JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Recherche en cancérologie

Uma plataforma robusta de descoberta para a identificação de novos mediadores de metástase de melanoma

Published: March 08, 2022
doi:
10.3791/63186
, , , , , , , , ,
1Department of Pathology,NYU Grossman School of Medicine, 2Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group,Perlmutter Cancer Center, 3Department of Radiology,NYU Grossman School of Medicine, 4Preclinical Imaging Core,NYU Grossman School of Medicine, 5Ronald Perelman Department of Dermatology,NYU Grossman School of Medicine

Summary

Este artigo descreve um fluxo de trabalho de técnicas empregadas para testar novos mediadores candidatos de metástase de melanoma e seus mecanismos de ação.

Abstract

A metástase é um processo complexo, exigindo que as células superem barreiras que são apenas modeladas incompletamente por ensaios in vitro . Um fluxo de trabalho sistemático foi estabelecido utilizando modelos in vivo robustos e reprodutíveis e métodos padronizados para identificar novos atores na metástase do melanoma. Essa abordagem permite a inferência de dados em estágios experimentais específicos para caracterizar precisamente o papel de um gene na metástase. Os modelos são estabelecidos pela introdução de células de melanoma geneticamente modificadas através de injeções intracardicascas, intradérmicas ou subcutâneas em camundongos, seguidos pelo monitoramento com imagens in vivo em série. Uma vez alcançados pontos finais pré-estabelecidos, tumores primários e/ou órgãos portadores de metástases são colhidos e processados para várias análises. As células tumorais podem ser classificadas e submetidas a qualquer uma das várias plataformas de “omics”, incluindo o sequenciamento de RNA unicelular. Os órgãos passam por análises de imagem e imunohistopatológicas para quantificar a carga global de metástases e mapear sua localização anatômica específica. Este pipeline otimizado, incluindo protocolos padronizados para engrafamento, monitoramento, colheita de tecidos, processamento e análise, pode ser adotado para culturas derivadas do paciente, culturas de curto prazo e linhas celulares humanas e murinas estabelecidas de vários tipos de câncer sólido.

Introduction

A alta mortalidade associada ao melanoma metastático combinada com uma incidência crescente de melanoma em todo o mundo1 (um aumento estimado de 7,86% até 2025) exige novas abordagens de tratamento. Os avanços na descoberta de alvos dependem de modelos reprodutíveis de metástase, um processo altamente complexo. Ao longo das etapas da cascata metastática, as células de melanoma devem superar inúmeras barreiras para alcançar a evasão do sistema imunológico e a colonização de tecidos distantes2. A resiliência e adaptabilidade das células de melanoma surgem de uma infinidade de fatores, incluindo sua alta carga mutacional genética3 e sua origem da crista neural, que confereplastia fenotípica crucial 3,4,5. A cada passo, os programas transcricionais permitem que as células de melanoma metástase mudem de um estado para outro com base em pistas do crosstalk com o microambiente, compreendendo o sistema imunológico6, o meio extracelular 7,8 e a arquitetura celular das barreiras físicas9 com as quais entram em contato. Por exemplo, as células de melanoma escapam da vigilância imunológica, regulando a expressão de importantes fatores imunes-priming secretados por tumor6.

Estudos descrevem um “nicho pré-metastático”, no qual as células de melanoma secretam quimiocinas e citocinas para preparar o distante órgão “alvo” para a metástase10. Esses achados levantam questões importantes sobre o tropismo de órgãos das células de melanoma metastático e a rota anatômica que tomam para acessar tecidos distantes. Após a intravasação, as células de melanoma são conhecidas por metástase através de linfáticos (propagação linfática) e vasos sanguíneos (propagação hematógena)2,11. Enquanto a maioria dos pacientes apresenta doença localizada, um pequeno subconjunto de casos apresenta doença metastática distante e nenhuma disseminação linfática (envolvimento negativo do linfonodo)11, sugerindo a existência de vias metastáticas alternativas para o melanoma.

Quando colonizam um sítio metastático, as células de melanoma passam por adaptações epigenéticas e metabólicas12,13. Para acessar e invadir novos compartimentos, as células de melanoma empregam proteases14 e modificações citoesquelletal 11,15, que lhes permitem atravessar e crescer em sua nova localização. A dificuldade em direcionar as células de melanoma reside na complexidade e no número de adaptações; assim, o campo deve fazer esforços para recriar experimentalmente o maior número possível de etapas e adaptações. Apesar de inúmeros avanços em ensaios in vitro, como organoides e culturas 3D16,17, esses modelos apenas recapitulam indevidamente a cascata metastática in vivo.

