天后，检查NGM板的动物生长和 秀丽隐杆线虫 卵。收集大约 30 个鸡蛋并将其从盘子转移到带有 OP50 草坪的新鲜 NGM 盘中。
  3. 为了同步动物进行成像，每2小时将所有未孵化的卵从平板转移到新鲜板上，并将其保持在22°C。 每个盘子上大约会孵化 15-20 个卵。
  4. 分别在孵化后14-16小时和28-30小时之间挑选动物幼虫2（L2）和幼虫3（L3）阶段。将动物转移到微流体装置进行成像。按照下一节所述添加食物供应，以将动物保持在设备内以进行长期生长和成像实验。

4. 秀丽隐杆线虫 生长内部生长及成像微流控装置

  1. 在连接隔离膜和固定膜后，在低放大倍率（4x或10x）下将生长和成像微流体装置安装在倒置显微镜上并观察图案2。确保通道充满干净的蒸馏水。
  2. 使用 10 mL 1 M 柠檬酸钾 pH 6.0、10 mL 痕量金属溶液、3 mL 1 M CaCl2、3 mL 1 M MgSO4 制备新鲜的 1 L S 培养基溶液。在无菌条件下制备溶液。不要高压灭菌S介质。
  3. 在实验前10分钟用生长培养基（S培养基）填充流道。避免流道中出现任何气泡。如果需要，流动额外的介质以去除气泡。
  4. 使用微量移液器从 10 μL S 培养基中的 NGM 板中从所需的发育阶段挑选一只动物，并通过入口孔将动物推入流道。
  5. 使用低倍率物镜监测动物在流道中的位置。将额外的介质流过入口或出口以推动动物并将其放置在两个隔离膜之间限制的流道内。
  6. 打开三通旋塞阀，在隔离通道中施加 14 psi 的压力，并将膜向下推入流道。
    注意：膜部分密封流道，并将动物运动限制在两个隔离膜之间的区域。
  7. 使用来自条纹板的大肠杆菌OP50的单个菌落接种250mL L肉汤（2.5 g 杆菌 胰蛋白胨，1.25 g杆菌酵母，1.25 g NaCl in H2O）。将接种的培养物在37°C下培养过夜。
  8. 将 500 μL OP50 培养物分装到 1.5 mL 无菌离心管中，并将原液和等分试样在 4 °C 下储存 2 周。
  9. 通过以1.3× g 离心5分钟来沉淀OP50培养物。用 1 mL 新鲜 S 培养基（0.5 倍稀释）溶解沉淀，并在室温下储存 3-4 天。使用这种稀释的OP50在微流体装置内喂养秀 丽隐杆线虫 。
  10. 在入口和出口储液罐顶部留下一滴 S 介质，以减少 S 介质在流道中的蒸发。
  11. 在10μL微量移液器中取稀释的OP50溶液。从移液器中取出装有OP50溶液的微量吸头，然后将吸头压入入口储液槽中。然后将另一个微量移液器吸头放入 10 μL 食品溶液中，并将其插入出口储液槽中。
  12. 用手指施加压力密封吸头，以确保食品溶液的连续性，没有任何气隙。每天用OP50溶液更换微量移液器吸头，不超过3-4天。
  13. 在两个吸头中额外填充 20-30 μL 的食物溶液。在微量移液器吸头中加入或取出食物溶液，以调整梯度以推动动物进入流道，并调整动物在捕获膜下的位置以进行成像。
  14. 使用明场图像监测细菌的流动，以确保其连续通过流道中的部分封闭隔离膜。
    注意：在没有细菌流动的情况下，动物可能会吃掉两个隔离膜之间的流动通道中的可用细菌。如果通道中没有细菌或没有流量，请将入口和出口处的两个微量移液器吸头更换为装满新鲜制备食品的新移液器吸头。

