Summary
Burada, çeşitli böbrek hastalığı fare modellerinde viral olmayan bir vektörün kuyruk damarı enjeksiyonu ve polietilenimin nanopartikülleri yoluyla böbreğe yapay olarak sentezlenmiş dışsal miRNA taklitleri veriyoruz. Bu, böbrekte hedef miRNA'nın önemli ölçüde aşırı ekspresyonuna yol açtı ve birkaç fare modelinde böbrek hastalığının ilerlemesini engelledi.
Abstract
mikroRNA'lar (miRNA'lar), proteinlere çevrilmeyen küçük kodlamayan RNA'lar (21-25 baz), çeşitli böbrek hastalıklarında dengelerini bozarak ve translasyonlarını inhibe ederek birçok hedef mesajcı RNA'yı (mRNA) inhibe eder. Bu nedenle, miRNA ekspresyonunun eksojen yapay olarak sentezlenmiş miRNA taklitleri ile değiştirilmesi, birçok böbrek hastalığının gelişimini inhibe etmek için potansiyel olarak yararlı bir tedavi seçeneğidir. Bununla birlikte, serum RNAaz, sistematik olarak uygulanan eksojen miRNA taklitlerini in vivo olarak derhal bozduğundan, miRNA'nın böbreğe verilmesi bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, eksojen miRNA taklitlerini RNAaz tarafından bozulmaya karşı koruyabilen ve bunları böbreğe önemli ölçüde iletebilen vektörler gereklidir. Birçok çalışma, böbreğe eksojen miRNA taklitleri veya inhibitörleri vermek için viral vektörler kullanmıştır. Bununla birlikte, viral vektörler interferon yanıtına ve / veya genetik instabiliteye neden olabilir. Bu nedenle, viral vektörlerin gelişimi, eksojen miRNA taklitlerinin veya inhibitörlerinin klinik kullanımı için de bir engeldir. Viral vektörlerle ilgili bu endişelerin üstesinden gelmek için, polietilenimin nanopartiküllerinin (PEI-NP'ler) kuyruk damarı enjeksiyonunu kullanarak böbreğe miRNA taklitleri vermek için viral olmayan bir vektör yöntemi geliştirdik, bu da böbrek hastalığının birkaç fare modelinde hedef miRNA'ların önemli ölçüde aşırı ekspresyonuna yol açtı.
Introduction
miRNA'lar, proteinlere çevrilmeyen küçük kodlamayan RNA'lar (21-25 baz), birçok hedef mesajcı RNA'yı (mRNA'lar) istikrarsızlaştırarak ve çeşitli böbrek hastalıklarında translasyonlarını inhibe ederek inhibe eder 1,2. Bu nedenle, ekzojen yapay olarak sentezlenmiş miRNA taklitleri veya inhibitörleri kullanan gen tedavisi, birçok böbrek hastalığının gelişimini inhibe etmek için potansiyel yeni bir seçenektir 3,4,5.
Gen terapisi için miRNA taklitleri veya inhibitörlerinin vaadine rağmen, hedef organlara teslimat, in vivo deneylerin klinik potansiyellerini geliştirmeleri için büyük bir engel olmaya devam etmektedir. Yapay olarak sentezlenen miRNA taklitleri veya inhibitörleri serum RNaz tarafından derhal bozunmaya maruz kaldıklarından, in vivo6 sistemik uygulama üzerine yarı ömürleri kısalır. Ek olarak, miRNA taklitçilerinin veya inhibitörlerinin plazma zarını ve transfektan sitoplazmasını geçme etkinliği genellikle uygun vektörler olmadan çok daha düşüktür 7,8. Bu kanıtlar, böbrek için miRNA taklitlerinin veya inhibitörlerinin dağıtım sisteminin geliştirilmesinin, klinik ortamlarda kullanımlarını sağlamak ve çeşitli böbrek hastalıkları olan hastalar için yeni bir tedavi seçeneği haline getirmek için gerekli olduğunu göstermektedir.
