Summary
Bu çalışmada, yaşa bağlı böbrek yetmezliği olan farelerin böbrek ve serumundaki mikroRNA ekspresyonunu kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu ile değerlendirmek için bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
MikroRNA'lar (miRNA'lar) 21-25 bazdan oluşan küçük, kodlamayan RNA'lardır. Proteinlere çevrilmezler, bunun yerine hedef mesajcı RNA'larının (mRNA'lar) işleyişini, onları istikrarsızlaştırarak ve çevirilerini bozarak engellemeye çalışırlar. Çeşitli fare organ ve dokularındaki miRNA ekspresyon profilleri araştırılmış olmasına rağmen, fare böbreği ve serum miRNA'larının saflaştırılması ve nicelleştirilmesi için standart bir yöntem bulunmamaktadır. Yaşa bağlı böbrek yetmezliği olan farelerin serum ve böbreğindeki miRNA ekspresyonunun çıkarılması ve değerlendirilmesi için etkili ve güvenilir bir yöntem oluşturduk.
Yöntem, kantitatif ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) kullanır ve protokol altı adım gerektirir: (1) yaşlanma hızlandırılmış fare direnci 1 (SAMR1) fareleri ve yaşlanma hızlandırmalı fare eğilimli (SAMP1) fareleri hazırlamak; (2) bu farelerden serum örneklerinin çıkarılması; (3) her fareden bir böbrek örneği çıkarmak; (4) böbrekten toplam RNA'nın (miRNA dahil) çıkarılması ve her fareden serum örnekleri; (5) miRNA'dan ters transkripsiyon ile tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezi; (6) elde edilen cDNA'yı kullanarak bir qRT-PCR gerçekleştirmek.
Bu protokol, kontrollerle karşılaştırıldığında, yaşa bağlı böbrek yetmezliğinin bir fare modelinin böbrek ve serumunda miRNA-7218-5p ve miRNA-7219-5p ekspresyonunun önemli ölçüde değiştiğini doğrulamak için kullanıldı. Bu protokol aynı zamanda yaşa bağlı böbrek yetmezliğinin fare modelinin böbrek ve serumu arasındaki ilişkiyi de açıklığa kavuşturdu. Bu protokol, yaşa bağlı böbrek yetmezliği olan farelerin böbrek ve serumundaki miRNA ekspresyonunu belirlemek için kullanılabilir.
Introduction
Hem fizyolojide hem de hastalıkta (örneğin, inflamasyon, fibroz, metabolik bozukluklar ve kanser) önemli rol oynayan çeşitli mRNA'ların ekspresyonunun, bozulmaya neden olan ve mRNA1'in transkripsiyonunu engelleyen kısa, kodlamayan RNA'lar olan miRNA'lar tarafından düzenlendiği bilinmektedir. Bu nedenle, bazı miRNA'ların çeşitli hastalıklar için yeni aday biyobelirteçler ve / veya terapötik hedefler olarak hizmet edebilmesi mümkündür 2,3,4,5. Çeşitli fare organlarında ve dokularında (beyin6, kalp7, akciğer8, karaciğer9 ve böbrek10 dahil) miRNA ekspresyon profilleri üzerinde araştırmalar yapılmıştır. Bununla birlikte, yaşa bağlı böbrek yetmezliği olan farelerin böbreklerindeki veya serumundaki miRNA'ların çıkarılması ve değerlendirilmesi için standart veya belirlenmiş bir yöntem yoktur.
Bu nedenle, yaşa bağlı böbrek yetmezliği olan farelerin serum ve böbreğindeki miRNA ekspresyonunu güvenilir bir şekilde saflaştırmak ve tespit etmek için kullanılabilecek bir protokol oluşturduk. Protokolde altı ana adım vardır: (1) hem 50 haftalık SAMR1 erkek farelerin hem de SAMP1 erkek farelerin hazırlanması; (2) Her iki fare suşunun inferior vena kavasından kan örneklerinin çıkarılması, daha sonra bir serum örneği elde etmek için heparin içeren bir spitz tüpünün kullanılması, ardından santrifüjleme; (3) farelerden böbrek numunesi ekstraksiyonu-bir silikon homojenizatör, böbrek örneğini ayrı ayrı homojenize etmek için kullanılır ve numune daha sonra bir mikrosantrifüj spin sütunu11 üzerindeki bir biyopolimer parçalama sistemine aktarılır; (4) silika membran bazlı spin kolon12 kullanılarak serum örneklerinden toplam RNA (miRNA içeren) ekstraksiyonu ve silika membran bazlı spin kolon11 kullanılarak böbrek örneklerinden miRNA ekstraksiyonu içeren toplam RNA; (5) ters transkriptaz, poli(A) polimeraz ve oligo-dT primer13,14 kullanılarak toplam RNA'dan tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezi; ve (6) son olarak, qRT-PCR ve ara hesaplanan bir boya13,14 kullanılarak miRNA ekspresyonunun belirlenmesi.