5. 秀丽隐杆线虫 固定和成像

  1. 秀丽隐杆线虫 在诱捕膜下的固定
    1. 以低倍率在生长通道中定位单个动物。调整连接到入口和出口储液槽的两个微量移液器吸头中的食品溶液高度。利用流道中的静水压差将动物推向所需方向。
    2. 将动物定位在诱捕膜的中心，并使用低放大倍率物镜（4x）监测其游泳行为。
    3. 转动三向旋塞阀，缓慢增加疏水阀通道中的压力。沿生长通道边界壁以直线姿势将动物固定在诱捕膜下。
      注意：避免将动物困在流道上以 Z 或 U 形弯曲位置。这会导致动物身体受到更大的压力挤压，并对其健康造成永久性损害。
  2. 秀丽隐杆线虫成像 和从膜释放
    1. 将设备携带并装载到显微镜载物台上。在所需的成像设置下设置倒置显微镜，使用所有必要的光学组件（物镜、光源、荧光滤光片和检测器）进行高分辨率明场、差分成像对比度（DIC）或荧光成像（补充图1）。
    2. 获取单个或多个延时荧光图像以捕获细胞和亚细胞事件。
    3. 使用60x，1.4数值孔径（NA）物镜，具有7%-10%激光功率的488 nm波长激光器，CCD相机，在旋转盘式显微镜上获取 秀丽隐杆线虫 神经元的荧光图像作为其发育的功能。使用显微镜随附的软件进行延时成像，并以每秒4帧的速度采集图像（补充图1）。
    4. 采集图像后，释放诱捕压力并以低倍率 - 4x和10x监测动物的运动。将动物限制在由隔离膜定义的区域内（在整个实验过程中保持在14 psi以下）。
    5. 调整两个微量移液器吸头中食物溶液的体积，以继续生长通道中缓慢的重力驱动食物流。这种食物流是通过调节入口和出口处微量移液器中食物溶液的水平（通常为1-5毫米的高度差）获得的。
    6. 从生长通道中细菌的流动模式可视化明场下的流动。
      注意：在没有流动的情况下，动物吃掉可用的OP50细菌，通道看起来很清晰，动物会在几个小时内挨饿。饥饿的动物通常会产生高自发荧光，在获取延时荧光图像时很容易观察到。这些事件对动物生理有不利影响，在实验中被避免。
    7. 在预定时间间隔后重复步骤5.2.1-5.2.3，以获取同一个体在多个时间点的荧光/ DIC/明场图像。
    8. 在多个所需时间点从同一只动物获取图像后，释放隔离和捕获压力。用 M9 缓冲液冲洗通道并将动物推入入口储液罐。从水库中回收动物并将动物放在新鲜的NGM板上以进行进一步的健康监测。
    9. 用M9缓冲液冲洗通道几次以去除细菌。用70%乙醇（用蒸馏水稀释）冲洗流道。通过使用注射器推动空气来干燥通道。将设备存放在干燥无尘的地方，以便将来重复使用。
  3. 图像分析和统计
    1. 使用斐济ImageJ软件进行tiff图像分析。在斐济 ImageJ 中打开来自 wdIs51 动物的 PVD 延时图像的 tiff 图像。通过选择 Axes 选项卡> Z 项目中的堆栈>，从显示主要进程的 z 平面堆栈中提取最佳平面。
    2. 筛选整个图像系列，并使用动物图像帧的重叠部分找到成功覆盖整个神经元过程的特定图像帧。从 FIJI 工具栏中选择插件 >分析>单元格计数器 。这将打开一个窗口，用于对不同的分支进行编号并保留每个选定神经元的计数。
    3. 选择 “初始化>计数器”> Type1，然后标记辅助分支。然后选择 类型 2 并标记 第四纪，单击 显示 所有分支计数的结果窗口（补充图 2）。此方法将显示已计数的分支。
    4. 打开下一个重叠的图像并计算剩余的分支。此过程将防止重复计算并确保每个过程都被计算在内。识别并计算 秀丽隐杆线虫早期幼虫阶段存在的初级分支总数。对老年动物的二级和第四级过程的图像进行类似的分析。
      注意：成年人表现出许多支配体壁肌肉的过程，可能难以计数。确保每个进程只计算一次。
    5. 通过绘制从 PVD 细胞体 （CB） 到 PVC CB 的分段线，计算 wdIs51 动物中 PVD 细胞体之间的距离。对于幼虫4（L4）阶段的动物，当用60倍物镜成像时，细胞体相距很远，并且不在同一帧中。
    6. 从堆栈中选择重叠的图像，以覆盖从头到尾的整个动物长度，使用图像 选项卡> ImageJ 的堆栈> Z 项目 。沿着 PVD 和 PVC CB 之间的神经元过程绘制分段线。
    7. 使用 ImageJ 测量所有分割线的长度 >分析>测量。将所有段的长度相加，以计算每个时间点的 PVD 和 PVC CB 之间的总距离。
    8. 对于 jsIs609 动物中TRN的神经元长度，请在斐济加载图像。沿着后侧微管（PLM;可溶性GFP可见）从细胞体到第一线粒体的质心画一条分段线。计算第一个距离值的线长度。
    9. 从第一个线粒体的中心到第二个线粒体的中心画一条分段线。对每对线粒体重复此过程，直到神经元过程长度结束。将所有长度相加以计算总神经元过程长度。
    10. 对于细胞谱系分析，加载斐济的所有外阴图像，并从多个z平面的延时图像中提取细胞的最佳聚焦图像。
    11. 将数据表示为平均值±平均值的标准误差 （SEM）。对两个以上的样本使用单因子方差分析或对一对样本使用双样本 t 检验计算统计显著性。用 p 值 < 0.05 （*）、p 值 < 0.005 （**） 和 p 值 > 0.05 （ns，不显著）表示显著性。

