Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Исследование метилома аргинина с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса

Published: December 16, 2021 doi: 10.3791/63245
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1
1Gottfried Schatz Research Center for Cell Signaling, Metabolism and Aging, Molecular Biology and Biochemistry, Medical University of Graz, 2Ministry of Education, School of Basic Medical Sciences, Key Laboratory of Gastrointestinal Cancer (Fujian Medical University)
* These authors contributed equally

Summary

Настоящий протокол описывает получение и количественное измерение свободного и связанного с белком аргинина и метил-аргининов с помощью 1Н-ЯМР-спектроскопии.

Abstract

Связанный с белком аргинин обычно метилируется во многих белках и регулирует их функцию, изменяя физико-химические свойства, их взаимодействие с другими молекулами, включая другие белки или нуклеиновые кислоты. В этой работе представлен легко реализуемый протокол для количественной оценки аргинина и его производных, включая асимметричный и симметричный диметиларгинин (ADMA и SDMA, соответственно) и монометиларгинин (MMA). После выделения белка из биологических жидкостей организма, тканей или клеточных лизатов описан простой метод гомогенизации, осаждения белков и гидролиза белка. Поскольку гидролизаты содержат много других компонентов, таких как другие аминокислоты, липиды и нуклеиновые кислоты, этап очистки с использованием твердофазной экстракции (SPE) имеет важное значение. SPE может выполняться вручную с помощью центрифуг или робота-пипетки. Чувствительность для ADMA с использованием текущего протокола составляет около 100 нмоль/л. Верхний предел обнаружения аргинина составляет 3 ммоль/л из-за насыщения SPE. Таким образом, этот протокол описывает надежный метод, который охватывает от биологической пробоподготовки до обнаружения на основе ЯМР, предоставляя ценные подсказки и подводные камни для успешной работы при изучении метилома аргинина.

Introduction

В течение последних двух десятилетий метилирование остатков аргинина было признано важной посттрансляционной модификацией белков. Он влияет на фундаментальные биологические процессы, такие как регуляция транскрипции, сигнальная трансдукция и многие другие1. Основными белками, участвующими в регуляции метилирования аргинина, являются белковые аргининметилтрансферазы (PRMTs)2. Основными производными аргинина являются ω-(NG,N G)-асимметричный диметиларгинин (ADMA), ω-(N G,N'G)-симметричный диметиларгинин (SDMA) и ω-N G-монометиларгинин (MMA)2.

PRMT используют S-аденозил-l-метионин для переноса метильных групп в терминальную гуанидиновую группу (с двумя эквивалентными аминогруппами) связанного с белком аргинина1. Можно выделить два основных фермента: ферменты типа I и типа II катализируют первую стадию метилирования с образованием ММА (который тем самым теряет свою симметрию). После этой стадии ферменты типа I (например, PRMT1, 2, 3, 4, 6, 8) используют MMA в качестве субстрата для образования ADMA, тогда как ферменты типа II (в первую очередь PRMT5 и PRMT9) продуцируют SDMA. PRMT1 был первой белковой аргининметилтрансферазой, выделенной из клеток млекопитающих3. Тем не менее, PRMT были эволюционно сохранены4 у других животных, таких как немлекопитающие позвоночные, беспозвоночные хорды, иглокожие, членистоногие и нематоды cnidarians5, растения6 и простейшие, включая грибы, такие как дрожжи7. Во многих случаях нокаут одного из PRMT приводит к потере жизнеспособности, выявляя существенную роль метилированных видов аргинина, участвующих в фундаментальных клеточных процессах, таких как транскрипция, трансляция, сигнальная трансдукция, апоптоз и разделение жидкой фазы (что означает образование безмембранных органелл, например, ядрышек), которые регулярно включают богатые аргинином домены 8,9,10 . В свою очередь, это влияет на физиологию и болезненные состояния, включая рак 11,12,13, множественную миелому14, сердечно-сосудистые заболевания 15, вирусный патогенез, спинальную мышечную атрофию16, сахарный диабет17 и старение 1. Считается, что повышенные уровни ADMA в кровотоке, например, полученные из легких18 из-за распада белка, связаны с эндотелиальной дисфункцией, хроническим заболеванием легких19 и другими синдромами сердечно-сосудистых заболеваний20. Было обнаружено, что чрезмерная экспрессия PRMT ускоряет опухолевый генез и связана с плохим прогнозом21,22. Кроме того, абляция PRMT6 и PRMT7 запускает клеточное старениефенотипа 23. Значительное снижение ADMA и PRMT1 было обнаружено во время старения фибробластов WI-3824.

Задача состоит в том, чтобы понять, как метилирование действует в (пато)физиологических процессах, идентифицируя и количественно оценивая метилирование белка аргинина. Большинство современных подходов используют антитела для обнаружения метилированных аргининов. Тем не менее, эти антитела по-прежнему зависят от контекста и могут не распознавать различные мотивы аргининметилированных белков25,26. В описанном протоколе все производные аргинина, упомянутые выше, могут быть надежно количественно определены с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), т.е. отдельно, в комбинации или, как в большинстве случаев, в сложных биологических матрицах, таких как эукариотические клетки (например, из дрожжей, мышей или человека) и ткани27, а также сыворотка28. Для белков и этих сложных матриц гидролиз белка29 является необходимым условием для генерации свободных (модифицированных) аминокислот, таких как аргинин, ММА, SDMA и ADMA. Твердофазная экстракция (SPE)30 позволяет обогащать интересующие соединения. Наконец, 1H-ЯМР-спектроскопия позволяет параллельно обнаруживать аргинин и все основные метиловые производные аргинина. ЯМР-спектроскопия имеет то преимущество, что она действительно количественная, высоко воспроизводимая и надежная техника31,32. Окончательные измерения ЯМР могут быть сделаны после того, как будет собрано и подготовлено много образцов. Наконец, этот протокол в основном фокусируется на подготовке образцов, поскольку для этого не требуется собственный ЯМР-спектрометр. Он может быть выполнен в большинстве биохимических лабораторий. Тем не менее, в этой работе приведены некоторые намеки на то, какие измерения ЯМР-спектроскопии должны быть сделаны.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Гидролизаты дрожжевого белка были использованы в качестве образцов для репрезентативных результатов этой работы. Весь протокол обобщен на рисунке 1.