Bu yeni protokol, çeşitli doku tiplerinde miRNA'ların çıkarılmasında ve değerlendirilmesinde başarılı olan çalışmalara dayanıyordu11,12,13. Protokolün biyopolimer parçalama sisteminin, dokulardan yüksek kaliteli toplam RNA'yı saflaştırabildiği gösterilmiştir11. Bu protokolün qRT-PCR ile intercalating boya ile miRNA ekspresyonunun değerlendirilmesi için kullanılan yönlerinin doğruluğu ve duyarlılığı, örneğin ekstrakte edilen toplam RNA'dan ters transkriptaz, poli (A) polimeraz ve oligo-dT primerleri ile cDNA sentezi 13,14 olarak belirlenmiştir. Yeni protokolün birçok avantajı var: basitlik, zaman tasarrufu ve azaltılmış teknik hatalar. Bu nedenle, böbrek ve serum miRNA profillerinin doğru ve hassas bir şekilde tanımlanmasını gerektiren araştırmalar için kullanılabilir. Birçok patolojik durumun incelenmesi de yeni protokolü kullanabilir.
Yaşa bağlı böbrek yetmezliğinin bir modeli olan SAMP1 farelerdeki miRNA ekspresyon profilleri aşağıda gösterildiği gibi belirlenebilir. İnsanlarda, yaşa bağlı böbrek yetmezliği böbrek yetmezliğinin ilerlemesi ile ilişkilidir ve hem renal interstisyel fibroz alanında bir artış hem de glomerülosklerozun ilerlemesi ile karakterizedir15,16. Yaşa bağlı böbrek yetmezliği kronik böbrek hastalığı ve son dönem böbrek hastalığının da önemli ve sık görülen bir özelliğidir15,16.
Protocol
Deneysel protokol, Jichi Tıp Üniversitesi Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylanmış ve Jichi Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Kılavuzu ve deney hayvanlarının kullanımı ve bakımı ile ilgili kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu protokol dört adet 50 haftalık SAMR1 erkek fare ve SAMP1 erkek fare (40-45 g) kullanır.
1. Serum numune toplama
- Her fare için aşağıdakileri hazırlayın: 1,0 mL şırıngalı 30 G iğne, heparinli 1,0 mL spitz santrifüj tüpü, 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri, izofluran anestezik, mantar tabakası, %70 etanol, fosfat tamponlu salin (PBS) ile nemlendirilmiş iki pamuklu çubuk, PBS'li bir Petri kabı, cımbız ve cerrahi makas.
- Fareyi% 1.5 izofluran ile anestezi altına alın ve% 1.5'te tutun. Bir analjezik (Meloksikam 5 mg / kg) deri altından uygulayın, daha sonra karnına 1.0 mL% 70 etanol enjekte edin ve mantar tabakası üzerinde sırtüstü pozisyona yerleştirin.
- Pedal çekilme refleksinin kaybolmasıyla anestezi derinliğini onaylayın. Cımbız ve cerrahi makas ile karın derisini kesin. Kasları ve periton zarını mesaneden kaburgaların sol alt kenarına kadar kesin.
- Periton zarını kaldırmak için cımbızı kullanın ve cerrahi makasla periton zarının üst kenarında yanal bir kesi yapın. Kaburgaların en alt kenarı boyunca insizyona devam edin.
- İki PBS nemlendirilmiş pamuklu çubuk kullanarak inferior vena kavayı tanımlayın. 1.0 mL şırınga ile 30 G iğnelerden birini inferior vena kavaya yerleştirin ve ardından şırıngayı çekin. Hemolizi önlemek için iğneyi inferior vena kavadan yavaşça çekin. Kanı heparin ile 1.0 mL spitz tüpüne aktarın ve daha sonra tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın.
NOT: Fare servikal çıkık ile ötenazi yapılır. - Spitz tüpünü oda sıcaklığında (RT), 10 dakika boyunca 3.000 × g döndürün.
- Süpernatantı yavaşça aspire edin, tortu içermediğinden emin olun ve ardından kullanılmayan 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Kullanmadan önce tüpü -80 ° C'de saklayın.
NOT: Hemen Adım 3'e geçerseniz, tüpün -80 ° C'de saklanmasına gerek yoktur.
2. Böbrek örneği toplama
- Her fare için aşağıdakileri hazırlayın: 2.0 mL kriyotüpler, izofluran anestezik, mantar tabakası,% 70 etanol, PBS'li bir Petri kabı, cımbız ve cerrahi makas.
- Fareyi% 1.5 izofluran ile anestezi altına alın ve% 1.5'te tutun. Bir analjezik (Meloksikam 5 mg / kg) deri altından uygulayın, daha sonra karnına 1.0 mL% 70 etanol enjekte edin ve mantar tabakası üzerinde sırtüstü pozisyona yerleştirin.
- Pedal çekilme refleksinin kaybolmasıyla anestezi derinliğini onaylayın. Karın derisinde bir kesi yapmak için cımbız ve cerrahi makas kullanın. Kasları ve periton zarını mesaneden kaburgaların sol alt kenarına kadar kesin.
- Periton zarını kaldırmak için cımbızı kullanın ve cerrahi makasla periton zarının üst kenarında yanal bir kesi yapın. Kaburgaların en alt kenarı boyunca insizyona devam edin.