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Representative Results

器件表征： 生长和成像设备由使用不可逆等离子键合粘合在一起的两个PDMS层组成（图1）。长度为10毫米，高度为40μm或80μm的流动层（模式1）使我们能够在液体培养物中培养动物（图1A）。诱捕层（图案2）具有2毫米宽的膜（图1B），用于固定动物以进行高分辨率成像。捕获层的掩模还创建了一对隔离膜，用于限制动物在连续成像时间点之间的流道部分内的运动。该设备的捕获膜改编自我们以前的成像设备3。当前装置（图1C，L）包括增加隔离膜并将诱捕膜的宽度增加到2毫米，以便在多个时间点上有效地固定同一只动物。

为了测试该装置，在连接捕获膜的微流体通道中填充干净的蒸馏水（图1D，E和补充图3），并使用14 psi氮气加压，也用于将动物捕获在2mm厚的PDMS膜下（图1H，K，L）。使用微量移液管从NGM板中挑选单个动物并加载到流道中（图1F）。生长通道充满重悬于S培养基中的细菌（图1F，G，I，J）。通过调整连接到设备入口和出口的移液器吸头中的培养基高度，同时监测两个隔离膜之间流道中的动物，在整个成像过程中保持恒定的流量。每天将新鲜制备的OP50溶液填充到微量移液器吸头中，以确保微通道内动物的健康食物来源。新鲜食品源和透气PDMS材料保证了微通道30、29内充足的氧气供应。通过使用细胞特异性标记或在发育过程中显示细胞谱系或可变细胞表达模式的标记来跟踪设备中动物的生长。使用14 psi氮气将动物固定在诱捕膜下，并将蠕虫保持在沿通道壁的直线位置。与NGM板23相比，动物在微流体通道内的生长速度较慢。

使用长期成像设备进行细胞谱系研究： 为了评估微流体装置内的秀 丽隐杆线虫 发育，我们培养了PS3239 （ZMP-1：：GFP）菌株32 ，并具有恒定的食物供应，以跟踪其生长的不同时间点的外阴发育。 ZMP-1 编码锌金属蛋白酶，并在L3期的锚定细胞，L4期的外阴D和外阴细胞以及第1天（1D）成年动物的外阴A中表达（图2A）。表达模式的变化代表了时间基因调控的一个例子，其中相同的基因在不同的发育阶段在不同的细胞中表达。为了观察外阴发育，首先将动物固定，然后从L3开始每8-10小时在多个z平面上成像外阴区域，直到成年阶段。ZMP-1：：GFP根据发育阶段在不同的外阴细胞中表达（图2B）。来自微流体装置内生长的动物的外阴细胞的高分辨率荧光图像显示正常的外阴发育和ZMP-1：：GFP表达和定位与先前的报告相似32。