Viral vektörler, eksojen miRNA taklitlerini veya inhibitörlerini böbreğe iletmek için taşıyıcı olarak kullanılmıştır 9,10. Biyogüvenlik ve transfeksiyon etkinliği için geliştirilmiş olmalarına rağmen, viral vektörler hala interferon yanıtına ve / veya genetik instabiliteye neden olabilirler11,12. Bu endişelerin üstesinden gelmek için, böbrek hastalığının birkaç fare modelinde viral olmayan bir vektör olan polietilenimin nanopartiküllerini (PEI-NP'ler) kullanarak böbrek için bir miRNA taklit dağıtım sistemi geliştirdik13,14,15.
PEI-NP'ler, miRNA taklitleri de dahil olmak üzere oligonükleotidleri böbreğe etkili bir şekilde iletebilen doğrusal polimer bazlı NP'lerdir ve uzun vadeli güvenlikleri ve biyouyumlulukları nedeniyle viral olmayan vektörlerin hazırlanmasında tercih edilir13,16,17.
Bu çalışma, tek taraflı üreter obstrüksiyonu (UUO) ile üretilen renal fibrozis model farelerde kuyruk ven enjeksiyonu yoluyla PEI-NP'lerle sistematik eksojen miRNA taklitçiliğinin etkilerini göstermektedir. Ek olarak, diyabetik böbrek hastalığı model farelerde (db/db fareler: C57BLKS/J Iar -+Lepr db/+Leprdb) ve renal iskemi-reperfüzyon hasarı (IRI) tarafından üretilen akut böbrek hasarı model farelerde kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla PEI-NP'lerle sistematik ekzojen miRNA mimik verilmesinin etkilerini gösterdik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deney protokolleri, Jichi Tıp Üniversitesi hayvan etik komitesi tarafından onaylanmış ve Jichi Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Kılavuzu'ndaki Deney Hayvanlarının Kullanımı ve Bakımı kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Burada, böbreğe miRNA taklit iletimini, UUO fareleri kullanılarak aşırı ekspresyonuna neden olduğunu gösterdik. Bu çalışma Jichi Tıp Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır [Onay No. 19-12 renal fibroz için, 17-024 akut böbrek enfeksiyonu (AKI) için ve 19-11 diyabetik nefropati için].
1. PEI-NPs-miRNA-mimik kompleksinin hazırlanması
NOT: Burada, bir fare için PEI-NPs-miRNA-miRNA-mimic13,14,15 ve PEI-NPs-control-miRNA'nın (negatif kontrol olarak) hazırlanması açıklanmaktadır.
- Aşağıdaki öğeleri hazırlayın:
- 10 μL doğrusal PEI-NP hazırlayın.
- 100 μM konsantrasyonunda nükleaz içermeyen suda çözünmüş 50 μL yapay olarak sentezlenmiş miRNA'lar hazırlayın (50 μL nükleaz içermeyen suda çözünmüş 5 nmol miRNA).
- 100 μM konsantrasyonunda nükleaz içermeyen suda çözünmüş 50 μL yapay olarak sentezlenmiş kontrol (hedef olmayan) miRNA'ları hazırlayın (50 μL nükleaz içermeyen suda çözünmüş 5 nmol miRNA).
- % 5 ve% 10 glikoz çözeltileri hazırlayın. 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinin ve bir vorteks karıştırıcının kullanılabilirliğini sağlayın.
- 10 μL PEI-NP'yi, 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 90 μL% 5 glikoz çözeltisi içinde çözün. Ardından, tüpü yavaşça vorteks edin ve aşağı doğru döndürün.
- Nükleaz içermeyen suda (100 μM konsantrasyonu) çözünmüş 50 μL yapay olarak sentezlenmiş miRNA'ları (5 nmol), 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde 50 μM% 10 glikoz çözeltisi ile karıştırın. Ardından, tüpü yavaşça vorteks edin ve aşağı doğru döndürün. Bu işlem,% 5 glikoz çözeltisi içinde çözünmüş miRNA verir.