- Sol böbreği tanımlayın. Böbrek sarımsı-beyaz bir renge dönene kadar kanı damarlardan temizlemek için PBS ile reflü. Sol renal arteri ve damarı koparmak için önce cerrahi makas kullanarak tüm böbreği tüketin. Böbreği bir Petri kabına yerleştirin ve PBS ile dikkatlice yıkayın.
NOT: Fare servikal çıkık ile ötenazi yapılır. - Böbreği 10 mg'lık örneklere kesmek için cımbızları ve cerrahi makası kullanın (10 mg, bir sonraki adım için uygun bir örneklem boyutudur). Böbreğin her bir örneğini kendi 2.0 mL kriyotüpüne yerleştirin. Tüpün kapağını kapatın.
- Uzun süreli depolama için, her kriyotüpü sıvı nitrojene aktarın ve -80 ° C'de saklayın.
3. Bir serum örneğinden toplam RNA ekstraksiyonu
- Önce aşağıdaki maddeleri hazırlayın: bir vorteks karıştırıcı, fenol/guanidin bazlı lizis reaktifi,% 80 etanol,% 100 etanol,% 100 kloroform, biyopolimer spin kolonları (2.0 mL toplama tüplerinde11), membran ankrajlı spin kolonları (2.0 mL toplama tüplerinde11), yıkama tamponu #1 (yani, 1: 2 oranında guanidin ve% 100 etanol içeren yıkama tamponu), yıkama tamponu #2 (yani, 1:4 oranında guanidin ve% 100 etanol içeren yıkama tamponu), RNaz içermeyen su, 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve 2.0 mL mikrosantrifüj tüpleri.
- İlk olarak, 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 200 μL'lik bir serum örneği alın ve ardından fenol / guanidin bazlı lizis reaktifinin 1.000 μL'sini ekleyin. Karışımı 5 s için vorteks.
- Numuneyi RT'de 5 dakika boyunca inkübe edin.
- Tüpteki serum örneğine 200 μL kloroform ekleyin ve tüp kapağını sıkıca kapatın. Kloroform ve serum örneğini karıştırmak için tüpü 15x ters çevirin.
- Her numune RT'de 3 dakika boyunca inkübe edilir. Ardından, numuneyi 4 ° C'de 12.000 x g'de 15 dakika boyunca döndürün.
- 300 μL süpernatantı peleti rahatsız etmeden yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 450 μL% 100 etanol ekleyin ve tüpü 5 s boyunca vorteksleyin.
NOT: Aşağıdaki tüm adımlarda, RNA ve DNA'nın ayrılması için membranla ankrajlı spin kolonunu santrifüj etmek için 2,0 mL'lik bir toplama tüpüne yerleştirin. - Ardından, numunenin 700 μL'sini çıkarın, membranla ankrajlı bir sıkma kolonuna yükleyin ve kapağı kapatın. RT'deki sütunu 8.000 × g'de 15 sn döndürün ve süpernatantı sütunda bırakın. Toplama tüpünde kalan peleti atın.
- Serum/plazma kitinin bir parçası olan 700 μL yıkama tamponu #1'i membrana tutturulmuş spin kolonuna ekleyerek numuneyi iyice temizleyin. Sütun kapağını kapatın ve RT'deki sütunu 8.000 × g'de 15 sn döndürün ve süpernatantı sütunda bırakın. Toplama tüpünde kalan peleti atın.
- İz tuzların uzaklaştırılması için, 500 μL yıkama tamponu #2 alın ve membranla ankrajlı bir sıkma kolonuna yükleyin. Sütun kapağını kapattıktan sonra, RT'deki sütunu 8.000 × g'de 15 sn döndürün ve süpernatantı sütunda bırakın. Peleti toplama tüpüne atın.
- İz tuzların uzaklaştırılması için, 500 μL% 80 etanol alın ve membranla ankrajlı bir spin kolonuna yükleyin. Sütun kapağını kapattıktan sonra, RT'deki sütunu 8.000 × g'de 15 sn döndürün ve süpernatantı sütunda bırakın. Peleti toplama tüpüne atın.
- Membranla ankrajlı spin kolonunu RT'de 15.000 × g'da 5 dakika boyunca tekrar döndürün.
- Membranla ankrajlı spin kolonunu yeni bir 1,5 mL toplama tüpüne aktardıktan sonra, toplam RNA'yı çözmek için kolona 14 μL RNaz içermeyen su ekleyin. Sütun kapağını kapattıktan sonra, tüp RT'de bırakılarak 5 dakika bekleyin. sütunu RT'de 15.000 × g'de 1 dakika boyunca tekrar döndürün.
- Tüpleri kullanmadan önce numunelerle -80 ° C'de saklayın.