使用长期生长和成像设备跟踪神经元发育： 为了证明该装置用于个体动物的亚细胞成像，监测了两个机械感觉神经元PVD和TRN的发展。使用在两个PVD神经元中表达GFP的 表达wdIs51 的NC1686菌株34，36。每个PVD神经元分别在L2（14-16小时）、L2晚期（20-22小时）、L3（24-26小时）和L4（36-42小时）发育阶段显示出月经样分支树突结构，包括初级（PP），次级（SP），三级（TP）和第四级（QP）过程（图3）。PVD 细胞体位于外阴后方。它发出一个轴突和两个初级树突突，产生SP和TP，进而产生QP树突分支，支配体壁肌肉。L3和L4晚期显示出高树化37，34。我们在微流体装置内培养了单个NC1686动物，并用细菌食物连续喂养它们。在L2至1D发育阶段固定动物，并使用60x，1.3 NA油物镜每8-12小时重复成像PVD神经元，以三维计数SP，TP和QP分支的数量。分支的范围在开发过程中增加，如图 3B所示。蠕虫发育不同阶段的SP和QP数量随着年龄的增长而增加（图4A），如先前的研究所示37。当使用该装置测量时，L2 动物显示 10 ± 3.8 （n = 9） SP，但没有 QP（图 4A）。我们将秀丽隐杆线虫 置于3 mM左旋米索尔的滴剂中，这是一种导致体壁肌肉收缩和麻痹的麻醉剂，以尽量减少对细胞器运输的不利影响，同时减少动物运动并引起足够的麻痹，这是高分辨率成像所需的3，4。当从NGM平板上生长的类似分期动物测量并使用3mM左旋咪唑在琼脂载玻片上成像时，SP值（4±1.6，n = 25， p = 0.15）没有显着差异（图4B）。数据表明，装置固定能够对复杂的神经元结构进行高分辨率成像，并且不会影响其发育。L3期动物有少量的QP，随着发育的增加而增加。1D成虫在装置中生长的动物中显示出67±2.8个QPs（n = 5）。以前的研究表明，PVD过程在开发过程中的形成和收缩称为自我避免，其中它们减少了分支数量38。孵化后51小时（1D）SP的减少可能是这种撤回的结果。在NGM平板上生长并使用3mM左旋咪唑成像的动物在可比较的发育阶段显示出相似的分支数趋势（图4A，B）。此外，两个PVC细胞体之间的距离，一个存在于尾部，第二个存在于外阴附近，随着它们在装置中生长的动物或在NGM板上生长的动物中分开而增加（图4C，D）。在整个成像过程中，动物保持健康，即使在长时间内反复固定在膜下后也可以产卵。

使用该设备，我们能够将动物固定在相同的方向上，并以高分辨率对相同的神经元及其结构进行成像，即使GFP表达微弱。为了证明我们的生长和固定技术的实用性，使用jsIs609（mec-7p：：MLS：：GFP）动物对TRN从L3到成年的发育进行了成像。后部TRN存在于身体的外侧，并被命名为PLMR和PLML，对应于动物的右侧和左侧。我们对在微流控芯片中生长的相同动物进行成像，并以12-14小时的间隔固定它们。蒙太奇代表了连续时间点的整个PLMR神经元过程，突出了线粒体和神经元过程（图5A）。计算总神经元过程长度，发现斜率为每小时10.4μm（图5B）。神经元过程长度的这种增加速率与先前报道的~10μm/h18，31，39，40，41一致。我们还观察到在生长过程中增加了新的线粒体，以及突触分支点相对于细胞体的位置的变化，如前所述23。

Figure 1
图 1：用于秀丽隐杆线虫长期生长和成像的简单微流控芯片。 （A）流动层由薄PDMS层中的10毫米长的微流体通道（模式1）组成。（B）捕获层由一个2mm厚的固定通道和体PDMS层中的一对薄隔离通道组成。（C）将两个PDMS层与薄盖玻片粘合在一起以制造设备。（D、E）捕集和隔离控制通道在压缩氮气（N2）气体下充满去离子（DI）水。（F）年龄同步秀丽隐杆线虫从NGM板中挑选并加载到设备的流动层内。（G） 在入口和出口储液器上使用两个微量移液器吸头提供食物。（H）动物在两个隔离通道内自由移动，并被困在固定膜下。（I）通过两个微量移液器吸头供应食物的生长和成像装置的图像。（日、韩）微流体通道内自由移动和固定的秀丽隐杆线虫的图像。比例尺为 1 毫米 （I） 和 200 μm （J， K）。（L） 设备横截面示意图，显示流道 （FC）、PDMS 膜 （M） 和控制流道 （CC） 的高度。请点击此处查看此图的大图。