- 100 μL PEI-NP'leri %5 glikoz çözeltisinde ve 100 μL miRNA taklitini (5 nmol) %5 glikoz çözeltisinde karıştırın. Ardından, tüpü yavaşça vorteks edin ve aşağı doğru döndürün.
- Kararlı bir PEI-NPs-miRNA-mimik kompleksi hazırlamak için karışımı oda sıcaklığında (RT) 15 dakika inkübe edin. Bu çözelti, polimerdeki azotların (N) nükleik asitlerdeki fosfata (P) oranında PEI-NP'ler ve miRNA taklidi (5 nmol) içerir (N / P oranı) = 6 (Şekil 1).
NOT: PEI-NPs-control-miRNA kompleksi, bu makalede açıklanan tüm böbrek hastalığı fare modelleri (UUO, diyabetik nefropati ve AKI) için 1.1-1.5 adımlarında açıklanan aynı işlem kullanılarak hazırlanabilir. PEI-NP-miRNA'lar-taklitlerinin bir enjeksiyon hacmi, N / P oranında = 6'da PEI-NP'lerle konjuge edilmiş 5 nmol miRNA-mimik ile aynıdır. Her bir PEI-NP-miRNA'nın enjeksiyon süresi ve sıklığı, uygulandığı hastalık modeline bağlıdır.
2. Floresan mikroskopi kullanılarak kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla PEI-NP ile UUO farelerde miRNA taklitinin böbreğe önemli ölçüde verildiğinin doğrulanması
NOT: Burada, yapay olarak saflaştırılmış miRNA taklitinin böbreğe verilme yöntemi, çeşitli böbrek hastalıkları için terapötik yöntemlerin oluşturulmasını gösteren ayrıntılı olarak ele alınmıştır. Kısacası, UUO farelere, kuyruk damarı yoluyla 100 μL PEI-NP'ye eklenen siyanin3 karboksilik asit (Cy3) etiketli miRNA taklidi uygulandı. Böbreklere verilen doğum floresan mikroskobu ile doğrulandı. Bir fare için PEI-NPs-siyanin3 karboksilik asit (Cy3) etiketli miRNA taklidi (oligonükleotidler) tanımlanmıştır. Bu yöntem, UUO fareleri, diyabetik böbrek hastalığı fareleri ve IRI tarafından üretilen AKI fareleri gibi çeşitli fare modellerinde böbreğe miRNA taklidini önemli ölçüde verebilir. Burada, video gösterimi için bir UUO fare modeli kullandık. UUO'nun indüksiyon yöntemi daha önce başka bir yerde tanımlanmıştır13. UUO ameliyatından sonraki altı gün içinde bu protokolleri takip edin.
- Aşağıdaki öğeleri hazırlayın:
- 2 μL PEI-NP ve 100 μL Cy3 etiketli çift sarmallı oligonükleotidler hazırlayın [Cy3 etiketli miRNA taklidi (1 nmol; 10 μM)].
- % 5 ve% 10 glikoz çözeltileri hazırlayın. 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinin ve bir vorteks karıştırıcının kullanılabilirliğini sağlayın.
- UUO farelerin kuyruk damarlarını izole etmek için kapakta küçük bir delik bulunan 50 mL'lik bir plastik santrifüj tüpü kullanın.
- Floresan mikroskobu için, optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği, bir kriyostat, sıvı azot, fosfat tamponlu salin (PBS), 27 G iğneli 1,0 mL şırıngalar ve silan kaplı cam hazırlayın.
NOT: Floresein etiketli Lotus tetragonolobus lektin (proksimal tübül belirteci) ve 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), proksimal tübüllerin ve hücre çekirdeklerinin isteğe bağlı boyanması için hazırlanabilir.
- 2 μL PEI-NP'yi 98 μL% 10 glikoz çözeltisi içinde 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde çözün. Ardından, tüpü yavaşça vorteks edin ve aşağı doğru döndürün.
- %10 glikoz çözeltisinde 100 μL PEI-NP'ye 100 μL Cy3 etiketli miRNA taklidi ekleyin (adım 2.2'de hazırlanmıştır). Ardından, tüpü yavaşça vorteks edin ve aşağı doğru döndürün.