1. Подготовка материалов и реагентов

  1. Метанол/вода: готовят смесь из двух частей 99% метанола (MeOH) и одной частиH2O, обозначенной как MeOH/H2O. Храните чистые MeOH и MeOH/H2O при -20 °C для минимизации испарения спирта и повышения стабильности пробы.
  2. Соляная кислота (HCl): разбавляют 9 моль/л из концентрированного HCl (12,0 моль/л или 37%), а также 0,1 моль/л HCl. Для гидролиза белка используется более высококонцентрированный (9 моль/л) раствор, а для твердофазной экстракции используется более низкий концентрированный (0,1 моль/л).
    ВНИМАНИЕ: Работайте внутри вытяжного шкафа.
  3. Приготовьте заменяющий раствор для SPE, содержащий 10% насыщенного раствора аммиака (запас: 30% мас./мас. аммиака), 50% метанола и 40% воды (v/v).
  4. Буфер ЯМР: Растворите 5,56 г динатрий-гидрофосфата (Na2HPO4, 0,08 моль/л), 0,4 г 3-(триметилсилил)пропионовой кислоты-2,2,3,3-d4 натриевой соли (TSP, 5 ммоль/л), 0,04 % (мас./об.) азида натрия (NaN3) в 500 мл диоксида дейтерия (D2O) и подведите к рН 7,4 (используя HCl или NaOH, соответственно) (см. Таблицу материалов). Проверяйте чистоту каждой новой буферной партии с помощью ЯМР-спектроскопии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество любых загрязняющих веществ (например, этанола) должно быть как можно ниже.
  5. Наполните трубы для варки целлюлозы шариками оксида циркония (для большинства применений подходят пробирки объемом 2 мл и бусины диаметром 1,4 мм, но доступны различные варианты) (см. Таблицу материалов). Заполните примерно 10-20 бусин вручную или купите предварительно заполненные трубки, которые также доступны.
  6. Держите пипетки и соответствующие наконечники наготове в диапазоне 10-1000 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всей работы использовалась высокочистая вода, обозначенная какH2O, определяемая высоким сопротивлением ≥18,2 МОм·см-1. Соответствует двойной дистиллированной воде.

2. Сбор и хранение образцов

  1. Флэш-замораживание жидких образцов (сыворотка/плазма, супернатант клеточной культуры и т.д.) жидким азотом и хранение их при -80 °C до использования.
  2. Подготовьте твердые материалы, как указано ниже.
    1. Соберите клетки из клеточных культур (3-5 миллионов клеток) либо путем сбора адгезивных клеток, после промывки холодным фосфатно-буферным физиологическим раствором, соскоба и центрифугирования, либо путем прямого центрифугирования клеток, выращенных во взвешенной суспензии.
    2. Удалите клеточные супернатанты (которые могут быть собраны для дальнейшего анализа, либо путем последовательного прямого измерения, см. этап 6, либо после осаждения растворимых белков, см. этап 3.1), а затем мгновенно заморозьте гранулы жидким азотом и храните при -80 °C. Для дальнейшей обработки см. шаг 3.2.
    3. Храните и собирайте ткани в соответствии с целью исследования. На очень однородные ткани, такие как печень или мышца, анализируют любую ее часть. Например, в случае мозга мыши определите глобальное метилирование аргинина всего мозга или участков мозга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальный вес обрабатываемых тканей составляет 30-60 мг. Желательно заморозить и измельчить весь мозг и использовать его аликвоты. Альтернативно, могут быть использованы конкретные части мозга (например, лобные, мозжечковые, затылочные области или одно полушарие, весом ~ 250 мг).

3. Предварительная пробоподготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте работу на льду, сохраняя MeOH холодным. Образцы также должны храниться на льду, чтобы избежать деградации белка.

  1. Для жидких образцов добавьте 400 мкл ледяного метанола к 200 мкл образца. Перейдите к шагу 3.3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если имеется меньше проб, отрегулируйте объемы соответствующим образом; Чувствительность ЯМР обычно достаточно высока для меньших количеств образцов, но должна быть проверена индивидуально.
  2. В случае твердых материалов подготовьте достаточно 1,5 мл пробирок для лизатов (используют для центрифугирования после гомогенизации).
    1. Осторожно, но тщательно, повторно суспендируйте гранулы клеток в 600 мкл MeOH/H2Oи перенесите всю жидкую фазу в пульпозные трубки.
    2. Поместите ткани в пульпозные пробирки (вы можете непосредственно взвесить их в пробирки) и добавьте 600 мкл MeOH/H2O(для 30-60 мг; скорректируйте, если вес существенно отличается).
    3. Поместите трубки в тканевой гомогенизатор (см. Таблицу материалов) и либо гомогенизируйте один раз в течение 20 с сильным встряхиванием (для клеточных гранул, мягких тканей), либо два раза по 20 с каждый (или дольше, если это необходимо) с интервалом 5 мин между ними (для жестких тканей).
    4. После гомогенизации сразу же снова положите образцы на лед и переложите целые лизаты в новые пробирки объемом 1,5 мл.
  3. Храните образцы не менее 30 мин (до нескольких дней) при -20 °C перед дальнейшей обработкой.
  4. Центрифуга при 10 000 х г в течение 30 мин при 4 °C. Тем временем подготовьте достаточное количество пробирок объемом 1,5 мл для сбора супернатантов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот супернатант (обозначенный "(1)" на рисунке 1) может быть выброшен, лиофилизирован и непосредственно обработан для ЯМР (этап 6) или проанализирован иным образом.
  5. В этом протоколе осадок MeOH (= гранула, полученная после стадии 3.1 или 3.2.2 соответственно) используется для дальнейшего анализа, содержащего, среди прочего, такие компоненты, как нуклеиновые кислоты и липиды, аргинин-метилированные белки. Продолжайте гидролиз белка или храните гранулы при -20 °C в течение нескольких дней.