4. Bir böbrek örneğinden toplam RNA'nın ekstraksiyonu
- Önce aşağıdaki maddeleri hazırlayın: bir silikon homojenizatör, buz, bir vorteks karıştırıcı,% 100 etanol,% 100 kloroform, biyopolimer spin kolonları (2.0 mL toplama tüplerinde11), membran ankrajlı spin kolonları (2.0 mL toplama tüplerinde11), fenol / guanidin bazlı lizis reaktifi, yıkama tamponu #1 (Adım 3.1 ile aynı tampon), yıkama tamponu #2 (Adım 3.1 ile aynı tampon), RNaz içermeyen su, 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve 2,0 mL mikrosantrifüj tüpleri.
- Silikon homojenizatöre 10 mg'lık bir böbrek örneği yerleştirin ve 700 μL fenol / guanidin bazlı lizis reaktifi ekleyin.
- Homojenizatörü kurun. Numuneyi homojenize etmek için homojenizatörün havanesini böbrek örneğine hafifçe bastırın ve bükün. Böbrek örneği fenol / guanidin bazlı lizis reaktifinde tamamen homojenize olana kadar havaneyi bastırmaya ve bükmeye devam edin.
- Daha fazla homojenizasyon için, homojenize lizatı (2.0 mL'lik bir toplama tüpünde) alın ve bir biyopolimer spin kolonuna aktarın.
- RT'deki homojenize lizatı 14.000 × g'da 3 dakika boyunca santrifüj edin ve daha sonra çökeltilmiş peleti ters çevirmek için tüm çökeltilmiş peleti kullanılmayan 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın
- Peleti tüp içinde 140 μL kloroform ile karıştırın; Ardından, tüp kapağını sıkıca kapatın. Lisat ve kloroformu karıştırmak için tüpü 15x ters çevirin.
NOT: Kloroform, başlık olmadan güvenle kullanılabilir. - Numuneyi RT'de 2-3 dakika boyunca inkübe edin. Numuneyi 4 ° C'de 12.000 × g'da 15 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Süpernatantı (genellikle ~ 300 μL) çökeltiyi bozmadan yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. % 100 etanolün hacminin 1,5 katını (genellikle ~ 450 μL) ekleyin. Karışımı 5 s için vorteks.
NOT: Aşağıdaki adımların hepsinde, RNA ve DNA'yı ayırmak için membrana implante spin kolonunu santrifüj etmek için 2,0 mL'lik bir toplama tüpüne yerleştirin. - 700 μL numuneyi membran ankrajlı spin kolonlarından birine yükleyin. Kapağı kapatın ve sütunu 15 s için 15.000 × g'de santrifüj yapın. Toplama tüpünde kalan çökelmiş lizatı atın.
- İyice yıkamak için sıkma kolonuna 700 μL yıkama tamponu #1 ekleyin. Kapağı kapatın ve sütunu 15 s için 15.000 × g'de santrifüj yapın. Toplama tüpünde kalan çökelmiş lizatı atın.
- Eser miktarda tuzun uzaklaştırılması için, membrana implante edilmiş sıkma kolonuna 500 μL yıkama tamponu #2 yükleyin. Sütun kapağını kapattıktan sonra, sütunu 15 s için 15.000 × g'de santrifüj yapın. Çökeltilmiş lizatı toplama tüpüne atın.
- Adım 4.11'i tekrarlayın.
- Membranla ankrajlı spin kolonunu 15.000 × g'da 1 dakika boyunca tekrar santrifüj yapın. Çökeltilmiş lizatı toplama tüpüne atın.
- Membranla ankrajlı spin kolonunu alın ve yeni bir 1,5 mL toplama tüpüne aktarın. Toplam RNA'yı çözmek için kolona 30 μL RNaz içermeyen su ekleyin. Kolonun kapağını kapattıktan sonra, RT'deki tüp ile 5 dakika bekleyin ve ardından sütunu 15.000 × g'de 1 dakika boyunca santrifüj edin.
- Toplam RNA içeren numunenin toplam hacmini yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpü buzun üzerine yerleştirin ve spektrofotometri ile toplam RNA konsantrasyonunu ölçün. Toplam RNA konsantrasyonunun ~ 300-1.500 ng / μL olduğundan emin olun.
- Numune içeren tüpleri kullanmadan önce -80 °C'de saklayın.
5. Serumda total RNA'nın ters transkripsiyonu ile cDNA sentezi
NOT: Kantitatif gerçek zamanlı PCR deneyleri (MIQE) kılavuzlarının yayınlanması için asgari bilgi, güvenilir, kesin sonuçlar elde etmek için daha iyi deneysel uygulamaların kullanılmasını önermektedir17. Bu protokolde, cDNA, ters transkriptaz, poli (A) polimeraz ve oligo-dT primerleri kullanılarak iki aşamalı bir prosedürde saflaştırılan toplam RNA'dan sentezlenir.
- Önce aşağıdakileri hazırlayın: bir vorteks karıştırıcı, bir termal döngüleyici, sekiz delikli şerit tüpler, her sekiz şeritli tüpün kapağı, damıtılmış su, buz, ters transkriptaz kiti (Malzeme Tablosuna bakınız)13,14 erimiş durumda ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri.
- Termal döngüleyiciyi başlatın.