Os modelos murinos têm mostrado valor ao encontrar um equilíbrio entre reprodutibilidade, viabilidade técnica e simulação de doença humana. Células de melanoma implantadas intravascularmente, ortototónicas e heterotototicamente de xenoenxertos derivados do paciente ou culturas de curto prazo em camundongos imuno-comprometidos ou humanizados representam a espinha dorsal da descoberta de alvos em melanoma metastático. No entanto, esses sistemas muitas vezes não têm uma restrição biológica crucial na metástase: o sistema imunológico. Modelos de metástase de melanoma síngênico que possuem essa restrição são relativamente escassos no campo. Esses sistemas, desenvolvidos em camundongos imunocompetuntes, incluindo B16-F1018, a família YUMM das linhas celulares19, SM120, D4M321, RIM322 ou mais recentemente, as linhascelulares RMS 23 e M1 (Mel114433), M3 (HCmel1274), M4 (B2905)24 linhas de células de melanoma, facilitam a investigação do papel complexo da resposta imune do hospedeiro na progressão do melanoma.

Aqui, é apresentado um pipeline para identificação de metas de metástase de melanoma. Com conjuntos de dados cada vez maiores de “omics” sendo gerados a partir de coortes de pacientes com melanoma, postulamos que os estudos que mais mantêm a promessa clínica são aqueles que decorrem da integração de big data, levando a um interrogatório funcional e mecanicista mecanicista mecático mecáticomecático. Ao usar modelos de camundongos para estudar potenciais alvos no processo metastático, pode-se explicar eventos in vivo e interações teciduais, aumentando assim a probabilidade de tradução clínica. Vários métodos para quantificar a carga metastática são descritos, fornecendo dados complementares sobre os resultados de qualquer experimento. Um protocolo para isolamento unicelular de tumores em vários órgãos é descrito para ajudar a caracterização imparcial da expressão genética em células metastáticas, que podem preceder o sequenciamento de RNA unicelular ou em massa.

Protocol

NOTA: Os procedimentos animais envolvidos no seguinte protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Nova York (IACUC). Todos os procedimentos são realizados em instalações aprovadas pela Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care International (AAALAC). A Figura 1 retrata a abordagem experimental geral. 1. Culturas de melanoma derivados do paciente (STCs) …

Representative Results

Os números a seguir ilustram como o fluxo de trabalho descrito tem sido aplicado para a identificação de novos condutores de metástase de melanoma. A Figura 2 resume os resultados de um estudo publicado em que foram estudados26 os efeitos do silenciamento do fucosyltransferase FUT8 in vivo melanoma. Resumidamente, a análise dos dados glicomicomicos do paciente humano (obtidos por matrizes de lectina) e o perfil transcriômico revelaram níveis aumentados…

Discussion

O objetivo deste relatório técnico é oferecer um fluxo de trabalho padronizado, de ponta a ponta para a investigação de potenciais atores em metástase de melanoma. Como os experimentos in vivo podem ser caros e demorados, estratégias para maximizar a eficiência e aumentar o valor das informações obtidas são primordiais.

É imprescindível a utilização de abordagens complementares ao longo de todo para cruzar os achados dentro do mesmo experimento. Por exemplo, tanto a col…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos à Divisão de Tecnologias avançadas de Pesquisa (DART) da NYU Langone Health, e, em particular, ao Laboratório de Pesquisa em Patologia Experimental, ao Centro de Tecnologia do Genoma, ao Laboratório de Citometria e Triagem Celular, ao Núcleo de Imagem Pré-Clínica, que são parcialmente apoiados pelo Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH/NCI 5P30CA016087. Agradecemos ao Grupo Cooperativo Interdisciplinar de Melanoma da NYU (PI: Dr. Iman Osman) por fornecer acesso a culturas de curto prazo de melanoma derivados do paciente+ (10-230BM e 12-273BM), que foram obtidos por meio de protocolos aprovados pelo IRB (Estudo de Consentimento Universal #s16-00122 e estudo do Grupo Cooperativo Interdisciplinar de Melanoma #10362). Agradecemos ao Dr. Robert Kerbel (Universidade de Toronto) por fornecer linhas de células de melanoma 113/6-4L e 131/4-5B1* e Dr. Meenhard Herlyn (Instituto Wistar) por fornecerem culturas WM 4265-2, WM 4257s-1, WM 4257-2 melanoma culturas de curto prazo**. E.H. é apoiado pelo NIH/NCI R01CA243446, P01CA206980, um American Cancer Society-Melanoma Research Alliance Team Science Award, e um NIH Melanoma SPORE (NCI P50 CA225450; PI: I.O.). A Figura 1 foi criada com Biorender.com.