4. Гидролиз белка

  1. Добавьте 500 мкл 9 моль/л HCl к каждому образцу. Затем ножницами усыплите колпачки каждой трубки и поместите их в стеклянные культуральные трубки (рисунок 2А). Осторожно, но плотно закройте красные колпачки (тем самым проверив герметизацию).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием всегда проверяйте каждое уплотнение (серая фольга из PTFE внутри красных винтовых колпачков) на предмет правильной затяжки и регулярно очищайте их водой.
  2. После завершения поместите трубки в стакан, частично заполненный песком (для лучшей теплопередачи), и гидролизуйте образцы в течение примерно 16 ч при 110 °C в сушильной камере.
  3. После гидролиза охладите образцы (~1 ч).
  4. После этого лиофилизируют на ночь с помощью центрифуги с высоким вакуумом (ниже 100 Па).
  5. Растворить гранулы - если они полностью высохли (если нет, продолжить лиофилизацию) - в 1 мл 0,1 моль/л HCl и добавить 50 мкл хлороформа (CHCl3) в каждую пробирку; тщательно растворите гранулу пипеткой объемом 1000 мкл, тем самым перемешав жидкости, а затем переложите весь объем в новую трубку.
    ВНИМАНИЕ: Всегда работайте с небольшими количествами, чтобы свести к минимуму обширное испарение
  6. Затем центрифугу при 8000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
  7. Аккуратно соберите верхнюю фазу двухфазной жидкости, содержащей водорастворимую фракцию (фиг.2В, фракция с более низкой плотностью), пипеткой и заполните ее в новые пробирки. Используйте трубки объемом 1,5 мл для ручного SPE (раздел 5.2) или стеклянные флаконы для роботизированных SPE (раздел 5.3 и рисунок 2D). Избегайте разлива CHCl3 и его содержимого (рисунок 2C).

5. Твердофазная экстракция (SPE)

  1. Перед первым использованием очистите картриджи SPE два раза 1 мл заменяющего раствора (этап 1.3) с последующим центрифугированием при 800 х г в течение 1 мин при комнатной температуре (помещено в пробирки по 15 мл). Их можно использовать по 10-20 раз каждый.
  2. Руководство SPE
    1. Предварительно кондиционируйте картриджи (см. Таблицу материалов) в каждом прогоне с 1 мл чистого метанола и 2 х 1 мл PBS, каждый раз с последующим центрифугированием при 800 х г в течение 1 мин при комнатной температуре (помещается в трубки по 15 мл).
    2. После этого загрузите образцы (из шага 4.7) на картриджи SPE и центрифугируйте их при 600 х г в течение 2 мин при комнатной температуре.
    3. Затем примените цикл стирки, как указано ниже.
      1. Добавляют трижды по 1 млH2O(каждый с последующим центрифугированием в течение 1 мин при 800 х г при комнатной температуре).
      2. Добавить пять раз по 1 мл 0,1 моль/л HCl (каждый с последующим центрифугированием в течение 1 мин при 800 х г при комнатной температуре).
      3. Добавьте два раза по 1 мл MeOH (каждый с последующим центрифугированием в течение 1 мин при 800 х г при комнатной температуре).
    4. Затем элюируют аргинин и его производные 3 х 1 мл замещающего раствора (с последующим центрифугированием 1 мин при 800 х г при комнатной температуре) в одну пробирку объемом 15 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Заменяющий раствор служит элюентом для аргинина и производных, а также используется для очистки картриджей (все вещества либо вымываются перед элюированием, либо при базовом значении рН замещающего раствора). Тем не менее, чтобы избежать загрязнения с течением времени, повторное использование должно быть ограничено (см. шаг 5.1).
  3. Роботизированный SPE
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь робот для пипетки (основная часть, состоящая из иглы для пипетки, промывочной станции для иглы, подачи реагента и положений для образцов и элюатов, см. Таблица материалов) поставляется с держателем картриджа для колонн SPE. Для других инструментов убедитесь, что они полностью оснащены всеми перечисленными вещами.
    1. Наполните супернатант (из стадии 4.7) непосредственно в стеклянные флаконы с уплотнением из PTFE (рисунок 2D), подготовьте достаточно реагентов (по 100 мл каждого, т.е. замещающий раствор, 99% MeOH, PBS,H2Oи 0,1 моль/л HCl), 5 мл пробирок для элюирования и промывочного раствора для иглы робота (обычноH2O).
    2. Используйте приложение или метод в программном обеспечении робота, основанный именно на шагах, описанных для ручного SPE (шаг 5.2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Детали могут сильно различаться между поставщиками приборов, поэтому обратитесь к руководству по программному обеспечению соответствующего робота для программирования. Пипеточный робот обычно работает, применяя давление воздуха к картриджам вместо центрифугирования, что является основным отличием. Если протокол установлен и запущен в первый раз, включите элементы управления (например, L-аргинин известной концентрации) для проверки оптимального рабочего процесса.