Figure 2
图 2：跟踪设备内发育的 秀丽隐杆线虫 中外阴标志物的表达。 （A）PS3239动物发育过程中表达ZMP-1：：GFP的外阴细胞示意图。GFP信号出现在L3期的锚定细胞中，L4期出现在外阴D和外阴细胞中，在成人1D期出现在外阴A细胞中。（B）PS3239动物在微流控芯片内生长并每8-10小时固定一次的图像，以捕获L3，L4和1天（1D）成人外阴发育期间ZMP-1：：GFP表达的荧光图像。缩写：AC = 锚定细胞，A = vulA，D = vulD，E = vulE。比例尺为 10 μm。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 3
图 3：单个 wdIs51 秀丽隐杆线虫 的成像以跟踪 PVD 神经元发育。 （A）从L2到L4阶段的PVD神经元生长和树枝状树枝状树化示意图。绿色圆圈表示 PVD 电池体（CB，黄色箭头）。树突显示从CB的前侧和后侧在L2处出现初级突（PP），在L2晚期出现次级突（SP），在L3中出现三级突（TP），在L4期出现四级突（QP）。（B）来自在微流体装置内生长的动物的PVD神经元的图像。（C）来自在NGM板上生长并用3mM左旋咪唑（Lev）固定的动物的PVD神经元的图像。比例尺为 10 μm。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 4
图 4：设备生长动物和在 NGM 板上生长的动物的 PVD 发育比较。 （A）来自微流体装置内生长的相同动物的二次过程（SP）和四级过程（QP）的平均数量。这些值在 16 小时（L2）、24 小时 （L3）、36 小时（L4 早期）、42 小时（L4 晚期）和 51 小时（1D 成人）计算。（B）在NGM平板上生长并用3mM左旋咪唑麻醉的不同批次动物的平均SP和QP数。（C）来自微流体装置中生长的同一动物的两个PVD神经元细胞体之间的平均分离。（D）与在NGM平板上生长并用3mM左旋咪唑麻醉的不同组动物的平均分离。数据表示为平均± SEM（3 mM 左旋咪唑的 n ≥ 10，设备固定动物的 n ≥ 6）。统计显著性通过单因素方差分析计算，表示为 p 值 < 0.05 （*）、p 值< 0.005 （**） 和 p 值> 0.05 （ns）。请点击此处查看此图的大图。

Figure 5
图 5：来自微流体装置内生长的动物的触摸受体神经元 （TRN） 的高分辨率成像。 （A）在不同时间成像的单个动物的神经元过程的蒙太奇。标记细胞体（CB，箭头），突触分支点（BP，箭头）和神经元尖端（Tip，向上箭头）。每个线粒体的神经元过程和位置使用斐济手动追踪。比例尺为10μm。 （B）不同成像时间点的平均神经元过程长度。数据表示为平均± SEM （n = 8）。统计显著性使用单因素方差分析计算，表示为 p 值 < 0.005 （**） 和 p 值 > 0.05 （ns）。回归方程拟合的斜率为每小时 10.4 μm 神经元过程伸长，R2=0.9425。请点击此处查看此图的大图。

补充图1： 秀丽隐杆线虫荧光成像的显微镜设置截图。 （A） 图像分析软件的面板显示突出显示的部分，用于设置扫描速度、滤光片组和成像物镜。（B）然后使用该软件选择具有全激光功率7%的488 nm激光器。（C）图像分析软件可以拍摄单个图像帧或一系列延时图像并存储以备将来分析。 请点击此处下载此文件。

补充图2：斐济软件的屏幕截图，显示了 在wdIs51 动物中计数PVD分支的分析步骤。 （A） 显示在斐济 ImageJ 软件中打开的 PVD 映像并链接到单元计数器插件。（B） 单元格计数器窗口，用于初始化图像的计数器。（C）选择计数器以标记所包含的分支并避免重复计数。（D） 显示每个类别下分支总数的结果窗口。 请点击此处下载此文件。