- Stabil bir PEI-NPs-Cy3-labeled-miRNA-mimik kompleksi hazırlamak için karışımı RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
- UUO fareyi anestezi olmadan 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve ardından kuyruğu kapaktaki hazırlanan delikten yerleştirin.
- 1.0 mL'lik bir şırıngayı 27 G'lik bir iğne ile 200 μL PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimik kompleksi ile doldurun.
- 27 G iğneli 1,0 mL şırıngayı kullanarak farenin kuyruk damarından PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimik (200 μL ) enjekte edin.
NOT: Kuyruk damarını genişletmek ve enjeksiyon bölgesini dezenfekte etmek için kuyruk damarını etanol içine doymuş pamuk yünü (%70-%80) ile silin. - 200 μL PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimik kompleks enjeksiyonundan bir saat sonra, küçük hayvanlar için uygun bir anestezik cihaz kullanarak fareyi izofluran (% 4 -% 5) ile uyuşturun. Ayak parmağı sıkışma refleksinin yokluğunda anestezinin derinliğini onaylayın. Ameliyat boyunca anesteziyi izofluran (%3) ile sürdürün.
- Daha sonra, kalbi açığa çıkarmak için cerrahi makas ve forseps ile cilde, kaslara ve kaburgalara bir kesi yapın. Sağ atriyuma bir kesi yaptıktan sonra, böbrek rengi soluk sarıya dönüşene kadar (tüm fare vücudunun PBS ile perfüze edildiğini gösterir) vücut boyunca kan çekmek için PBS'yi sol ventriküle enjekte edin.
NOT: Kardiyak perfüzyon, vücuttaki kanı etkili bir şekilde çıkarmak için yapılır. - İzofluranı durdurun ve böbrekleri farelerden çıkarın ve PBS ile yıkayın. Bundan sonra, böbrek kapsüllerini böbreklerden çıkarın ve böbrekleri PBS ile iki kez yıkayın.
- Böbrek dokusu örneklerini OCT bileşiğine gömün ve sıvı azotta dondurun.
- Bölümleri hazırlamak için bir kriyostat kullanın (5 μm kalınlığında). Bölümleri silan kaplı cam slaytlara monte edin ve% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.
NOT: Böbrek dokuları isteğe bağlı olarak proksimal tübüller için RT'de 2 saat boyunca floresein etiketli Lotus tetragonolobus lektin (2 mg / mL), ardından hücre çekirdekleri için 15 dakika boyunca RT'de DAPI (PBS'de 30 nM) ile boyanabilir. - Slaytları PBS ile iki kez nazikçe yıkayın.
- Floresan boyamayı floresan mikroskobu ile 100x ve 400x büyütme ve uygun görüntüleme yazılımı ile görselleştirin.
3. Kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla PEI-NP ile miRNA mimiğinin böbreğe verilmesini takiben hedef miRNA değişikliklerinin doğrulanması
- Hedef miRNA değişimlerini doğrulamak için kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) gerçekleştirin.
NOT: qRT-PCR18,19,20'nin ayrıntıları için daha önce yayınlanan makaleye bakın. Aşağıda verilen temsili sonuçları üretmek için kullanılan qRT-PCR sistemi üretici firma tarafından değiştirilmiştir. qRT-PCR, en son üreticinin protokolüne uygun olarak yapılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aşağıda tarif edilen renal fibrozis, diyabetik nefropati ve AKI için hedef miRNA'lar, gen terapisi uygulamaları için mikrodizi, qRT-PCR ve / veya veritabanı araştırmasına dayanarak seçildi. Daha fazla ayrıntı için, önceki yayınlarabakın 13,14,15.