6. Заключительная подготовка к ЯМР

  1. Лиофилизируйте образцы на ночь до полной сухости, чтобы избавиться от аммиака иH2O.
  2. Растворить каждый образец в 500 мкл ЯМР-буфера (этап 1.4) и перенести в ЯМР-пробирки. Важно отметить, что объем должен быть одинаковым во всех пробирках, а образцы должны быть однородными (без остатков и липидов, которые имеют тенденцию к агрегации).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Детали ЯМР-спектроскопии выходят за рамки данного обзора метода и более подробно описаны в другом месте27. Здесь объясняются только основные требования и шаги. Количественную оценку аргинина и его метаболитов проводят на ЯМР-спектрометре 600 МГц (см. Таблицу материалов). В принципе, могут быть использованы любые другие ЯМР-спектрометры/напряженности поля ЯМР при условии, что ЯМР-сигналы аргинина и метилированных аргининов могут быть обнаружены с достаточной чувствительностью и без перекрытия сигналов. Можно использовать любую головку зонда с градиентами оси Z, способную регистрировать 1H-спектр, при условии, что последовательности импульсов настроены соответствующим образом.
  3. Запись 1D-спектра с помощью последовательности импульсов CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill) 33,34 (cpmgpr1d, 512 сканирований, размер fid 73728, спектральная ширина 11904,76 Гц на ЯМР 600 МГц, задержка рециркуляции 4 с) с подавлением сигнала воды с использованием предварительной насыщения.
  4. В этих экспериментах удаляют скалярные связи 1H путем виртуального разъединения, уменьшая перекрытие сигнала. Запишите дополнительные для конкретных вопросов и/или сложных образцов или матриц, например, 1спектры H-13C-гетероядерной одинарной квантовой когерентности (HSQC)27.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для более сложных матриц, в которых 1H ЯМР-сигналы метилированных аргининов могут быть частично перекрыты с 1H ЯМР-сигналами других метаболитов (например, лизина), требуется 1H гомоядерных спектров J-разрешения (JRES)35 .
  5. Выполнение абсолютной количественной оценки путем интегрирования соответствующих пиковых интенсивностей эталонов известной концентрации, например, 100 мкмоль/аргинин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно ADMA, SDMA и MMA (см. Таблицу материалов) сообщаются как отношение по отношению к аргинину. Это имеет существенное преимущество в том, что не требуется проводить отдельную нормализацию (например, количество клеток, массу ткани, концентрации белка). В этом случае аргинин служит внутренним стандартом, и относительная количественная оценка достаточна для получения биологически значимой информации.
  6. Для дифференциации SDMA и MMA лиофилизировать образцы снова следует для избавления отD2O (если они были повторно суспендированы в буфере ЯМР ранее), который затем заменяется дейтерированным диметилсульфоксидом (d6-DMSO), что позволяет разрешить метиловые резонансы27. Поэтому аспирируют образцы из ЯМР-пробирок пипетками Пастера, лиофилизируют и растворяют их в 500 мкл d 6-DMSO.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Как правило, 1H 1D проекции 2D J-разрешения (JRES), практически разъединенных спектров ЯМР используются для пиковых назначений и количественных измерений в нашей лаборатории36. На рисунке 3 показаны репрезентативные спектры JRES гидролизатов дрожжевого белка, очищенных с использованием настоящего протокола SPE. Хотя в очень разных концентрациях, оба вещества могут быть разделены и количественно определены в клеточной матрице. Основываясь на количестве протонов специфической метиловой (-CH3) или метиленовой (-CH2-) группы при соответствующем химическом сдвиге, 1H-ЯМР-спектроскопия позволяет точно количественно определить. Как указано в протоколе (этап 0), относительная количественная оценка производного метил-аргинина по сравнению с аргинином в основном адекватна для наблюдения биологических процессов, например, изменений метилирования аргинина в ответ на модуляции, такие как нокдаун/сверхэкспрессия генов, изменения в питательных веществах или лечение ингибиторами.

Как показано ранее27, L-аргинин и ADMA могут быть хорошо различимы по их различным характерным химическим сдвигам при 3,25 и 3,02 ppm соответственно. Метилпротоны SDMA и MMA обнаруживают перекрывающиеся пики вD2O(буфер ЯМР, описанный на этапе 1.4) при химическом сдвиге 2,85 ppm. Если пик присутствует в соответствующем положении, можно разделить SDMA и MMA путем растворения образцов в d6-DMSO, как описано в шаге 6.6 протокола. Используя этот подход, химические сдвиги ЯМР 1H SDMA и MMA могут быть разделены и количественно определены с характерными химическими сдвигами при 2,76 ppm (SDMA) и 2,74 ppm (MMA)27. На рисунке 3B показаны репрезентативные данные SDMA и MMA (оба 100 мкмоль/л) вD2Oи d6-DMSO, соответственно. Соответствующие данные SMDA и MMA, обнаруженные в различных клетках и тканях, были сообщены недавно27. Как описано на этапах 6.4-6.5 протокола, для количественной оценки могут использоваться эталонные стандарты известных концентраций. Все справочные стандарты, упомянутые в тексте, являются коммерчески доступными.