- Ana karışım çözeltisini hazırlayın; sekiz delikli şerit tüp başına toplam 8.0 μL ana karışım elde etmek için, 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 4.0 μL ters transkripsiyon tamponuna 2.0 μL ters transkriptaz karışımı (kit içinde dahil) ve 2.0 μL 10x nükleik asit karışımı ekleyin.
- Ana karışım çözeltisinin 8.0 μL'sini sekiz delikli bir şerit tüpün her bir tüpüne yerleştirin.
- Sekiz delikli şerit tüpün her tüpüne 12 μL'lik bir toplam RNA alikotu yerleştirin ve tüpün kapağını kapatın. Tüpü RT'de 15 sn ve 2.000 × g için santrifüj yapın.
- Tüpü termal döngüye yerleştirin ve 37 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe edin. cDNA'yı sentezlemek için numuneyi 95 °C dakikada 5 dakika daha inkübe edin.
- Kuluçkayı takiben, cDNA'yı yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. cDNA'yı on kat (1:10) damıtılmış suyla seyreltin. Vorteks ve tüpü RT'de 5 s ve 2.000 × g için santrifüj yapın.
- Seyreltilmiş cDNA'yı geçici olarak buz üzerinde saklayın. Seyreltilmiş numuneleri kullanmadan önce -80 ° C'de saklayın.
6. Böbrekte toplam RNA'nın ters transkripsiyonu ile cDNA sentezi
NOT: MIQE kılavuzları, güvenilir ve kesin sonuçlar elde etmek için daha iyi deneysel uygulamaları teşvik etmektedir17. Bu protokol, iki aşamalı bir prosedürde 1.0 μg saflaştırılmış toplam RNA'dan cDNA'yı sentezlemek için ters transkriptaz, poli (A) polimeraz ve oligo dT primerlerini kullanır.
- İlk olarak, aşağıdakileri hazırlayın: bir vorteks karıştırıcı, bir termal döngüleyici, 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri, sekiz kuyucuklu şerit tüpler, her sekiz şeritli tüpün kapağı, damıtılmış su, buz ve bir ters transkriptaz kiti (bkz.
- Termal döngüleyiciyi başlatın.
- Ana karışım çözeltisini hazırlayın; tüp başına toplam 8.0 μL ana karışım çözeltisi elde etmek için, kitte bulunan ters transkriptaz karışımının 2.0 μL'sini ve ters transkripsiyon tamponunun 4.0 μL'sine 2.0 μL 10x nükleik asit karışımı ekleyin.
- Sekiz delikli bir şerit tüpün her bir tüpüne 8,0 μL ana karışım çözeltisi ekleyin.
- Toplam RNA yoğunluğunu aşağıdaki gibi ayarlayın. 1.0 μg toplam RNA'nın 12 μL RNaz içermeyen su ile bir böbrek örneğinden ayrılması için, uygun miktarda toplam RNA alın ve yukarıda tarif edildiği gibi ölçülen konsantrasyonu kullanarak damıtılmış suya aktarın (Adım 4.15'te).
NOT: DNA kontaminasyonu varlığında, kontamine DNA qRT-PCR ile birlikte güçlendirilir. - Yukarıda Adım 5.5.-5.8'de açıklananlarla aynı işlemi gerçekleştirin.
7. miRNA'nın qRT-PCR'si
NOT: miRNA'ların qRT-PCR'si için bir interkalatör yöntemi kullanılır. Astarlar RNA için kullanılır: U6 küçük nükleer 2 (RNU6-2), miRNA-223-3p, miRNA-423-5p, miRNA-7218-5p ve miRNA-7219-5p.
- Aşağıdakileri hazırlayın: bir vorteks karıştırıcı, gerçek zamanlı bir PCR sistemi, qRT-PCR için 96 delikli bir reaksiyon plakası, 96 delikli reaksiyon plakası için yapışkan film, yapışkan film aplikatörü, 96 delikli bir santrifüj rotoru, miRNA'ya özgü primerler, 2x PCR ana karışımı ve 10x üniversal astar içeren yeşil boya bazlı bir PCR kiti (bkz. Malzeme Tablosu)13,14, ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü.
- Vorteks, 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde karıştırdıktan sonra aşağıdakileri yapın: 6.25 μL damıtılmış su, nükleaz içermeyen suda çözünmüş 5 μM miRNA astarının her biri 1.25 μL, 12.5 μL 2x PCR ana karışımı ve 2.5 μL 10x üniversal astar.
- Adım 5 (serum) veya Adım 6'da (böbrek) tanımlandığı gibi sentezlenen cDNA'yı hazırlayın ve eritin. Vorteks ve cDNA'yı 5 s için santrifüj edin.
- Reaktifin 22.5 μL alikotlarını alın (yukarıdaki Adım 7.2'de açıklandığı gibi) ve bunları 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna ayrı ayrı yerleştirin.
- Plakanın her bir kuyucuğuna 2.5 μL aliquot cDNA ekleyin.
- Yapışkan filmi plakaya sabitlemek için, yapışkan film aplikatörünü kullanın. Plakayı 96 delikli santrifüj rotorunda 1.000 x g'de 30 sn santrifüj yapın. Her bir kuyucuğun altındaki reaksiyonu stabilize edin.