Renal fibrozis farelerinde PEI-NP'ler kullanılarak miRNA-146a-5p-mimik verilmesi ve etkileri13
Floresan mikroskopi analizi, PEI-NP'lerin kuyruk damarı enjeksiyonunun, miRNA taklitini tübülointerstisyel boşluğa iletebileceğini göstermiştir. UUO tarafından üretilen renal fibrozis farelerinde bu, böbrekte düzenli bir forma sahip olmayan renal tübüler hücreleri (Şekil 2A oku) ve glomerulusu (Şekil 2A) içeriyordu. qRT-PCR analizi, PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimik enjeksiyonunun böbrekte miRNA-146a-5p'nin önemli ölçüde aşırı ekspresyonuna neden olduğunu göstermiştir (Şekil 2B). Dahası, enjeksiyon, in vivo Sirius kırmızı boyama (kırmızı fibrotik alanları gösterir) ile tahmin edildiği gibi, UUO tarafından üretilen model farelerde renal fibrozun ilerlemesini inhibe etti. PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimik enjeksiyonu, UUO tedavisinden 1 gün önce, 1 gün sonra ve 3 gün sonra (UUO tedavisinden tahmini 6 gün sonra) gerçekleştirildi (Şekil 2C). PEI-NPs-kontrol miRNA enjeksiyonu renal fibroz üzerinde önleyici etki göstermedi (Şekil 2B, C). PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimik ve PEI-NPs-miRNA-control-miRNA'ların uygulanması, farelerde 5-oligoadenilat sentaz ve sinyal iletiminin artması ve transkripsiyon 1'in aktivatörü gibi bir IFN yanıtına neden olmamıştır (Şekil 2D).
Diyabetik böbrek hastalığı model farelerde PEI-NP'ler kullanılarak miRNA-181b-5p-mimik verilmesi ve etkileri14
Diyabetik böbrek hastalığı için miRNA-181b-5p'nin terapötik potansiyelini değerlendirmek için, 10 hafta boyunca haftada 10 haftalık db / db farelere miRNA-181b-5p-PIE-NP'leri enjekte ettik veya miRNA-PIE-NP'leri kontrol ettik. Floresan mikroskopi analizi, PEI-NP'lerin kuyruk damarı enjeksiyonunun, diyabetik böbrek modeli (db / db) farelerinin böbreklerindeki glomerulus ve tübülointerstisyel boşluğa in vivo miRNA taklidi verebileceğini göstermiştir (Şekil 3A). Ek olarak, qRT-PCR analizi, PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimik enjeksiyonunun böbrekte miRNA-181b-5p'nin önemli ölçüde aşırı ekspresyonuna neden olduğunu göstermiştir (Şekil 3B). Periyodik asit-Schiff boyaması ile yapılan histolojik analiz, PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimik enjeksiyonunun 10-20 haftalıktan itibaren haftada bir kez enjeksiyonunun, in vivo olarak db / db farelerde diyabetik böbrek hastalığının ilerlemesini inhibe ettiğini göstermiştir (Şekil 3C). Buna karşılık, PEI-NPs-kontrol miRNA enjeksiyonu renal fibroz üzerinde önleyici etkiler sağlamamıştır (Şekil 3B, C).
IRI 15 tarafından üretilen akut böbrek hasarı model farelerde PEI-NPs-miRNA-5100-mimik verilmesi ve etkileri
Floresan mikroskopi analizi, PEI-NP'lerin kuyruk damarı enjeksiyonunun, AKI model farelerin böbreklerinin in vivo glomerulus ve tübülointerstisyel boşluğuna miRNA taklidi verebileceğini göstermiştir (Şekil 4A). qRT-PCR analizi, PEI-NPs-miRNA-5100-5p-mimik enjeksiyonunun, IRI tarafından üretilen AKI farelerinin böbreklerinde miRNA-5100'ün önemli ölçüde aşırı ekspresyonuna neden olduğunu göstermiştir (Şekil 3B). Hematoksilin-eozin boyaması ile yapılan histolojik analiz, tek bir PEI-NPs-miRNA-5100 enjeksiyonunun, IRI tarafından üretilen AKI fare modelinde AKI gelişimini önleyen tübüler hücre apoptozunu (siyah ok) azalttığını göstermiştir. PEI-NPs-miRNA-5100-mimik, IRI işleminden 2 gün önce kuyruk damarından enjekte edildi (Şekil 4B). PEI-NPs-kontrol miRNA-enjeksiyonu renal fibroz üzerinde önleyici etki göstermedi (Şekil 4B, C).