Figure 1
Рисунок 1: Обзор пробоподготовки. Схема, раскрывающая значительные этапы от сбора проб до измерения ЯМР. Черные ящики относятся к нумерации в разделах протокола. Кроме того, показано приблизительное количество дней (варьирующееся в зависимости от количества образцов). Неоднородные жидкие образцы могут быть центрифугированы перед добавлением MeOH (этап 3.1) для удаления остатков (не показано). Супернатант после начального центрифугирования (1), содержащий, например, внутриклеточные метаболиты или не связанные с белками метаболиты аргинина, может храниться при -20°С для дальнейшего анализа. Обычно гранулы MeOH (2) дополнительно анализируются. Сокращения: CHCl3, хлороформ; HCl, соляная кислота; MeOH, метанол; ЯМР, ядерный магнитный резонанс; o/n, ночь; SN, супернатант; SPE, твердофазная экстракция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Обработка гидролизатов белка и подготовка к твердофазной экстракции. (A) Стакан, заполненный песком, стеклянные трубки, винтовые колпачки с серой политетрафторэтиленовой (PTFE) герметизирующей фольгой, и образцы в трубках объемом 1,5 мл после отсечения колпачков. (B) Трубка после центрифугирования (стадия 4.6) и (C) после удаления водного супернатанта (стадия 4.7): некоторое количество остаточной воды (~50 мкл) может остаться. Черный остаток содержит нерастворимые, покрытые древесным углем органические остатки. Тем не менее, некоторые образцы могут содержать цветные вещества (D), которые не мешают измерению L-аргинина. Частично это связано с твердофазной экстракцией (SPE) после этого, либо с использованием последовательных стадий центрифугирования (E), либо с помощью робота-пипетки (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Типичные спектры ЯМР L-аргинина и его метил-производных. 1 См. Спектры ЯМР с J-разрешением H1D могут легко различать δ-(CH2)-протонов L-аргинина (3,25 ppm) и ω-N-CH3-протонов асимметричного диметиларгинина (ADMA, при 3,02 ppm). Образцы из дрожжевых гранул (А), показывающие различные количества ADMA, могут быть количественно определены путем интеграции интенсивности сигнала даже в присутствии большого количества аргинина (обратите внимание, что полный пик аргинина не показан). (B) Поскольку ω-(N G,N'G)-симметричный диметиларгинин (SDMA) и ω-NG-монометиларгинин (MMA) вряд ли можно различить в буфере оксида дейтерия (D2O), образцы должны быть растворены в дейтерированном диметилсульфоксиде (d6-DMSO), где пики (в данном случае 100 мкмоль/л каждого вещества) можно легко отличить друг от друга (пики при 2,75 и 2,76 ppm, соответственно) и поддаются количественной оценке. Все спектрограммы были непосредственно экспортированы из управляющего программного обеспечения ЯМР-спектрометра. Программное обеспечение выявляет первичные результаты, которые необходимо проверить перед проведением более детального анализа, включая статистику многих образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В следующем разделе основное внимание уделяется самому методу; биологические последствия метилирования аргинина описаны в разделе Введение.

Во-первых, ткани различной жесткости могут нуждаться в корректировке лизиса образца: клетки из клеточной культуры (включая бактерии, дрожжи и т. Д.) И такие ткани, как мозг, молодая печень, гладкие мышцы и т. Д., Могут быть быстро гомогенизированы. Для тканей высокой жесткости (включая печень пожилых людей, артерии, кости и т.д.) гомогенизацию необходимо проводить дважды (см. этап 3.2.3). Тем не менее, этот процесс не следует продолжать чаще, даже если остались какие-то нерастворимые остатки. Вместо этого образцы должны быть центрифугированы в течение 10 мин при 10 000 х г , а супернатанты собраны для дальнейшего анализа (для сведения к минимуму деградации образца).

На каждой стадии, где образцы замораживаются (первоначально, после добавления MeOH, этапы 3.3, 3.4 или 3.5 соответственно) или после лиофилизации (этапы 4.4 и 6.1), образцы могут храниться в течение нескольких дней перед дальнейшей обработкой. Кроме того, супернатант со стадии 3.4 (после гомогенизации; обозначенный как "(1)" на фиг.1) также может храниться для дальнейшего анализа, например, для измерения метаболитов, отличных от метил-аргининов 36,37,38.

С одной стороны, критические этапы включают хранение образцов, поскольку деградация белков может изменить результат. Если деградация белка происходит до осаждения MeOH, аргинин и его метиловые производные могут быть недооценены. Поэтому хранение образцов имеет важное значение, например, до и после лизиса клеток или тканей при -20 °C или, когда это возможно, при -80 °C. До или после гомогенизации (этап 3.2) образцы следует хранить на льду.

С другой стороны, предварительная обработка образцов метанолом для осаждения белков не изменяет картину метилирования аргинина. Это было протестировано с экстрактами белка лизоцима и кишечной палочки (которые не содержат метилированного аргинина)27. Однако более ранние отчеты показали, что MeOH может метилировать концевые карбоксильные группы глутамата и аспартата39.

Для гидролиза белка убедитесь, что уплотнения винтовых колпачков неповреждены (шаг 4.1). Если нет, испарение HCl может повлиять на сушильную камеру. Концентрация аналитов не может быть критически изменена, потому что они не испаряются, а остаточный HCl испаряется позже путем лиофилизации. Можно использовать более низкие концентрации HCl, например, 6 моль/л, но может потребоваться более длительное время гидролиза. После гидролиза образцы могут быть обработаны при комнатной температуре. Однако правильное удаление липидов имеет важное значение. Липиды могут образовывать двухфазные смеси в воде (илиD2O, соответственно) позже во время измерения ЯМР. Эти неоднородности приводят к расширению пика ЯМР и потенциально влияют на качество и чувствительность экспериментов ЯМР.