8. PCR bisiklet programını çalıştırmak için gerçek zamanlı PCR sistemini ve yazılımını kullanma
- Gerçek zamanlı PCR sistemine başlayın. Oluşturulan plakayı Adım 7.6'da açıklandığı gibi yerleştirin. gerçek zamanlı PCR sisteminde. Ayarları değiştirin; deneme için bir ad sağlayın ve ardından sistemin deneme türü olarak 96 kuyucuklu (0,2 mL ), niceleme yöntemi olarak Karşılaştırmalı CT (ΔΔCT), sistem çalıştırma modu olarak standart ve hedef sırayı algılamak için reaktifler olarak SYBR Yeşil Reaktifleri'ni seçin.
- Numune ve hedef miRNA'lar için isimler sağlayın ve her bir kuyucuktaki numuneyi ve hedef miRNA'yı adlandırın. Sonuçları doğrulamak için uygun veriler elde etmek için yinelenen numuneler atayın ve bir referans numune ve endojen kontrol seçin. Boyanın pasif başvuru olarak kullanılması için hiçbiri'ni seçin. Reaktif çapraz kontaminasyonunu ortadan kaldırmak için, negatif ters transkriptaz ve miRNA ekspresyonu için şablon olmayan bir kontrol ayarlayın.
- Daha sonra, reaksiyon hacminin 20 μL'ye ayarlandığından ve PCR döngü koşullarının aşağıdaki gibi ayarlandığından emin olun: 15 dakika boyunca 95 ° C, daha sonra 15 s için 94 ° C'de 40 döngü denatürasyon, 30 s için 55 ° C'de tavlama ve son olarak 30 s için 70 ° C'de uzatma.
- İşlem tamamlandıktan sonra qRT-PCR verilerini analiz etmek için sistemin yazılım programında analiz et'e tıklayın. Program tarafından otomatik olarak seçilen eşik çizgisinin her kuyu için uygun olduğunu onaylayın.
- Endojen kontrolün eşik döngüsü (BT) değerini kontrol edin ve her numunede analiz edilen hedef miRNA'ları kontrol edin. CT değerlerini, amplifikasyon eğrisinin ve eşik çizgisinin kesişimine göre belirleyin.
NOT: Bu çalışmada, hedef miRNA ekspresyon düzeyleri için endojen kontroller olarak RNU6-2 ve miRNA-423-5p kullanılmış ve her bir hedef miRNA18'in bağıl ekspresyon düzeylerini belirlemek için ΔΔCT yöntemi kullanılmıştır.
Representative Results
Yaşa bağlı böbrek yetmezliği fare modeli için, 40-45 g ağırlığındaki 50 haftalık SAMP1 erkek fareleri kullandık. fare başına yaklaşık 0.8 mL kan toplandı ve heparinli, ters çevrilmiş ve santrifüj edilmiş 1.0 mL'lik bir spitz tüpüne aktarıldı. Her böbrek PBS ile durulandı, diseke edildi ve daha fazla analiz için sıvı azotta saklandı. Elli haftalık SAMR1 fareleri kontrol görevi gördü. Bu yaşa bağlı böbrek yetmezliği modeli kullanılarak elde edilen miRNA qRT-PCR verilerine dayanarak, SAMP1 farelerinde kontrollere kıyasla miRNA-7219-5p'nin böbrek seviyesinin anlamlı olarak arttığını ve miRNA-7218-5p'nin böbrek seviyesinin önemli ölçüde azaldığını gözlemledik (Şekil 1). Hem miRNA-7219-5p hem de miRNA-7218-5p'nin serum düzeyleri, SAMP1 farelerinde kontrollere kıyasla önemli ölçüde artmıştır (Şekil 2). MiRNA-223-3p'nin ekspresyon seviyeleri her iki suşta ve böbrek ile serum arasında değişmedi (Şekil 1 ve Şekil 2).