Materials

#15 Scapel Blade  WPI 500242 For surgical procedures
#3 Scapel Handle WPI 500236 For surgical procedures
1 mL Tuberculin syringe, slip tip  BD 309626 Injections
10 mL syringe, slip tip  BD 301029 Perfusion
10% Formalin Sodium Buffered EK Industries 4499-20L For perfusion/tissue fixative
15 mL Conical Corning  430052 Cell culture
15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Falcon 352196 Cell culture
200 Proof Ethanol Deacon Labs 04-355-223 Histology
22G – 22mm needle BD 305156 Perfusion
4-0 Vicryl Suture Ethicon J464G Suture
4% Carson's phosphate buffered paraformaldehyde  EMS 15733-10 For perfusion/tissue fixative
40µm Corning 431750 Tissue processing
5-0 Absorbable Suture  Ethicon 6542000 Closure
50 mL Conical  Corning  430828 Cell culture
50mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Falcon 352070 Cell culture
7-0 Silk suture  FST 18020-70 Ligature
70µm Corning 431751 Tissue processing
Anti-fade mounting media   Vector Labs H-1000-10 Immunofluorescence
Approximator applying Forceps, 10cm  WPI 14189 For microsurgical procedures
Avance Bruker 3 HD NMR Console 
Biospec 7030  Bruker 7030 Micro MRI
BSA Bioreg A941 NuMA Staining
Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm  WPI WP5025501 For microsurgical procedures
Coplin Staining Jar Bel-Art  F44208-1000 Histology
DAPI Sigma-Aldrich D9542-1MG Immunofluorescence
dCas9-KRAB Addgene 110820 Genetic manipulation
DNase I NEB M0303L Tissue processing
DPBS Corning 21-030-CM Tissue processing
Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade GEM 62-0167 Tissue processing
Extracellular Matrix Substrate  Corning 354234 Consider the Growth Factor Reduced ( as alternative 
FBS Cytiva SH30910.03 Cell culture
Fiji Image J Fiji Image J Software Immunofluorescence
Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer  Thermo Fisher A16104 NuMA Staining
Goat Serum Gibco PCN5000 Immunofluorescence
HBSS Corning 21-020-CV Tissue processing
Hematoxylin  Richard-Allan Scientific  7231 Histology
Illumina III  PerkinElmer CLS136334 BLI Instrument
Insulin syringe 28G – 8mm needle BD 329424 Injections
Insulin syringe 31G – 6mm needle  BD 326730 Injections
Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serrated WPI 504478 For perfusion and surgical procedures
Isoflurane USP Covetrus 11695067772 Anesthesia
Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Tip WPI WP6570 For microsurgical procedures
Ketamine HCl 100mg/mL Mylan Ind. 1049007 Anesthesia
lentiCRISPRv2 Addgene 98290 Genetic manipulation
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649 Invitrogen L32472 Vascular endothelial cells marker
MEM non-essential amino acids X 100 Corning 25-025-CI Cell culture
Metzenbaum Scissors WPI 503269 For surgical procedures
Microinjection Unit KOPF 5000 Intracardiac injections
NaCl Fisher S25877  NuMA Staining
Needle 30G x 25mm BD 305128 Intracardiac Injection
Needle 33G x 15mm Hamilton 7747-01 Intracarotid Injection
Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated Jaws WPI 14137-G For microsurgical procedures
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice The Jackson Laboratory 005557 Murine model
NU/J mice The Jackson Laboratory 002019 Murine model
Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human  Abcam 97585 NuMA Staining
Penicillin-Streptomycin 10000U/mL Gibco 15140122 Cell culture
Percoll GE 0891-01 density separation solution 
PI Classic Surgical Gloves Cardinal Health 2D72PT75X Surgery
pLKO Tet-On Addgene 21915 Genetic manipulation
Povidone-Iodine 10% Solution Medline MDS093943 Surgery
Proparacaine Drops 0.5% Akorn Pharma AX0501 Opthalmic local anesthetic
Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment Dechra 83592 Anesthesia
Razor Blade Double Edge Blades  EMS 72000 Shaving and Vibrotome Brain Slicing 
Reflex 9mm EZ Clip  Braintree EZC- KIT Wound closure
RPMI 1640  Corning 10-040-CM Cell culture
