メラノーマ転移の新規メディエーターの同定のための堅牢な発見プラットフォーム
Summary
この記事では、メラノーマ転移の新規候補メディエーターを試験するために使用される技術のワークフローとその作用機序について説明します。
Abstract
転移は複雑なプロセスであり、 インビトロ アッセイによって不完全にしかモデル化されない障壁を克服するために細胞を必要とする。メラノーマ転移における新規プレーヤーを同定するための、堅牢で再現性のある in vivo モデルおよび標準化された方法を使用して、体系的なワークフローが確立されました。このアプローチにより、特定の実験段階でのデータ推論が可能になり、転移における遺伝子の役割を正確に特徴付けることができます。モデルは、遺伝子組み換えメラノーマ細胞を心臓内、皮内、または皮下注射を介してマウスに導入し、続いて連続 インビボ イメージングでモニタリングすることによって確立される。予め確立されたエンドポイントに到達すると、原発性腫瘍および/または転移を有する器官が採取され、様々な分析のために処理される。腫瘍細胞を選別し、単一細胞RNAシーケンシングを含むいくつかの「オミックス」プラットフォームのいずれかに供することができる。臓器は、転移の全体的な負担を定量化し、その特定の解剖学的位置をマッピングするために、イメージングおよび免疫組織病理学的分析を受ける。生着、モニタリング、組織採取、処理、および分析のための標準化されたプロトコルを含むこの最適化されたパイプラインは、患者由来の短期培養物および様々な固形がんタイプの確立されたヒトおよびマウス細胞株に採用することができる。
Introduction
転移性黒色腫に関連する高い死亡率と、世界中で黒色腫の発生率の増加1(2025年までに推定7.86%増加)が相まって、新しい治療アプローチが求められています。標的発見の進歩は、非常に複雑なプロセスである転移の再現可能なモデルにかかっています。転移性カスケードのステップ全体を通して、メラノーマ細胞は、免疫系の回避および遠隔組織のコロニー形成を達成するために無数の障壁を克服しなければならない2。メラノーマ細胞の回復力と適応性は、その高い遺伝子変異負荷3および神経堤起源を含む多数の要因から生じ、重要な表現型可塑性3,4,5を付与する。各ステップにおいて、転写プログラムは、転移メラノーマ細胞が、免疫系6、細胞外環境7,8、およびそれらが接触する物理的障壁9の細胞アーキテクチャを含む微小環境とのクロストークからの手がかりに基づいて、ある状態から別の状態に切り替えることを可能にする。例えば、メラノーマ細胞は、重要な免疫プライミング腫瘍分泌因子6の発現をダウンレギュレートすることによって免疫監視を逃れる。
研究は、メラノーマ細胞がケモカインおよびサイトカインを分泌して、転移のために遠くの「標的」器官をプライミングする「転移前ニッチ」を記述している10。この新知見は、転移性黒色腫細胞の臓器指向性と、それらが遠隔組織にアクセスするためにとる解剖学的経路について重要な疑問を提起する。血管内投与後、メラノーマ細胞はリンパ管(リンパ性スプレッド)および血管(血行性スプレッド)を介して転移することが知られている2,11。ほとんどの患者は限局性疾患を呈するが、症例のごく一部は遠隔転移性疾患を呈し、リンパ管播種(陰性リンパ節関与)を示さず11、黒色腫の代替転移経路の存在を示唆している。
転移部位に定着すると、メラノーマ細胞はエピジェネティックおよび代謝適応を受ける12,13。新しいコンパートメントにアクセスして侵入するために、メラノーマ細胞はプロテアーゼ14および細胞骨格修飾11,15を採用し、それによって新しい場所を横断し、成長することができる。メラノーマ細胞を標的にすることの難しさは、そのような適応の複雑さと数にある。したがって、フィールドはできるだけ多くのステップと適応を実験的に再現する努力をする必要があります。オルガノイドおよび3D培養物16,17などのインビトロアッセイにおける多数の進歩にもかかわらず、これらのモデルは、インビボ転移カスケードを不完全にしか再現しない。
マウスモデルは、再現性、技術的実現可能性、およびヒト疾患のシミュレーションのバランスをとることによって価値を示してきた。患者由来の異種移植片または短期培養物から免疫不全またはヒト化マウスに血管内、同時および異所性に移植されたメラノーマ細胞は、転移性メラノーマにおける標的発見のバックボーンを表す。しかし、これらのシステムはしばしば転移に対する重要な生物学的制約、すなわち免疫系を欠いている。この制約を有する同系黒色腫転移モデルは、この分野では比較的希少である。これらの系は、免疫担当マウスにおいて開発された、B16−F1018、YUMMファミリーの細胞株19、SM120、D4M3 21、RIM322、またはより最近では、RMS23およびM1(Mel114433)、M3(HCmel1274)、M4(B2905)24メラノーマ細胞株を含む、メラノーマ進行における宿主免疫応答の複雑な役割の調査を容易にする。
ここでは、メラノーマ転移標的同定のためのパイプラインが提示される。メラノーマ患者コホートから生成される「オミック」データセットがますます増えるにつれて、最も臨床的に有望な研究はビッグデータ統合から生じる研究であり、細心の注意を払った機能的および機械的な尋問につながると仮定します25,26,27,28。転移過程における潜在的な標的を研究するためにマウスモデルを使用することにより、生体内特異的事象および組織相互作用を説明することができ、したがって臨床翻訳の確率を高めることができる。転移性負荷を定量化するための複数の方法が概説され、任意の所与の実験の結果に関する補完的なデータを提供する。様々な臓器の腫瘍から単一細胞単離のためのプロトコルは、単一細胞またはバルクRNAシーケンシングに先行する可能性のある転移細胞における遺伝子発現の偏りのない特性評価を支援するために記載されている。
Protocol
Representative Results
Discussion
このテクニカルレポートの目的は、メラノーマ転移における潜在的なアクターの調査のための標準化されたトップツーボトムのワークフローを提供することです。 in vivo 実験はコストと時間がかかる可能性があるため、効率を最大化し、得られる情報の価値を高める戦略が最優先事項です。