Şekil 1: SAMP1 farelerinin böbreklerinde diferansiyel olarak eksprese edilen mikroRNA'lar . SAMR1 farelerde (kontrol, n = 4) ve SAMP1 farelerinde (n = 4) miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p ve miRNA-7219-5p ekspresyonunun qRT-PCR analizi. Veriler standart hata ± ortalamadır (hata çubukları); gruplar arası farklılıkları analiz etmek için t-testleri kullanıldı; p < 0.05 anlamlı olarak kabul edildi (*p < 0.05), n.s.: anlamlı değil. Kısaltmalar: miRNA = mikroRNA; SAMP1 = yaşlanma hızlandırmalı fare eğilimli; SAMR1 = yaşlanma hızlandırmalı fare direnci 1; qRT-PCR = kantitatif ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: SAMP1 farelerin serumunda diferansiyel olarak eksprese edilen miRNA'lar . SAMR1 farelerinde (kontrol, n = 4) ve SAMP1 farelerinde (n = 4) miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p ve miRNA-7219-5p ekspresyonunun qRT-PCR analizi. Veriler SE (hata çubukları) ± ortalamadır; Gruplar arasındaki anlamlı farklılıkları araştırmak için t-testleri kullanıldı. *p, t-testi ile 0,05 <. Kısaltmalar: miRNA = mikroRNA; SAMP1 = yaşlanma hızlandırmalı fare eğilimli; SAMR1 = yaşlanma hızlandırmalı fare direnci 1; qRT-PCR = kantitatif ters-transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Hedef miRNA'ların ekspresyon seviyeleri, qRT-PCR kullanılarak yukarıda açıklanan protokol tarafından başarıyla belirlendi. Ekstrakte edilen miRNA'ların değerlendirilmesi, anlamlı qRT-PCR verilerinin elde edilmesinde önemli bir adımdır. qRT-PCR'yi gerçekleştirmeden önce miRNA'ların yeterli kalitesini doğrulamak için, 260 nm'deki absorbans oranını 280 nm'deki absorbans oranını belirlemek için spektrofotometri kullanılmalıdır. DNA kontaminasyonu meydana gelebilir ve / veya qRT-PCR beklenen uzunlukta ve erime sıcaklığında tek bir PCR amplifikasyonu sağlamıyorsa veya monomodal bir erime eğrisi sağlıyorsa, reaksiyon plakasının her bir kuyucuğunda astar dimerleri mevcut olabilir.
MiRNA ekspresyon seviyeleri, qRT-PCR dışında, kuzey lekelenmesi, bir mikroarray ve ribonükleaz koruma testleri de dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle değerlendirilebilir. Bununla birlikte, qRT-PCR yöntemi, kuzey lekelenme ve ribonükleaz koruma testleri için gerekli olanlardan daha küçük bir numune hacmi gerektiren hassas, doğru, basit ve tekrarlanabilir bir prosedürdür19. Mikrodiziler aynı anda on binlerce miRNA'nın ekspresyonunu ölçebildiğinden, aday miRNA belirteçlerini tanımlamak için kullanılabilirler. Mikroarray verileri ayrıca qRT-PCR20 ile elde edilen verilerle yüksek bir genel korelasyon göstermektedir. Bununla birlikte, farklı çalışmalarda elde edilen mikroarray verilerinin karşılaştırılması için en uygun metodoloji konusunda fikir birliğine varılamamıştır21.
Serum miRNA'larının değerlendirilmesi aşağıdaki özelliklere sahiptir. İlk olarak, serum toplamak kolaydır ve serum miRNA'ları donma ve çözülmeye, sıcaklığa ve aside karşı kararlı olduğundan, miRNA'lar iyi biyobelirteçler olabilir. İkincisi, türler arasında miRNA'ların yüksek homolojisi vardır ve hayvan deneylerinin sonuçları insanlara kolayca tahmin edilir. Üçüncüsü, serum miRNA'ları terapötik ilaçlar olarak kullanım potansiyeli göstermiştir3. Birçok çalışma ayrıca organlardaki miRNA ekspresyon düzeyinin serum22,23,24'teki miRNA ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Bu çalışmada, böbrek seviyeleri SAMR1 ve SAMP1 fareleri arasında anlamlı bir fark göstermeyen miRNA-223-3p de serumda anlamlı bir gerinim farkı göstermedi. Buna karşılık, böbrek seviyeleri SAMR1 ve SAMP1 fareleri arasında anlamlı bir fark gösteren miRNA-7218-5p ve miRNA-7219-5p, serumda önemli gerinim farklılıkları göstermiştir.
Bu protokol aşağıdaki sınırlamalara sahiptir. Birincisi, karaciğer ve akciğer gibi diğer organlarda yararlılığı doğrulanmamıştır ve ikincisi, sıçanlar, köpekler ve domuzlar gibi diğer laboratuvar hayvanları üzerinde test edilmemiştir. Birçok araştırma grubu bu protokolü miRNA'ların qRT-PCR ile saflaştırılması ve tespiti için kullanmış ve bu protokolün dokulardan ve serum 13,14,22,23,24'ten yüksek kaliteli RNA'nın saflaştırılmasını sağladığını bildirmiştir. Bu yöntemin, miRNA'ların ekspresyonunu tespit etmek için yüksek doğruluk ve duyarlılığa sahip olduğu gösterilmiştir13,14,22,23,24. Bu çalışmanın sonuçları, bu protokolün farelerin serumunda ve böbreğinde miRNA ekspresyonunu başarılı bir şekilde tespit edebileceğini göstermektedir. Bu nedenle, protokol çeşitli patolojileri olan farelerde serum ve böbrek miRNA ekspresyon profillerini belirlemek için kullanılabilir. Protokolün basitliği nedeniyle, çok sayıda örnek aynı anda işlenebilir. Böbreğin çeşitli patolojik durumlarında birçok miRNA'nın ekspresyonunun analizleri, bu nedenle, burada açıklanan protokolü kullanabilir.