Resim 1: PEI-NPs-miRNA-mimik kompleksinin yapısı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Renal fibrozis farelerinde PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimik verilmesi ve etkileri . (A) Floresan mikroskopi analizi. Ölçek çubuğu = 200 μm. (B) Her gruptaki miRNA-146a-5p ekspresyon seviyelerinin qRT-PCR analizi (grup başına n = 6). (C) Sirius kırmızı boyama ile histolojik analiz (kırmızı fibrotik alanı gösterir, ölçek çubuğu = 100 μm). PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimik enjeksiyonu, UUO tedavisinden 1 gün önce, 1 gün sonra ve 3 gün sonra farelerde in vivo renal fibroz gelişimini inhibe etti. (D) UUO farelerde PEI-NPs-miRNA-146a-5p'ye potansiyel IFN yanıt etkilerini araştırmak için böbreğin qRT-PCR analizi (grup başına n = 6). Kısaltmalar: DAPI, 4,6-diamidino-2-fenilindol; FITC, floresein izotiyosiyanat; qRT-PCR, kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu; NS, önemli değil; PEI-NP'ler, polietilenimin nanopartikülleri; miRNA, mikroRNA; UUO, tek taraflı üreter tıkanıklığı; OAS1, 5′-oligoadenilat sentaz; STAT1, sinyal iletimi ve transkripsiyon aktivatörü 1. Değerler ortalama ± standart hatayı (hata çubukları) temsil eder. *P < 0,05. Morishita ve ark. (Uluslararası Nanotıp Dergisi, 2015, 10, 3475-3488. Orijinal olarak Dove Medical Press Ltd. tarafından yayınlanmış ve Dove Medical Press Ltd.'nin izniyle kullanılmıştır). 13. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimik'in diyabetik böbrek hastalığı model farelerde verilmesi ve etkileri14. (A) Floresan mikroskopi analizi. Ölçek çubuğu = 200 μm. (B) PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimik enjeksiyonunu takiben miRNA-181b-5p'nin aşırı ekspresyon etkilerini değerlendirmek için qRT-PCR analizi (grup başına n = 3). (C) Fenotipik değişiklikler ışık mikroskobu ile gözlendi. PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimik enjeksiyonu, 12-20 haftalıktan itibaren haftada bir kez, in vivo olarak db / db farelerde diyabetik böbrek hastalığının ilerlemesini inhibe etti. Ölçek çubuğu = 50 μm. Gruplar arasında çoklu karşılaştırma analizi testi için bir varyans analizi (ANOVA) kullandık. ANOVA tarafından istatistiksel anlamlılık tespit edersek, post hoc analiz olarak iki grubun ortalamalarını karşılaştırmak için Türkiye'nin testini gerçekleştirdik. Kısaltmalar: PEI-NP'ler, polietilenimin nanopartiküller; qRT-PCR, kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu; miRNA, mikroRNA. *P < 0,05. Bu rakam Ishii ve arkadaşlarından değiştirilmiştir. 14. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: IRI tarafından üretilen akut böbrek hasarı model farelerde PEI-NPs-miRNA-5100-mimik verilmesi ve etkileri . (A) Floresan mikroskopi analizi. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) PEI-NPs-miRNA-5100-mimik enjeksiyonunu takiben miRNA-5100'ün aşırı ekspresyon etkilerini değerlendirmek için qRT-PCR analizi. (C) Hematoksilin-eozin boyalı böbreğin histolojik analizi. Ölçek çubuğu = 100 μm. IRI prosedüründen 2 gün önce kuyruk damarından enjekte edilen PEI-NP'ler, IRI tarafından indüklenen AKI ilerlemesini önler. Kısaltmalar: PEI-NP'ler, polietilenimin nanopartiküller; qRT-PCR, kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu; miRNA, mikroRNA; AKI, akut böbrek hasarı; IRI, iskemi-reperfüzyon hasarı. **P < 0,01,*P < 0,05. Bu rakam Aomatsu ve ark.15'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede sunulan protokolü kullanarak, PEI-NP'ler, hedef miRNA'ların aşırı ekspresyonunu indüklemek için böbreğe miRNA taklitleri verebilir ve bu da renal fibroz, diyabetik böbrek hastalığı ve AKI dahil olmak üzere çeşitli böbrek hastalıklarının in vivo fare modellerinde tedavi etkilerine neden olabilir.