Scissors, Spring 10.5cm Str, 8mm Blades WPI 501235 For microsurgical procedures
Semi-Automatic Vibrating Blade Microtome Leica VT1200 Brain Slice Immunofluorescence
Single Channel Anesthesia Vaporizer System Kent Scientific VetFlo-1210S  Anesthesia
Smartbox Tabletop Chamber System and Exhaust Blower EZ Systems TT4000 CO2 Euthanasia
Sterile Fenestrated Disposable Drape Medline NON21002 Surgery
Sterile Non-Reinforced Aurora Surgical Gowns with Set-In Sleeves Medline DYNJP2715 Surgery
T25 Flask Corning  430639 Cell culture
Tris Corning 46-031-CM NuMA Staining
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ML Immunofluorescence
Troutman tying forceps, 10cm, Curved G pattern, 0.52mm tip with tying platform WPI WP505210 For microsurgical procedures
Vessel clips 10G Pressure 5x 0.8mm Jaws, 5/pkg WPI 15911 For microsurgical procedures
Visiopharm Visiopharm Visiopharm NuMA Staining Quantification Software
Xylasine 100mg/mL Akorn Pharma 59399-111-50 Anesthesia
Xylene Fisher X3P-1GAL Histology
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Adler, N. R., Haydon, A., McLean, C. A., Kelly, J. W., Mar, V. J. Metastatic pathways in patients with cutaneous melanoma. Pigment Cell Melanoma Research. 30 (1), 13-27 (2017).
  3. Platz, A., Egyhazi, S., Ringborg, U., Hansson, J. Human cutaneous melanoma; a review of NRAS and BRAF mutation frequencies in relation to histogenetic subclass and body site. Molecular Oncology. 1 (4), 395-405 (2008).
  4. Alonso, S. R., et al. A high-throughput study in melanoma identifies epithelial-mesenchymal transition as a major determinant of metastasis. Recherche en cancérologie. 67 (7), 3450-3460 (2007).
  5. Rowe, C. J., Khosrotehrani, K. Clinical and biological determinants of melanoma progression: Should all be considered for clinical management. Australasian Journal of Dermatology. 57 (3), 175-181 (2016).
  6. Plebanek, M. P., et al. Pre-metastatic cancer exosomes induce immune surveillance by patrolling monocytes at the metastatic niche. Nature Communications. 8 (1), 1319 (2017).
  7. Orgaz, J. L., et al. Loss of pigment epithelium-derived factor enables migration, invasion and metastatic spread of human melanoma. Oncogene. 28 (47), 4147-4161 (2009).
  8. Ladhani, O., Sanchez-Martinez, C., Orgaz, J. L., Jimenez, B., Volpert, O. V. Pigment epithelium-derived factor blocks tumor extravasation by suppressing amoeboid morphology and mesenchymal proteolysis. Neoplasia. 13 (7), 633-642 (2011).
  9. Ju, R. J., Stehbens, S. J., Haass, N. K. The role of melanoma cell-stroma interaction in cell motility, invasion, and metastasis. Frontiers in Medicine – Dermatology. 5, 307 (2018).
  10. Wiley, H. E., Gonzalez, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
  11. Meier, F., et al. Metastatic pathways and time courses in the orderly progression of cutaneous melanoma. British Journal of Dermatology. 147 (1), 62-70 (2002).
  12. Turner, N., Ware, O., Bosenberg, M. Genetics of metastasis: melanoma and other cancers. Clinical & Experimental Metastasis. 35 (5-6), 379-391 (2018).
  13. Ubellacker, J. M., et al. Lymph protects metastasizing melanoma cells from ferroptosis. Nature. 585 (7823), 113-118 (2020).
  14. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  15. Cunningham, C. C., et al. Actin-binding protein requirement for cortical stability and efficient locomotion. Science. 255 (5042), 325-327 (1992).
  16. Unger, C., et al. Modeling human carcinomas: physiologically relevant 3D models to improve anti-cancer drug development. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 50-67 (2014).
  17. Fong, E. L., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Yu, H. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
  18. Nakamura, K., et al. Characterization of mouse melanoma cell lines by their mortal malignancy using an experimental metastatic model. Life Science. 70 (7), 791-798 (2002).
  19. Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
  20. Koya, R. C., et al. BRAF inhibitor vemurafenib improves the antitumor activity of adoptive cell immunotherapy. Recherche en cancérologie. 72 (16), 3928-3937 (2012).
  21. Jenkins, M. H. Multiple murine BRaf(V600E) melanoma cell lines with sensitivity to PLX4032. Pigment Cell Melanoma Research. 27 (3), 495-501 (2014).
  22. Tuncer, E., et al. SMAD signaling promotes melanoma metastasis independently of phenotype switching. The Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2702-2716 (2019).
  23. Schwartz, H., et al. Incipient Melanoma Brain Metastases Instigate Astrogliosis and Neuroinflammation. Recherche en cancérologie. 76 (15), 4359-4371 (2016).
  24. Perez-Guijarro, E., et al. Multimodel preclinical platform predicts clinical response of melanoma to immunotherapy. Nature Medicine. 26 (5), 781-791 (2020).
  25. Krepler, C., et al. A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
  26. Agrawal, P., et al. A systems biology approach identifies FUT8 as a driver of melanoma metastasis. Cell. 31 (6), 804-819 (2017).
  27. Hanniford, D., et al. Epigenetic silencing of CDR1as drives IGF2BP3-mediated melanoma invasion and metastasis. Cancer Cell. 37 (1), 55-70 (2020).
  28. Kim, H., et al. PRMT5 control of cGAS/STING and NLRC5 pathways defines melanoma response to antitumor immunity. Science Translational Medicine. 12 (551), (2020).
  29. de Miera, E. V., Friedman, E. B., Greenwald, H. S., Perle, M. A., Osman, I. Development of five new melanoma low passage cell lines representing the clinical and genetic profile of their tumors of origin. Pigment Cell Melanoma Research. 25 (3), 395-397 (2012).
  30. Morsi, A., et al. Development and characterization of a clinically relevant mouse model of melanoma brain metastasis. Pigment Cell Melanoma Research. 26 (5), 743-745 (2013).
  31. Huynh, C., et al. Efficient in vivo microRNA targeting of liver metastasis. Oncogene. 30 (12), 1481-1488 (2011).
  32. Zou, C., et al. Experimental variables that affect human hepatocyte AAV transduction in liver chimeric mice. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 18, 189-198 (2020).
  33. Kleffman, K., et al. Melanoma-secreted Amyloid Beta Suppresses Neuroinflammation and Promotes Brain Metastasis. bioRxiv. , 854885 (2019).
  34. Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Molecular Imaging and Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).
  35. Sil, P., Wong, S. W., Martinez, J. More than skin deep: autophagy is vital for skin barrier function. Frontiers in Immunology. 9, 1376 (2018).
  36. Chen, S., et al. Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis. Cell. 160 (6), 1246-1260 (2015).
  37. Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  38. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  39. Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nucleic Acids Research. 30 (1), 207-210 (2002).
  40. Lappalainen, I., et al. The European Genome-phenome Archive of human data consented for biomedical research. Nature Genetics. 47 (7), 692-695 (2015).
  41. Cerami, E., et al. The cBio cancer genomics portal: an open platform for exploring multidimensional cancer genomics data. Cancer Discovery. 2 (5), 401-404 (2012).
  42. Grossman, R. L., et al. Toward a shared vision for cancer genomic data. New England Journal of Medicine. 375 (12), 1109-1112 (2016).

Tags

Melanoma MetastasisIn Vivo ModelsTarget DiscoveryTherapy DevelopmentIntradermal InjectionIntracardiac InjectionTumor Growth MonitoringUltrasound Guidance

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Shadaloey, A. A. S., Karz, A., Moubarak, R. S., Agrawal, P., Levinson, G., Kleffman, K., Aristizabal, O., Osman, I., Wadghiri, Y. Z., Hernando, E. A Robust Discovery Platform for the Identification of Novel Mediators of Melanoma Metastasis. J. Vis. Exp. (181), e63186, doi:10.3791/63186 (2022).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image