Protokolün akılda tutulması gereken bazı yönleri vardır. Oda sıcaklığında oluşacak saflaştırılmış miRNA'ların bozulmasını önlemek için, miRNA'lar buz üzerinde tutulmalıdır. Böbrek örnekleri, lizis reaktifinde tamamen çözünene kadar homojenize edilmelidir. Fare böbreği, lizis reaktifinde çözünmeyen önemli miktarda bağ dokusu içerir ve bu nedenle daha fazla homojenizasyon için bir sütun parçalayıcı gereklidir. Ek olarak, uygun endojen kontrol miRNA'sı (örnekler arasında kararlı ekspresyon ile) bir qRT-PCR deneyinin kurulumu boyunca doğrulanmalıdır. Bunun nedeni, bu protokolün uygulanması sırasında çeşitli maddelerin girişimlenmesinin, endojen kontrol miRNA'larının ekspresyon seviyelerini değiştirebilmesi ve muhtemelen sonuçları tehlikeye atmasıdır. Sonuç olarak, bu yazıda yaşa bağlı böbrek yetmezliği olan farelerin serum ve böbreklerinde miRNA ekspresyonunun saptanması, saflaştırılması ve değerlendirilmesi için bir qRT-PCR protokolü tanımlanmıştır.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Hiç kimse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL spitz with heparin | Greiner-bio-one | 450534 | |
| Buffer RPE (wash buffer #2 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:4) | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
| Buffer RWT (wash buffer #1 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:2) | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00003871 | 5'-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU G-3' |
| miRNA-423-5p primer | Qiagen | MS00012005 | 5'-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU UU-3' |
| miRNA-7218-5p primer | Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG -3' |
| miRNA-7219-5p primer | Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA GA-3' |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
| miRNeasy Serum/Plasma kit | Qiagen | 217184 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
| miScript II RT kit (reverse transcription buffer) | Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube |
| QIAzol Lysis Reagent (phenol/guanidine-based lysis reagent) | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
| RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not disclosed due to confidentiality |
| SAMP1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
| SAMR1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
| Takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer |
References
- Huang, Y. The novel regulatory role of lncRNA-miRNA-mRNA axis in cardiovascular diseases. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (12), 5768-5775 (2018).
- Yang, C., Dou, R., Yin, T., Ding, J. MiRNA-106b-5p in human cancers: diverse functions and promising biomarker. Biomedicine and Pharmacotherapy. 127, 110211 (2020).
- Lu, T. X., Rothenberg, M. E.
- McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring. Cancer and Metastasis Reviews. 34 (1), 145-155 (2015).
- Bjorkman, S., Taylor, H. S. MicroRNAs in endometriosis: biological function and emerging biomarker candidates. Biology of Reproduction. 100 (5), 1135-1146 (2019).
- Zhou, C. X., et al. miRNA and circRNA expression patterns in mouse brain during toxoplasmosis development. BMC Genomics. 21 (1), 46 (2020).
- Jing, R., Zhong, Q. Q., Long, T. Y., Pan, W., Qian, Z. X. Downregulated miRNA-26a-5p induces the apoptosis of endothelial cells in coronary heart disease by inhibiting PI3K/AKT pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 23 (11), 4940-4947 (2019).
- Xie, W., et al. miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).
- Bala, S., et al. Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases. Hepatology. 56 (5), 1946-1957 (2012).
- Ishii, H., et al. MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease. Translational Research. 237, 31-52 (2021).
- Latorre Luque, J. Relevance of the epigenetic regulation exercised by hepatic microRNAs in the fatty liver arena: from the bedside to the bench. , Available from: http://hdl.handle.net/10803/671499 (2019).
- Mastropasqua, R., et al. Serum microRNA levels in diabetes mellitus. Diagnostics (Basel). 11 (2), 284 (2021).
- Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Bacopulos, S., Seth, A. MicroRNA detection in prostate tumors by quantitative real-time PCR (qPCR). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3874 (2012).
- Ahn, J. H., Kwak, J., Lee, J. H., Lee, S. S. Efficient and accurate analysis of microRNA using a specific extension sequence. Molecular Biology Reports. 45 (4), 611-619 (2018).
- Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. Structural and functional changes With the aging kidney. Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).
- Weinstein, J. R., Anderson, S. The aging kidney: physiological changes. Advances in Chronic Kidney Disease. 17 (4), 302-307 (2010).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Rajeevan, M. S., Vernon, S. D., Taysavang, N., Unger, E. R. Validation of array-based gene expression profiles by real-time (kinetic) RT-PCR. The Journal of Molecular Diagnostics. 3 (1), 26-31 (2001).
- Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
- Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate. BMC Genomics. 6, 59 (2005).
- Petriella, D., et al. miRNA profiling in serum and tissue samples to assess noninvasive biomarkers for NSCLC clinical outcome. Tumour Biology. 37 (4), 5503-5513 (2016).
- Skrzypa, M., et al. miRNA-146a-5p is upregulated in serum and cartilage samples of patients with osteoarthritis. Polski Przeglad Chirurgiczny. 91 (3), 1-5 (2019).
- Farzanehpour, M., et al. Serum and tissue miRNAs: potential biomarkers for the diagnosis of cervical cancer. Journal of Virology Journal. 16 (1), 116 (2019).
