离体 小鼠通过门静脉进行肝灌注
Summary
该协议描述了一种通过门静脉灌注切除完整小鼠肝脏以进行代谢研究的简单方法。
Abstract
糖尿病、糖尿病前期、非酒精性脂肪性肝病 （NAFLD） 和非酒精性脂肪性肝炎 （NASH） 等代谢性疾病正变得越来越普遍。离体肝灌注允许在可以严格控制的营养条件下使用核磁共振（NMR）对肝脏代谢进行全面分析。由于计算机模拟仍然是评估激素作用和药物干预效果的主要理论手段，因此灌注肝脏仍然是了解肝脏代谢的最有价值的测试台之一。由于这些研究指导了对肝脏生理学的基本见解，因此结果必须准确且可重复。离体肝灌注再现性的最大因素是手术质量。因此，我们引入了一种有组织和简化的方法，用于在原位NMR实验的背景下进行离体小鼠肝脏灌注。我们还描述了一种独特的应用，并讨论了在这些研究中遇到的常见问题。总体目的是为我们多年来改进的技术提供一个简单的指导，我们认为这是在原位NMR实验中获得肝切除和灌注可重复结果的黄金标准。磁体到磁场中心的距离以及组织在NMR实验期间无法进行干预使我们的方法新颖。
Introduction
离体灌注在肝脏代谢研究中至关重要，通过门静脉灌注是这些研究的标准。为了单独研究肝脏代谢，必须从体内切除肝脏，以避免其他器官代谢引起的并发症（即全身代谢），并控制激素的可用性（胰岛素，胰高血糖素等）。这种方法对于了解糖尿病，NAFLD和NASH等疾病对肝脏代谢的影响以及药物作用机制至关重要。本文可作为肝切除和灌注的指南。我们开发了一种简化的程序，以足够的严谨性和可重复性进行这些代谢肝脏研究。如果手术不正确，则获得的代谢数据存在显着的变异性。我们描述了一种在核磁共振（NMR）光谱仪中原位代谢研究的背景下进行门静脉导管插入术和肝切除的有组织方法，如文献1，2，3，4，5中所述。
目前，没有文献描述在 NMR 内使用玻璃柱进行 离体 肝灌注。也没有视频或文本出版物提供如何使用小鼠肝脏进行手术的清晰示例，特别是演示如何插入门静脉，切除肝脏，转移和将肝脏悬挂在玻璃柱上。由于转基因小鼠无处不在地用于研究肝脏代谢，这是一个值得完整描述的基本程序。肝灌注手术并不新鲜，但本文是一种黄金标准方法，并附有一段视频，演示本文中描述的技术卓越性，以帮助所有对此程序感兴趣的人。这里介绍的方法最好应用于实时代谢，以检测疾病模型中代谢物的功能和周转。
该方法使用100厘米的水套玻璃柱，允许肝脏悬挂在由灌注液封装在NMR管内的套管底部。玻璃夹套中的热水用于控制灌注液温度。薄层氧合器用95%/5%O2/CO2 加压以控制pH值。通过使用三个单独的泵，可以设置灌注液柱高度，从而为肝脏提供恒定的压力。在施加恒定压力之外，流量不受控制（图1）。为了确认肝脏功能正常，氧气测量与流速一起进行。在我们手中，这组先决条件导致高度可重复的NMR实验，用于评估肝脏代谢功能。
Protocol
Representative Results
Discussion
这种外科手术具有挑战性，需要大量的实践才能获得可重复的结果。应根据需要调整异氟醚和载气，以通过尽可能多的外科手术来维持动物的生存能力。环境，一天中的时间，年龄，体重和其他几个因素都会影响麻醉。体重，饮食，小鼠品系和年龄可能会影响手术，因为脂肪堆积会干扰门静脉的可视化。当用胶带将爪子贴下来时，必须注意不要对颈部施加任何可能导致窒息的压力。此外，小鼠越?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了美国国立卫生研究院（R01-DK105346，P41-GM122698，5U2C-DK119889）的资助。这项工作的一部分是在国家高磁场实验室的高级磁共振成像和光谱（AMRIS）设施的麦克奈特脑研究所进行的，该设施得到了国家科学基金会合作协议No的支持。DMR-1644779和佛罗里达州。
Materials
| 1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| 100 cm Water Jacketed Glass Column | N/A | N/A | Custom Made |
| 2-0 Silk Suture | Braintree Scientific | N/A | |
| 22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety | Terumo | SRFF2225 | |
| 23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26407 | |
| 27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26426 | |
| 4×4 in. Surgical Platform | N/A | N/A | Custom Made |
| 70% Alcohol Wipe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Circulating Water Bath | MS Lauda | N/A | Model no longer manufactured |
| Cotton Tip Applicator | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Scientific Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7 – Fine Forceps | Fine Scientific Tools | 11274-20 | |
| Hemostats | Fine Scientific Tools | 13015-14 | |
| Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL | RX Generics | 71288-0402-02 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-0704-06 | |
| Lidocaine HCl 2% | VEDCO Inc. | 50989-0417-12 | |
| Membrane-Thin-Layer Oxygenator | Radnoti | N/A | |
| Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " | Roboz | RS-6013 | |
| Oxygen Meter System | Hanstech Instruments Ltd. | N/A | |
| Saline 0.9% Solution | N/A | N/A | Saline is made in lab |
| Scale | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Variable Speed Analog Console Pump Systems | Cole Palmer | N/A | Models are custom per application |
| Weigh boats | N/A | N/A | Non-specific Brand |
References
- Ragavan, M., McLeod, M. A., Giacalone, A. G., Merritt, M. E. Hyperpolarized Dihydroxyacetone Is a Sensitive Probe of Hepatic Gluconeogenic State. Metabolites. 11 (7), 441 (2021).
- Lumata, L. Hyperpolarized (13)C Magnetic Resonance and Its Use in Metabolic Assessment of Cultured Cells and Perfused Organs. Methods in Enzymology. 561, 561-573 (2015).
- Moreno, K. X., et al. Real-time detection of hepatic gluconeogenic and glycogenolytic states using hyperpolarized [2-13C] dihydroxyacetone. The Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35859-35867 (2014).
- Moreno, K. X., et al. Hyperpolarized δ-[1-13C] gluconolactone as a probe of the pentose phosphate pathway. NMR in Biomedicine. 30 (6), (2017).
- Merritt, M. E., Harrison, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R., Burgess, S. C. Flux through hepatic pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase detected by hyperpolarized 13C magnetic resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (47), 19084-19089 (2011).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).
- Hwang, G. H., et al. Protective effect of butylated hydroxylanisole against hydrogen peroxide-induced apoptosis in primary cultured mouse hepatocytes. Journal of Veterinary Science. 16 (1), 17-23 (2015).
- Bessems, M., et al. The isolated perfused rat liver: standardization of a time-honoured model. Laboratory Animals. 40 (3), 236-246 (2006).
- Beal, E. W., et al. A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
- Collins, J. B., Song, J., Mahabir, R. C. Onset and duration of intradermal mixtures of bupivacaine and lidocaine with epinephrine. The Canadian Journal of Plastic Surgery. 21 (1), 51-53 (2013).
- . Medical Dictionary Available from: https://www.merriam-webster.com/medical (2022)
- Thorpe, D. R. . A Dissection in Color: The Rat (and the Sheep’s Brain). , (1968).
- Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- . Operations Manual Setup, Installation and Maintenance Available from: https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf (2006)
- . Heparin Available from: https://go.drugbank.com/drugs/DB01109 (2022)
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PloS One. 10 (2), 0117232 (2015).