PEI-NP kompleksini ve miRNA taklidini hazırlama yöntemi çok basittir. PEI-NP'lerin pozitif yüklü yüzeyi, 13,14,15,16,17 karıştırıldığında miRNA taklidini yakalar (Şekil 1). Ek olarak, doğrusal polietilenimin bazlı viral olmayan bir vektör olarak, PEI-NP'ler, genetik instabilite11,15,16 tarafından indüklenen IFN yanıtı ve onkogenez gibi viral vektörlerin kullanımıyla ilişkili sorunlardan kaçınır.
PEI-NP'lerin kuyruk damarı yoluyla enjekte edilmesi, özellikle AKI ve obez db / db farelerde, böbrek hastalığı olan farelerin kuyruk damarlarının dehidrasyon nedeniyle delinmesi bazen zor olduğundan, eğitim gerektirebilir. Ek olarak, birkaç fare modeli için PEI-NPs-miRNA-mimik enjeksiyonunun tekrar tekrar enjekte edilmesi gerekebilir. Enjeksiyon aralıkları, her böbrek hastalığı fare modeli bağlamında PEI-NPs-miRNA-mimik ile aşırı ekspresyonun nasıl gerçekleştiğine dair ön deneyimlerle belirlenmelidir.
Viral vektörler böbreklerde miRNA taklitçiliğinin transfeksiyonu için sıklıkla kullanılır ve miRNA'ların önemli transfeksiyonuna yol açabilir 9,10. Bununla birlikte, viral vektörlerin interferon yanıtına ve / veya genetik instabiliteye neden olma gibi potansiyel problemleri vardır11,12. Bu nedenle, Jelatin-NPs 21,22, elektroporasyon23, hidrodinamik enjeksiyon 24,25 ve ultrason 26 kullanarak transfeksiyon gibi viral olmayan vektörleri kullanan çeşitli alternatif dağıtım yöntemleri geliştirilmiştir. Bu yazıda, PEI-NP'leri böbrek için viral olmayan bir vektör olarak tanıttık. Bazı viral olmayan vektörler oldukça invazivdir (elektroporasyon ve hidrodinamik enjeksiyon) ve bu nedenle klinik kullanım için uygulanması zor olabilir. Bununla birlikte, PEI-NP'lerin lipit bazlı nanopartiküller ve Jelatin-NP'ler gibi diğer viral olmayan vektörlerle karşılaştırılması daha ileri çalışmalarda değerlendirilmelidir.
Bu protokol aşağıdaki sınırlamalara sahiptir. İlk olarak, PEI-NP'ler-miRNA'lar fare modelleri için uygun olsa da (en azından ilk aşama olarak), klinik öncesi araştırmalar için kullanılan büyük hayvan modelleri (sıçanlar, tavşanlar, maymunlar ve köpekler gibi) için büyük miktarlarda PEI-NP'ler-miRNA'lar gereklidir. Ek olarak, PEI-NP'lerin miRNA taklitini özellikle böbreğe vermediğine dikkat edilmelidir, çünkü PEI-NP'ler, viral vektörler gibi, hedeflenmiş bir dağıtım sistemi değildir. Bu nedenle diğer organların fenotipinin araştırılması gerekebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen JSPS KAKENHI (Hibe No. 21K08233) tarafından desteklenmiştir. Bu yazının taslaklarını düzenlediği için Edanza'ya (https://jp.edanz.com/ac) teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
| Buffer RPE | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
| Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense) |
| Cy3-labeled double-strand oligonucleotides | Takara Bio Inc. | MIR7900 | |
| Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin | Vector Laboratories Inc | FL-1321 | |
| In vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
| miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense) |
| miRNA-146a-5p primer | Qiagen | MS00001638 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’ |
| miRNA-181b-5p primer | Qiagen | MS00006083 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′ |
| miRNA-5100-primer | Qiagen | MS00042952 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
| RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | Not assigned |
References
- Mohr, A. M., Mott, J. L.