Если для SPE нет робота для пипетки, это стоит инвестиций (его также можно использовать для других целей). Образцы на пипетном роботе SPE обрабатываются последовательно, и в настоящей установке один образец занимает ~ 40 минут для полного запуска. Из-за ограничений емкости реагентов (т.е. 100 мл) только 19 образцов могут быть обработаны за один раз (в общей сложности около 13 ч). Тем не менее, практическое время намного меньше, чем для ручной процедуры SPE, и требует меньше материала. В течение этого периода образцы могут храниться внутри робота при комнатной температуре до лиофилизации. Эквивалентные продукты могут заменить использованные матрицы и картриджи SPE. Тем не менее, рекомендуется оценить протокол SPE и при необходимости скорректировать его.

Предел обнаружения ДЛЯ ADMA составляет ~100 нмоль/л, измеренный ранее путем последовательного разбавления и с использованием сообщенного времени измерения ЯМР. С другой стороны, высокие концентрации аргинина могут также переоценить отношение ADMA к аргинину (которое обычно находится в диапазоне 5%-15%). Это связано с тем, что содержание аргинина выше 3 ммоль/л; емкость связывания колонны SPE может достигать насыщения27. Для проверки чувствительности и специфичности всего рабочего процесса в случае неожиданных результатов (например, отсутствие пиков или перекрывающихся пиков в спектрах 1H-ЯМР при сообщаемых химических сдвигах) стандарты ADMA, SDMA и MMA доступны у коммерческих поставщиков (см. Таблицу материалов). Если в какой-либо лаборатории нет ЯМР-спектрометра, все этапы, включая окончательную лиофилизацию (этап 6.1), могут быть выполнены в соответствующей лаборатории, а образцы могут быть отправлены в ЯМР-установку для анализа.

По сравнению с другими методами, такими как масс-спектрометрия, маркировка аналитов не требуется, и она может быть выполнена без внутренних стандартов для количественной оценки. С другой стороны, чувствительность ЯМР несколько ниже, что в большинстве биологических случаев, хотя и не играет никакой роли, как аргинин и его метиловые производные, могут быть легко обнаружены во всех видах эукариотических клеток или тканей. Как упоминалось ранее, 3 миллионов клеток достаточно для количественной оценки связанного с белком ADMA - нескольких клеток, которые могут быть легко достигнуты с большинством клеточных линий. В случае медленно растущих, немодифицированных первичных клеток человеческого происхождения, таких как взрослые стволовые клетки40, клетки могут выращиваться в течение более длительного периода или объединяться из отдельных экспериментов. То же самое относится и к образцам тканей. ~30 мг ткани, соответствующей многим органам, например, мышей (частично или полностью, например, мелким мышцам) или образцу биопсии, достаточно для получения достаточного количества лизата и гидролизата белка для измерения ЯМР27. Другие методы измерения метилирования аргинина белка включают использование ферментно-связанных люминесцентных анализов41 или 3H-меченого S-аденозил-метионина (SAM)42. Чувствительность высока и может быть увеличена за счет использования 14C-маркированных SAM, но за счет увеличения затрат. Кроме того, использование радиоактивных веществ (в том числе жидкостей для сцинтилляционного подсчета) вызывает специальное обращение с отходами, которое не является необходимым с использованием действующего протокола.

Дополнительный метод к настоящему протоколу, использующий 2D гетероядерную ЯМР-спектроскопию, может выявить сайт-специфические паттерны метилирования в изолированных белках. Недавно он был опубликован, включая подробное описание обнаружения метиларгининов с помощью ЯМР-спектроскопии в целом43. Текущий протокол не предоставляет информацию о сайт-специфическом метилировании аргинина в белках. Тем не менее, глобальное метилирование изменяется на клеточном и физиологическом уровне, включая рост и дифференцировку клеток, старение, рак 1,2,12, сердечно-сосудистуюсистему 20 и нейродегенеративные заболевания 8,44. Подробности о точных механизмах до сих пор не полностью поняты, и возможные кандидаты на лекарства, препятствующие метилированию белка-аргинина11 как in vitro, так и in vivo, нуждаются в дальнейшем изучении1. Изучение кинетики метилирования (которое недавно показала наша группа)27 имеет важное значение для получения информации о модификации аргинина и механизмах распада белка. Глобальные измерения метилирования аргинина и кинетические эксперименты (образцы могут быть заморожены в любое время), начиная от отдельных белков и заканчивая образцами из целых организмов, могут быть выполнены с использованием этого протокола. Таким образом, он обеспечивает надежный метод, который может быть легко адаптирован для будущих исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Acknowledgments