补充图3：生长和成像装置的示意图。 将两个装有不同体积细菌食品溶液（黄色）的微量移液器吸头插入底层流道的入口和出口冲头中。尖端中食物溶液高度的差异导致溶液在通道内流动，从而为动物提供细菌供其生长。捕集和隔离通道（蓝色）充满蒸馏水，并使用氮气（设置为 14 psi）供应进行压缩。隔离通道始终连接到 14 psi。使用三路连接器在捕获膜上的压力在0（动物可以自由移动和进食）和14 psi（动物固定以进行高分辨率成像）之间切换。 请点击此处下载此文件。

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Discussion

在本文中，描述了一种用于制造和使用简单微流体装置的协议，用于生长秀 丽隐杆线虫 ，在其发育过程中具有恒定的食物供应和单个动物的高分辨率成像。这种制造过程很简单，可以在非无菌环境中完成。在制造步骤中，无尘环境至关重要。灰尘颗粒的存在会导致两个粘合表面之间的接触不当，导致在高压应用中设备粘合不良和泄漏，而 秀丽隐杆线虫 则被固定。在所有制造的设备中，95%的设备适用于实验。少数器件由于制造或使用过程中的不适当粘合而失效（5%）。通过在全球各地多个学术机构提供的无尘（> 1，000 级洁净室）内进行制造过程，可以减少粘合失败。要从流道中清除细菌食物并启用设备重复使用，请在每次实验后通过流动酒精来冲洗设备。

该协议展示了一种光刻制造工艺，其设计简单，可以很容易地针对 秀丽隐杆线虫的不同发育阶段和大小进行修改。此外，该装置设计可以适用于其他模式生物，如斑马鱼和 果蝇，通过增加流动的尺寸和捕获层3 来观察各种发育和亚细胞过程。在该协议中，流动层通道的两个不同高度 - 40μm和80μm - 已被用于完全固定和跟踪 秀丽隐杆线虫 不同发育阶段的细胞和亚细胞特征，以适应其体型。例如，PVD感觉神经元中的树枝状树状树化从早期L2阶段开始，一直持续到L4阶段。这是在具有40μm高流动层的装置中成像的。由于PVD神经元形成支配体壁肌肉的树突，因此需要光学切片来量化3D过程。树枝状乔木的定量分析需要将动物完全固定在与体径相匹配的装置内。然而，为了监测外阴发育，使用80μm高度的流动层来跟踪外阴谱系。对于TRN的长度和线粒体成像，我们使用40μm流动层厚度的设备对L2至L4阶段进行成像。使用高度错误的设备会导致固定困难。例如，80μm流动层高度装置内的小动物（L2或早期L3阶段）将允许动物在装置内翻转，即使在捕获膜低于14psi压力后也显示出不完全固定。另一方面，具有大体径（超过晚期L4）的动物不容易进入具有40μm流动层高度的装置内部。在高压下将大型动物困在小型设备中会损害它们的身体。具有40μm流动层的当前装置的应用是有限的，并且不适合对非常年轻的早期幼虫阶段动物（例如孵化后10小时以下的L1期动物）进行高分辨率成像，因为它们没有完全固定在膜下。由于体型小，体型小的幼虫动物不断移动，偶尔在被激光激发时会逃离陷阱。对于L1阶段动物，可以使用4倍或10倍物镜和较短的相机曝光时间进行低分辨率明场或荧光成像。作为一种替代方法，需要具有<20μm高度的新流动层装置来完全固定秀 丽隐杆线虫幼虫阶段。