- Bushati, N., Cohen, S. M.
- Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T. microRNAs in diabetic nephropathy: From biomarkers to therapy. Current Diabetes Reports. 16 (3), 35 (2016).
- Yheskel, M., Patel, V. Therapeutic microRNAs in polycystic kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (4), 282-289 (2017).
- Lv, W., et al. Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD. Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).
- Dykxhoorn, D. M., Lieberman, J. The silent revolution: RNA interference as basic biology, research tool, and therapeutic. Annual Review of Medicine. 56, 401-423 (2005).
- Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs. Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).
- Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
- Deng, M., et al. Klotho gene delivery ameliorates renal hypertrophy and fibrosis in streptozotocin-induced diabetic rats by suppressing the Rho-associated coiled-coil kinase signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 12 (1), 45-54 (2015).
- Zhou, Y., et al. Suppressor of cytokine signaling (SOCS) 2 attenuates renal lesions in rats with diabetic nephropathy. Acta Histochemica. 116 (5), 981-988 (2014).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 545-565 (2003).
- Lukashev, A. N., Zamyatnin, A. A. Viral vectors for gene therapy: Current state and clinical perspectives. Biochemistry. Biokhimiia. 81 (7), 700-708 (2016).
- Morishita, Y., et al. Delivery of microRNA-146a with polyethylenimine nanoparticles inhibits renal fibrosis in vivo. International Journal of Nanomedicine. 10, 3475-3488 (2015).
- Ishii, H., et al. MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. 237, 31-52 (2021).
- Aomatsu, A., et al. MicroRNA expression profiling in acute kidney injury. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinical. (21), 00283-00288 (2021).
- Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Gopferich, A. Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems. European Journal of Pharmceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
- Swami, A., et al. A unique and highly efficient nonviral DNA/siRNA delivery system based on PEI-bisepoxide nanoparticles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 835-841 (2007).
- Kaneko, S., et al. Detection of microRNA expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (161), e61535 (2020).
- Yanai, K., et al. Quantitative real-time PCR evaluation of microRNA expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61383 (2020).
- Aomatsu, A., et al. A quantitative detection method for microRNAs in the kidney of an ischemic kidney injury mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), e61378 (2020).
- Kushibiki, T., Nagata-Nakajima, N., Sugai, M., Shimizu, A., Tabata, Y. Enhanced anti-fibrotic activity of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF-beta type II receptor for a mouse model of obstructive nephropathy by cationized gelatin prepared from different amine compounds. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 110 (3), 610-617 (2006).
- Xia, Z., et al. Suppression of renal tubulointerstitial fibrosis by small interfering RNA targeting heat shock protein 47. American Journal of Nephrology. 28 (1), 34-46 (2008).
- Tanaka, T., et al. In vivo gene transfer of hepatocyte growth factor to skeletal muscle prevents changes in rat kidneys after 5/6 nephrectomy. American Journal of Transplantation: Official Journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 2 (9), 828-836 (2002).
- Hamar, P., et al. Small interfering RNA targeting Fas protects mice against renal ischemia-reperfusion injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (41), 14883-14888 (2004).
- Ma, D., et al. Xenon preconditioning protects against renal ischemic-reperfusion injury via HIF-1alpha activation. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (4), 713-720 (2009).
- Wei, S., et al. Short hairpin RNA knockdown of connective tissue growth factor by ultrasound-targeted microbubble destruction improves renal fibrosis. Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (12), 2926-2937 (2016).