同じ実験内で調査結果をクロスバリデーションするために、全体を通し?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、NYU Langone Healthの先端研究技術部門(DART)、特に、Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH/NCI 5P30CA016087によって部分的に支援されている実験病理学研究所、ゲノム技術センター、サイトメトリーおよび細胞選別研究所、前臨床イメージングコアに感謝する。我々は、IRBが承認したプロトコール(ユニバーサル・コンセント研究#s16-00122および学際的メラノーマ協同組合グループ研究#10362)を通じて得られた患者由来のメラノーマ短期培養物+ (10-230BMおよび12-273BM)へのアクセスを提供してくれたNYU学際的メラノーマ協同組合グループ(PI:Dr. Iman Osman)に感謝する。113/6-4Lおよび131/4-5B1メラノーマ細胞株*を提供してくれたロバート・カーベル博士(トロント大学)と、WM 4265-2、WM 4257s-1、WM 4257-2メラノーマ短期培養**を提供してくれたMeenhard Heryn博士(Wistar Institute)に感謝します。E.H.は、NIH/NCI R01CA243446、P01CA206980、米国癌協会-メラノーマ研究同盟チームサイエンス賞、およびNIHメラノーマSPORE(NCI P50 CA225450;パイ:I.O.)。 図 1 は、 Biorender.com を使用して作成されました。
Materials
| #15 Scapel Blade | WPI | 500242 | For surgical procedures |
| #3 Scapel Handle | WPI | 500236 | For surgical procedures |
| 1 mL Tuberculin syringe, slip tip | BD | 309626 | Injections |
| 10 mL syringe, slip tip | BD | 301029 | Perfusion |
| 10% Formalin Sodium Buffered | EK Industries | 4499-20L | For perfusion/tissue fixative |
| 15 mL Conical | Corning | 430052 | Cell culture |
| 15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352196 | Cell culture |
| 200 Proof Ethanol | Deacon Labs | 04-355-223 | Histology |
| 22G – 22mm needle | BD | 305156 | Perfusion |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon | J464G | Suture |
| 4% Carson's phosphate buffered paraformaldehyde | EMS | 15733-10 | For perfusion/tissue fixative |
| 40µm | Corning | 431750 | Tissue processing |
| 5-0 Absorbable Suture | Ethicon | 6542000 | Closure |
| 50 mL Conical | Corning | 430828 | Cell culture |
| 50mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | Cell culture |
| 7-0 Silk suture | FST | 18020-70 | Ligature |
| 70µm | Corning | 431751 | Tissue processing |
| Anti-fade mounting media | Vector Labs | H-1000-10 | Immunofluorescence |
| Approximator applying Forceps, 10cm | WPI | 14189 | For microsurgical procedures |
| Avance | Bruker | 3 HD | NMR Console |
| Biospec 7030 | Bruker | 7030 | Micro MRI |
| BSA | Bioreg | A941 | NuMA Staining |
| Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm | WPI | WP5025501 | For microsurgical procedures |
| Coplin Staining Jar | Bel-Art | F44208-1000 | Histology |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Immunofluorescence |
| dCas9-KRAB | Addgene | 110820 | Genetic manipulation |
| DNase I | NEB | M0303L | Tissue processing |
| DPBS | Corning | 21-030-CM | Tissue processing |
| Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade | GEM | 62-0167 | Tissue processing |
| Extracellular Matrix Substrate | Corning | 354234 | Consider the Growth Factor Reduced ( as alternative |
| FBS | Cytiva | SH30910.03 | Cell culture |
| Fiji Image J | Fiji Image J | Software | Immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer | Thermo Fisher | A16104 | NuMA Staining |
| Goat Serum | Gibco | PCN5000 | Immunofluorescence |
| HBSS | Corning | 21-020-CV | Tissue processing |
| Hematoxylin | Richard-Allan Scientific | 7231 | Histology |
| Illumina III | PerkinElmer | CLS136334 | BLI Instrument |
| Insulin syringe 28G – 8mm needle | BD | 329424 | Injections |
| Insulin syringe 31G – 6mm needle | BD | 326730 | Injections |
| Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serrated | WPI | 504478 | For perfusion and surgical procedures |
| Isoflurane USP | Covetrus | 11695067772 | Anesthesia |
| Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Tip | WPI | WP6570 | For microsurgical procedures |
| Ketamine HCl 100mg/mL | Mylan Ind. | 1049007 | Anesthesia |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 98290 | Genetic manipulation |
| Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649 | Invitrogen | L32472 | Vascular endothelial cells marker |
| MEM non-essential amino acids X 100 | Corning | 25-025-CI | Cell culture |
| Metzenbaum Scissors | WPI | 503269 | For surgical procedures |
| Microinjection Unit | KOPF | 5000 | Intracardiac injections |
| NaCl | Fisher | S25877 | NuMA Staining |
| Needle 30G x 25mm | BD | 305128 | Intracardiac Injection |
| Needle 33G x 15mm | Hamilton | 7747-01 | Intracarotid Injection |
| Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated Jaws | WPI | 14137-G | For microsurgical procedures |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Murine model |
| NU/J mice | The Jackson Laboratory | 002019 | Murine model |
| Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human | Abcam | 97585 | NuMA Staining |
| Penicillin-Streptomycin 10000U/mL | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Percoll | GE | 0891-01 | density separation solution |
| PI Classic Surgical Gloves | Cardinal Health | 2D72PT75X | Surgery |
| pLKO Tet-On | Addgene | 21915 | Genetic manipulation |
| Povidone-Iodine 10% Solution | Medline | MDS093943 | Surgery |
| Proparacaine Drops 0.5% | Akorn Pharma | AX0501 | Opthalmic local anesthetic |
| Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment | Dechra | 83592 | Anesthesia |
| Razor Blade Double Edge Blades | EMS | 72000 | Shaving and Vibrotome Brain Slicing |
| Reflex 9mm EZ Clip | Braintree | EZC- KIT | Wound closure |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | Cell culture |
| Scissors, Spring 10.5cm Str, 8mm Blades | WPI | 501235 | For microsurgical procedures |
| Semi-Automatic Vibrating Blade Microtome | Leica | VT1200 | Brain Slice Immunofluorescence |
| Single Channel Anesthesia Vaporizer System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | Anesthesia |
| Smartbox Tabletop Chamber System and Exhaust Blower | EZ Systems | TT4000 | CO2 Euthanasia |
| Sterile Fenestrated Disposable Drape | Medline | NON21002 | Surgery |
| Sterile Non-Reinforced Aurora Surgical Gowns with Set-In Sleeves | Medline | DYNJP2715 | Surgery |
| T25 Flask | Corning | 430639 | Cell culture |
| Tris | Corning | 46-031-CM | NuMA Staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Immunofluorescence |
| Troutman tying forceps, 10cm, Curved G pattern, 0.52mm tip with tying platform | WPI | WP505210 | For microsurgical procedures |
| Vessel clips 10G Pressure 5x 0.8mm Jaws, 5/pkg | WPI | 15911 | For microsurgical procedures |
| Visiopharm | Visiopharm | Visiopharm | NuMA Staining Quantification Software |
| Xylasine 100mg/mL | Akorn Pharma | 59399-111-50 | Anesthesia |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL | Histology |
References
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