Ex Vivo Perfusión hepática a través de la vena porta en el ratón
Summary
El protocolo describe un método sencillo de resección de un hígado de ratón intacto para estudios metabólicos a través de la perfusión de la vena porta.
Abstract
Las enfermedades metabólicas como la diabetes, la prediabetes, la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) y la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) son cada vez más comunes. Las perfusiones hepáticas ex vivo permiten un análisis exhaustivo del metabolismo hepático mediante resonancia magnética nuclear (RMN), en condiciones nutricionales que pueden ser rigurosamente controladas. Como las simulaciones in silico siguen siendo un medio principalmente teórico para evaluar las acciones hormonales y los efectos de la intervención farmacéutica, el hígado perfundido sigue siendo uno de los bancos de pruebas más valiosos para comprender el metabolismo hepático. Como estos estudios guían los conocimientos básicos sobre la fisiología hepática, los resultados deben ser precisos y reproducibles. El mayor factor en la reproducibilidad de la perfusión hepática ex vivo es la calidad de la cirugía. Por lo tanto, hemos introducido un método organizado y simplificado para realizar perfusiones hepáticas de ratón ex vivo en el contexto de experimentos de RMN in situ . También describimos una aplicación única y discutimos los problemas comunes encontrados en estos estudios. El propósito general es proporcionar una guía sencilla para una técnica que hemos refinado durante varios años que consideramos el estándar de oro para obtener resultados reproducibles en resecciones hepáticas y perfusiones en el contexto de experimentos de RMN in situ . La distancia al centro del campo para el imán, así como la inaccesibilidad del tejido a la intervención durante el experimento de RMN hace que nuestros métodos sean novedosos.
Introduction
Las perfusiones ex vivo son cruciales en el estudio del metabolismo hepático, y la perfusión a través de la vena porta es el estándar para estos estudios. Para estudiar el metabolismo hepático de forma aislada, el hígado debe ser resecado del cuerpo para evitar complicaciones derivadas del metabolismo en otros órganos (es decir, el metabolismo de todo el cuerpo) y para ejercer control sobre la disponibilidad hormonal (insulina, glucagón, etc.). Este enfoque puede ser esencial para comprender los efectos de enfermedades como la diabetes, la EHGNA y la EHNA en el metabolismo hepático, así como los mecanismos de acción de los medicamentos. Este artículo sirve como guía para la resección hepática y la perfusión. Hemos desarrollado un procedimiento simplificado para realizar estos estudios hepáticos metabólicos con suficiente rigor y reproducibilidad. Si la cirugía no se realiza correctamente, existe una pronunciada variabilidad en los datos metabólicos obtenidos. Describimos un método organizado para realizar cateterismo de vena porta y resección hepática en el contexto de estudios metabólicos in situ en un espectrómetro de resonancia magnética nuclear (RMN), tal y como se describe en la literatura 1,2,3,4,5.
Actualmente, no hay literatura que describa una perfusión hepática ex vivo utilizando una columna de vidrio dentro de una RMN. Tampoco hay una publicación de video o texto que proporcione un ejemplo claro de cómo realizar el procedimiento con el hígado de ratón, específicamente, demostrando cómo cateterizar la vena porta, resecar un hígado, transferir y colgar el hígado en una columna de vidrio. Como el ratón modificado genéticamente se utiliza ubicuamente para estudiar el metabolismo hepático, este es un procedimiento esencial que merece una descripción completa. Las cirugías de perfusión hepática no son nuevas, pero este artículo es un método estándar de oro acompañado de un video que demuestra la excelencia técnica descrita en este documento para ayudar a todos los interesados en este procedimiento. El método presentado aquí se aplicaría mejor al metabolismo en tiempo real para detectar la función y la rotación de metabolitos en modelos de enfermedades.
Este método utiliza una columna de vidrio con camisa de agua de 100 cm, que permite que el hígado cuelgue en la parte inferior de la cánula encapsulada por perfusato dentro de un tubo de RMN. El agua caliente en la camisa de vidrio se utiliza para controlar la temperatura de perfusión. Un oxigenador de capa delgada se presuriza con 95% / 5% O2 / CO2 para el control del pH. Mediante el uso de tres bombas separadas, se establece la altura de la columna de perfusato, lo que proporciona una presión constante al hígado. Los caudales no se controlan más allá de la aplicación de presión constante (Figura 1). Para confirmar que el hígado está funcionando adecuadamente, se toman mediciones de oxígeno junto con las tasas de flujo. En nuestras manos, este conjunto de condiciones previas conduce a experimentos de RMN altamente repetibles para la evaluación de la función metabólica hepática.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este procedimiento quirúrgico es desafiante y requiere una práctica extensa para lograr resultados reproducibles. El isoflurano y el gas portador deben ajustarse según sea necesario para mantener la viabilidad del animal a través de la mayor cantidad posible del procedimiento quirúrgico. El medio ambiente, la hora del día, la edad, el peso y varios otros factores afectarán la anestesia. El peso, la dieta, la cepa de ratones y la edad podrían afectar la cirugía, ya que la acumulación de grasa puede interferir co…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por fondos de los Institutos Nacionales de Salud (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889). Una parte de este trabajo se realizó en el Instituto del Cerebro McKnight en la Instalación de Imágenes y Espectroscopía de Resonancia Magnética Avanzada (AMRIS) del Laboratorio Nacional de Alto Campo Magnético, que cuenta con el apoyo del Acuerdo Cooperativo No. DMR-1644779 y el Estado de Florida.
Materials
| 1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| 100 cm Water Jacketed Glass Column | N/A | N/A | Custom Made |
| 2-0 Silk Suture | Braintree Scientific | N/A | |
| 22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety | Terumo | SRFF2225 | |
| 23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26407 | |
| 27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26426 | |
| 4×4 in. Surgical Platform | N/A | N/A | Custom Made |
| 70% Alcohol Wipe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Circulating Water Bath | MS Lauda | N/A | Model no longer manufactured |
| Cotton Tip Applicator | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Scientific Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7 – Fine Forceps | Fine Scientific Tools | 11274-20 | |
| Hemostats | Fine Scientific Tools | 13015-14 | |
| Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL | RX Generics | 71288-0402-02 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-0704-06 | |
| Lidocaine HCl 2% | VEDCO Inc. | 50989-0417-12 | |
| Membrane-Thin-Layer Oxygenator | Radnoti | N/A | |
| Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " | Roboz | RS-6013 | |
| Oxygen Meter System | Hanstech Instruments Ltd. | N/A | |
| Saline 0.9% Solution | N/A | N/A | Saline is made in lab |
| Scale | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Variable Speed Analog Console Pump Systems | Cole Palmer | N/A | Models are custom per application |
| Weigh boats | N/A | N/A | Non-specific Brand |
References
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