Работа была поддержана грантами Австрийского научного фонда (FWF) P28854, I3792, doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (флагманский проект DYNIMO), грантами Австрийского агентства по содействию исследованиям (FFG) 864690 и 870454, Центром исследований интегративного метаболизма в Граце; Австрийская инфраструктурная программа 2016/2017, Правительство Штирии (Zukunftsfonds) и Фонд стартапов для талантов высокого уровня Фуцзяньского медицинского университета (XRCZX2021020). Мы благодарим Центр медицинских исследований за доступ к объектам клеточных культур. Ф.З. проходил обучение в рамках программы PhD «Молекулярная медицина» Медицинского университета Граца. Q.Z. проходил обучение в рамках программы PhD «Метаболические и сердечно-сосудистые заболевания», Медицинский университет Граца.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL tubes Greiner Bio One 188271
3-(trimethylsilyl) propionic acid-2,2,3,3-d4 sodium salt (TSP) Alfa Aesar A1448
5 mL tubes, round bottom Greiner Bio One 115101
Ammonia Solution 32% Roth A990.1
Bruker 600 MHz NMR spectrometer, equipped with a TXI probe head Bruker -
Centrifuge, refrigerated, e.g. 5430 R Eppendorf 5428000010
Chloroform ≥99% p.a. Roth 3313.1
Cryocool Thermo Scientific SCC1 heat transfer fluid for SpeedVac System
Deuterium Oxide (D2O) Cambridge Isotope Laboratories DLM-10-PK
Dimethyl sulfoxide-d6 (d6-DMSO) Cambridge Isotope Laboratories DLM-6-1000
Drying Chamber Binder 9090-0018
DURAN culture tubes, 13 x 100mm, GL 14, 9 mL VWR International 212-0375
Edwards Deep vacuum oil pump RV5 Thermo Scientific 16234611 part of the SpeedVac System
Eppendorf 1.5 mL tubes Greiner Bio One 616201
Gilson pipetting robot GX-241 Aspec Gilson Inc. 26150008
L-arginine AppliChem A3675
Methanol ≥99% Roth 8388.4
Milli-Q water aparatus Millipore ZIQ7000T0
Oasis MCX 1cc/30 mg, 1 mL cartridges Waters 186000252 https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/
Phosphate Buffered Saline (PBS) Lonza LONBE17-512F
Precellys 24 tissue homogenizer Bertin Instruments P000669-PR240-A https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/
Precellys tubes (pulping tubes) VWR International 432-0351
Precellyse 1.4 mm zirconium oxide beads VWR International 432-0356
Reacti-Therm/ReactiVap Heating, Stirring, and Evaporation Modules Thermo Scientific TS-18820 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820
Rotor for 1.5 mL tubes, FA-45-30-11 Eppendorf 5427753001
Savant Refrigerated Cooling Trap Thermo Scientific 15996161 part of the SpeedVac System
Savant SpeedVac vacuum concentrator SPD210 Thermo Scientific 15906181 part of the SpeedVac System; equipped with rotor for 1.5 ml tubes
Screw caps for glas vials with PTFE sealing, DN9 Dr. R. Forche Chromatographie CT11B3011
Seasand Roth 8441.3
Short thread glas vials 1.5 mL, ND9 Dr. R. Forche Chromatographie VT1100309
Sodium azide (NaN3) Roth K305.1
Sodium hydroxide (NaOH) VWR BDH7363-4
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) VWR 80731-078
TopSpin 4.0 (Software) Bruker - https://www.bruker.com
ω-NG-asymmetric dimethylarginine (ADMA) Santa Cruz Biotechnology sc-208093
ω-NG-monomethylarginine (MMA) Santa Cruz Biotechnology sc-200739A
ω-NG-NG'-symmetric dimethylarginine (SDMA) Santa Cruz Biotechnology sc-202235A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guccione, E., Richard, S. The regulation, functions and clinical relevance of arginine methylation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).
  2. Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
  3. Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 271 (25), 15034-15044 (1996).
  4. Bachand, F. Protein arginine methyltransferases: from unicellular eukaryotes to humans. Eukaryotic Cell. 6 (6), 889-898 (2007).
  5. Wang, Y. C., Li, C. Evolutionarily conserved protein arginine methyltransferases in non-mammalian animal systems. FEBS Journal. 279 (6), 932-945 (2012).
  6. Ahmad, A., Cao, X. Plant PRMTs broaden the scope of arginine methylation. Journal of Genetics and Genomics. 39 (5), 195-208 (2012).
  7. Fisk, J. C., Read, L. K. Protein arginine methylation in parasitic protozoa. Eukaryotic Cell. 10 (8), 1013-1022 (2011).
  8. Hofweber, M., et al. Phase Separation of FUS Is Suppressed by Its Nuclear Import Receptor and Arginine Methylation. Cell. 173 (3), 706-719 (2018).
  9. Chong, P. A., Vernon, R. M., Forman-Kay, J. D. RGG/RG Motif Regions in RNA Binding and Phase Separation. Journal of Molecular Biology. 430 (23), 4650-4665 (2018).
  10. Nott, T. J., et al. Phase transition of a disordered nuage protein generates environmentally responsive membraneless organelles. Molecular Cell. 57 (5), 936-947 (2015).
  11. Fong, J. Y., et al. Therapeutic targeting of RNA splicing catalysis through inhibition of protein arginine methylation. Cancer Cell. 36 (2), 194-209 (2019).
  12. Yang, Y., Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).
  13. Wang, S. M., Dowhan, D. H., Muscat, G. E. O. Epigenetic arginine methylation in breast cancer: emerging therapeutic strategies. Journal of Molecular Endocrinology. 62 (3), 223-237 (2019).
  14. Gulla, A., et al. Protein arginine methyltransferase 5 has prognostic relevance and is a druggable target in multiple myeloma. Leukemia. 32 (4), 996-1002 (2018).
  15. Wang, Z., Tang, W. H., Cho, L., Brennan, D. M., Hazen, S. L. Targeted metabolomic evaluation of arginine methylation and cardiovascular risks: potential mechanisms beyond nitric oxide synthase inhibition. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (9), 1383-1391 (2009).