使用高分辨率荧光成像长时间跟踪同一动物的发育现象可以增加自发荧光。每次延时成像测定都需要优化激发强度、曝光时间、成像时间间隔、动物恢复时间和食物质量，以获得秀丽隐杆线虫研究中的生理相关发育信息。我们选择了>3小时的时间间隔进行发育研究，从L4阶段开始使用动物。该设备能够获取更频繁的图像（每5-10分钟，持续几个小时）或每秒多帧（持续<1小时），以研究其他动态过程，例如秀丽隐杆线虫神经元3，23中的细胞器运输和分布。早期发育阶段的捕获和成像需要更仔细的观察，因为以短时间间隔重复捕获而没有完全恢复会影响他们的健康。在实验过程中，发现需要高压才能将它们移动到流动层中的动物随着时间的推移表现出健康状况不佳和更多的自发荧光。避免使用已知与高应激水平相关的高体荧光动物进行影像学研究。为了保持良好的生理机能，动物被困在靠近通道壁的直线位置。避免用身体在通道宽度上固定动物，因为动物在这个位置的身体在 14 psi 压力下被挤压后会生病。为了在使用油物镜重复成像期间保持良好的信噪比，应在每次时间点后正确清洁盖玻片。在设备的制造过程及其应用过程中经过特别小心后，相同的设备可以在多个成像会话中重复使用。

该装置可用于使用可能对麻醉剂敏感的突变体的研究。所提出的方法可以消除对生长和生理的不良麻醉作用，以促进长期观察动物的形态，功能和行为缺陷。该设备易于制造，可以在任何实验室中设置，以解决需要间歇性高分辨率成像的秀 丽隐杆线虫 的长期发育/细胞生物学问题。

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Disclosures

S.M.和S.P.K.是微流体生长和成像装置（专利申请号640/CHE/2011）的未决专利的作者。

Acknowledgments

我们感谢CIFF成像设施，NCBS使用DST支持的共聚焦显微镜 - 纳米技术中心（No.SR/55/NM-36-2005）。我们感谢DBT（SPK），CSIR-UGC（JD），DST（SM），DBT（SM）的研究资金，DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202（SPK和Gautam Menon）支持的旋转盘，以及HHMI-IECS资助号55007425（SPK）。HB101， PS3239和 wdIs51 菌株由 Caenorhabditis 遗传学中心（CGC）提供，该中心由NIH研究基础设施计划办公室（P40 OD010440）资助。S.P.K. 在 Mike Nonet 的实验室制作了 jsIs609 。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 G needles Sigma-Aldrich, Bangalore, India Gauge 18
3-way stopcock Cole-Parmer WW-30600-02 Masterflex fitting with luer lock
CCD camera Andor Technology EMCCD C9100-13no
Circuit board film Fine Line Imaging, Colorado, USA The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)
Convection Oven Meta-Lab Scientific Industries, India MSI-5
Coverslips Blue stat microscopic cover glass 22mm x 10Gms
Ethanol Hi media
Harris uni-core puncher 1mm Qiagen Z708801
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 440191
Hot plate  IKA RCT B S 22
Isopropanol Fisher Scientific 26895
KOH Fisher Scientific
Laser Scanning Microscope ZEISS LSM 5 LIVE
Micropipette tips Tarsons 0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply
Negative Photoresist-1 Microchem SU8-2025 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2 Microchem SU8-2050 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Nitrogen gas Local Supplier Commercial nitrogen gas Cylinder volume of 7 cubic meter
PDMS (Curing solution) Dow Corning Corporation, MI, USA  Sylgard curing solution curing agent
Petri plates Praveen Scientific Corporation
Plasma cleaner Harrick Plasma, NY, USA  PDC-32G
Razor and blades Lister surgical Blade
Silicon Elastomer (Base) Dow Corning Corporation, MI, USA Sylgard 184 base elastomer base
Silicon tubes Fisher Scientific Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm
Silicon wafer University Wafer, MA, USA [100] orientation, 4-inch diameter Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer
Spin Coater SPS-Europe B.V., The Netherlands SPIN 150
Spinning Disk microscope Perkin Elmer ultra-view VOX system CSU-X1-A3 N The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.
SU8 developer Microchem, MA, USA SU8 Developer
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 448931 Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic
UV lamp Oriel Instruments, Bangalore, India 200 Watt and collimated UV light source
Volocity software Perkin-Elmer Image analysis

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References

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生物工程，第 182 期， 秀丽隐杆线虫，微流控芯片，片上生长，长期成像，神经元成像，外阴细胞谱系
用于<em>秀丽隐杆线虫</em>长期生长和成像的简单微流控芯片
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Dubey, J., Mondal, S., Koushika, S. P. A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (182), e63136, doi:10.3791/63136 (2022).

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