  16. Friesen, W. J., Massenet, S., Paushkin, S., Wyce, A., Dreyfuss, G. SMN, the product of the spinal muscular atrophy gene, binds preferentially to dimethylarginine-containing protein targets. Molecular Cell. 7 (5), 1111-1117 (2001).
  17. Lee, J. H., Park, G. H., Lee, Y. K., Park, J. H. Changes in the arginine methylation of organ proteins during the development of diabetes mellitus. Diabetes Research and Clinical Practice. 94 (1), 111-118 (2011).
  18. Bulau, P., et al. Analysis of methylarginine metabolism in the cardiovascular system identifies the lung as a major source of ADMA. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 292 (1), 18-24 (2007).
  19. Zakrzewicz, D., Eickelberg, O. From arginine methylation to ADMA: a novel mechanism with therapeutic potential in chronic lung diseases. BMC Pulmonary Medicine. 9, 5 (2009).
  20. Fulton, M. D., Brown, T., Zheng, Y. G. The biological axis of protein arginine methylation and asymmetric dimethylarginine. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), (2019).
  21. Aliferis, K. A., Chrysayi-Tokousbalides, M. Metabolomics in pesticide research and development: review and future perspectives. Metabolomics. 7 (1), 35-53 (2011).
  22. Chiang, K., et al. PRMT5 Is a Critical Regulator of Breast Cancer Stem Cell Function via Histone Methylation and FOXP1 Expression. Cell Reports. 21 (12), 3498-3513 (2017).
  23. Blanc, R. S., Vogel, G., Chen, T., Crist, C., Richard, S. PRMT7 preserves satellite cell regenerative capacity. Cell Reports. 14 (6), 1528-1539 (2016).
  24. Lim, Y., Lee, E., Lee, J., Oh, S., Kim, S. Down-regulation of asymmetric arginine methylation during replicative and H2O2-induced premature senescence in WI-38 human diploid fibroblasts. Journal of Biochemistry. 144 (4), 523-529 (2008).
  25. Bhatter, N., et al. Arginine methylation augments Sbp1 function in translation repression and decapping. FEBS Journal. 286 (23), 4693-4708 (2019).
  26. Lee, Y. H., Stallcup, M. R. Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation. Molecular Endocrinology. 23 (4), 425-433 (2009).
  27. Zhang, F., et al. Global analysis of protein arginine methylation. Cell Reports Methods. 1 (2), (2021).
  28. Zinellu, A., Sotgia, S., Scanu, B., Deiana, L., Carru, C. Determination of protein-incorporated methylated arginine reference values in healthy subjects whole blood and evaluation of factors affecting protein methylation. Clinical Biochemistry. 41 (14-15), 1218-1223 (2008).
  29. Weiss, M., Manneberg, M., Juranville, J. F., Lahm, H. W., Fountoulakis, M. Effect of the hydrolysis method on the determination of the amino acid composition of proteins. Journal of Chromatography A. 795 (2), 263-275 (1998).
  30. Davids, M., et al. Simultaneous determination of asymmetric and symmetric dimethylarginine, L-monomethylarginine, L-arginine, and L-homoarginine in biological samples using stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 900, 38-47 (2012).
  31. Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
  32. Vignoli, A., et al. High-throughput metabolomics by 1D NMR. Angewandte Chemie International Edition. 58 (4), 968-994 (2019).
  33. Carr, H. Y., Purcell, E. M. Effects of diffusion on free precession in nuclear magnetic resonance experiments. Physical Review. 94 (3), 630-638 (1954).
  34. Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation times. Review of Scientific Instruments. 29 (8), 688-691 (1958).
  35. Nagayama, K., Wuthrich, K., Bachmann, P., Ernst, R. R. Two-dimensional J-resolved 1H n.m.r. spectroscopy for studies of biological macromolecules. Biochemical and Biophysical Research Communications. 78 (1), 99-105 (1977).
  36. Stryeck, S., et al. Serum concentrations of Citrate, Tyrosine, 2- and 3- Hydroxybutyrate are associated with increased 3-month mortality in acute heart failure patients. Scientific Reports. 9 (1), 6743 (2019).
  37. Zhang, F., et al. Tissue-specific landscape of metabolic dysregulation during ageing. Biomolecules. 11 (2), (2021).
  38. Zhang, F., et al. Growing human hepatocellular tumors undergo a global metabolic reprogramming. Cancers. 13 (8), (2021).
  39. Pahlich, S., Zakaryan, R. P., Gehring, H. Protein arginine methylation: Cellular functions and methods of analysis. Biochimica et Biophysica Acta. 1764 (12), 1890-1903 (2006).
  40. Habisch, H. J., et al. Neuroectodermally converted human mesenchymal stromal cells provide cytoprotective effects on neural stem cells and inhibit their glial differentiation. Cytotherapy. 12 (4), 491-504 (2010).
  41. Ibanez, G., McBean, J. L., Astudillo, Y. M., Luo, M. An enzyme-coupled ultrasensitive luminescence assay for protein methyltransferases. Analytical Biochemistry. 401 (2), 203-210 (2010).
  42. Hevel, J. M., Price, O. M. Rapid and direct measurement of methyltransferase activity in about 30min. Methods. 175, 3-9 (2020).
  43. Altincekic, N., et al. Site-specific detection of arginine methylation in highly repetitive protein motifs of low sequence complexity by NMR. Journal of the American Chemical Society. 142 (16), 7647-7654 (2020).
  44. Kaneb, H. M., Dion, P. A., Rouleau, G. A. The FUS about arginine methylation in ALS and FTLD. The EMBO Journal. 31 (22), 4249-4251 (2012).

Tags

Исследование рака выпуск 178
Исследование метилома аргинина с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q.,… More

Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. Exploring the Arginine Methylome by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. J. Vis. Exp. (178), e63245, doi:10.3791/63245 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter