تحديد كمية نقل الحديد عبر مشيمة الفأر في الجسم الحي باستخدام نظائر الحديد غير المشعة
Summary
توضح هذه المقالة كيفية تحضير وإدارة الحديد النظيري غير المشع المرتبط بالترانسفيرين لدراسات نقل الحديد في حمل الفئران. كما تم وصف نهج قياس الحديد النظيري في مقصورات الجنين.
Abstract
الحديد ضروري لصحة الأم والجنين أثناء الحمل ، مع ما يقرب من 1 غرام من الحديد اللازم في البشر للحفاظ على حمل صحي. يعتمد وقف الحديد الجنيني كليا على نقل الحديد عبر المشيمة ، ويمكن أن تؤدي اضطرابات هذا النقل إلى نتائج سلبية للحمل. في الفئران ، اعتمد قياس تدفقات الحديد عبر المشيمة تقليديا على نظائر الحديد المشعة ، وهو نهج حساس للغاية ولكنه مرهق. توفر نظائر الحديد المستقرة (57Fe و 58Fe) بديلا غير مشع للاستخدام في دراسات الحمل البشري.
في ظل الظروف الفسيولوجية، يكون الحديد المرتبط بالترانسفيرين هو الشكل السائد من الحديد الذي تمتصه المشيمة. وهكذا ، تم تحضير 58Fe-transferrin وحقنه عن طريق الوريد في السدود الحوامل لتقييم نقل الحديد المشيمي مباشرة وتجاوز امتصاص الحديد المعوي للأم كمتغير مربك. تم قياس كمية الحديد النظيري في الأنسجة الجنينية للمشيمة والفأر بواسطة قياس الطيف الكتلي للبلازما المقترن بالحث (ICP-MS). يمكن أيضا استخدام هذه الطرق في أنظمة النماذج الحيوانية الأخرى لعلم وظائف الأعضاء أو المرض لتحديد ديناميكيات الحديد في الجسم الحي .
Introduction
الحديد أمر بالغ الأهمية لعمليات التمثيل الغذائي المختلفة ، بما في ذلك النمو والتنمية ، وإنتاج الطاقة ، ونقل الأكسجين1. الحفاظ على توازن الحديد هو عملية ديناميكية ومنسقة. يتم امتصاص الحديد من الطعام في الاثني عشر ونقله في جميع أنحاء الجسم في الدورة الدموية المرتبطة ببروتين نقل الحديد ترانسفيرين (Tf). يتم استخدامه من قبل كل خلية للعمليات الأنزيمية ، ودمجها في الهيموغلوبين في كريات الدم الحمراء الوليدة ، وإعادة تدويرها من كريات الدم الحمراء القديمة بواسطة البلاعم. يتم تخزين الحديد في الكبد عندما يكون زائدا ويفقد من الجسم من خلال النزيف أو تقشير الخلايا. كمية الحديد المتداولة هي نتيجة التوازن بين استهلاك وتوريد الحديد ، ويتم تنظيم هذا الأخير بإحكام بواسطة هرمون الكبد hepcidin (HAMP) ، المنظم المركزي لتوازن الحديد1. يعمل الهيبسيدين على الحد من التوافر البيولوجي للحديد في الدم عن طريق سد أو إحداث الوجود في كل مكان وتدهور فيروبورتين المصدر للحديد (FPN)2. يؤدي انخفاض FPN الوظيفي إلى انخفاض امتصاص الحديد الغذائي ، وعزل الحديد في الكبد ، وانخفاض إعادة تدوير الحديد من الضامة1.
يتم تنظيم Hepcidin من خلال حالة الحديد ، والالتهاب ، ومحرك الكريات الحمر ، والحمل (تمت مراجعته في 3). بالنظر إلى أن توازن الحديد ديناميكي للغاية ، فمن المهم فهم وقياس إجمالي تجمع الحديد وتوزيع الحديد ودورانه. اعتمدت الدراسات على الحيوانات تقليديا على نظائر الحديد المشعة ، وهو نهج حساس للغاية ولكنه مرهق لقياس ديناميكيات الحديد. ومع ذلك ، في الدراسات الحديثة ، بما في ذلك الدراسة المقدمة هنا4 ، يتم استخدام نظائر الحديد غير المشعة والمستقرة (58Fe) لقياس نقل الحديد أثناء الحمل5،6،7،8،9. النظائر المستقرة هي أدوات قيمة لدراسة استقلاب المغذيات (تمت مراجعتها في 10). أظهر استخدام نظائر الحديد المستقرة في الدراسات البشرية أن أ) زيادة امتصاص الحديد في نهاية الحمل5،6 ، ب) نقل الحديد الغذائي إلى الجنين يعتمد على حالة الحديد الأم7 ، ج) يتم دمج حديد الهيم المبتلع من قبل الأم بسهولة أكبر من قبل الجنين من الحديد غير الهيم 8 ، و د) يرتبط نقل الحديد إلى الجنين سلبا بمستويات هيبسيدين الأم8 ، 9. قامت هذه التجارب بقياس نظائر الحديد في الأمصال أو دمجها في كرات الدم الحمراء. ومع ذلك ، فإن قياس الحديد المدمج في كرات الدم الحمراء وحده قد يقلل من امتصاص الحديد الحقيقي9. في الدراسة الحالية ، يتم قياس كل من حديد الهيم وغير الهيم في الأنسجة.
أثناء الحمل ، الحديد مطلوب لدعم توسيع حجم خلايا الدم الحمراء للأم ونقلها عبر المشيمة لدعم نمو الجنينوتطوره 11. يعتمد الوقف الحديدي الجنيني كليا على نقل الحديد عبر المشيمة. خلال الحمل البشري12 والقورضا 4,13 ، تنخفض مستويات الهيبسيدين بشكل كبير ، مما يزيد من توافر الحديد في البلازما لنقله إلى الجنين.
تم وصف أساسيات نقل الحديد المشيمي في البداية في 1950s-70s باستخدام المتتبعات المشعة (59Fe و 55Fe). حددت هذه الدراسات أن نقل الحديد عبر المشيمة أحادي الاتجاه 14,15 وأن الترانسفيرين ثنائي الهديريك هو مصدر رئيسي للحديد للمشيمة والجنين 16,17. الفهم الحالي لنقل الحديد المشيمي أكثر اكتمالا ، على الرغم من أن بعض ناقلات الحديد الرئيسية والآليات التنظيمية لا تزال غير معروفة. كانت نماذج الماوس ضرورية لفهم تنظيم الحديد ونقله18 لأن الناقلات والآليات الرئيسية متشابهة بشكل ملحوظ. كل من المشيمة البشرية والفأر هي hemochorial ، أي أن دم الأم على اتصال مباشر مع مشيمية الجنين19. ومع ذلك ، هناك بعض الاختلافات الهيكلية الملحوظة.
الأرومة الغاذية المخلوية هي طبقة الخلايا المشيمة التي تفصل بين الدورة الدموية للأم والجنين وتنقل بنشاط الحديد والمواد المغذية الأخرى20. في البشر ، الأرومة المخلوية هي طبقة واحدة من الخلايا المنصهرة. في المقابل ، تتكون مشيمة الفأر من طبقتين من الأرومة الغاذية المخلوية21 ، Syn-I و Syn-II. ومع ذلك ، تسمح تقاطعات الفجوة في واجهة Syn-I و Syn-II بنشر العناصر الغذائية بين الطبقات22,23. وبالتالي ، تعمل هذه الطبقات كطبقة مخلوية واحدة مماثلة للأبلاست المخلوي الخلوي. تمت مراجعة أوجه التشابه والاختلاف الإضافية بين المشيمة البشرية والفأرية بواسطة Rossant و Cross21. يتم تشغيل نقل الحديد المشيمي عن طريق ربط الحديد-Tf من دم الأم إلى مستقبل الترانسفيرين (TfR1) الموضعي على الجانب القمي من الأرومة الغاذية المخلوية24. يؤدي هذا التفاعل إلى استيعاب الحديد-Tf / TfR1 عبر الالتداخل الخلوي بوساطة الكلثرين25. ثم يتم إطلاق الحديد من Tf في الإندوسومالحمضي 26 ، ويتم اختزاله إلى حديد حديدي بواسطة فيريراختزال غير محدد ، ويتم تصديره من الإندوسوم إلى السيتوبلازم بواسطة ناقل لم يتم تحديده بعد. كيف يتم مرافقة الحديد داخل الأرومة الغاذية المخلوية لا يزال يتعين وصفها. يتم نقل الحديد في نهاية المطاف إلى جانب الجنين بواسطة مصدر الحديد ، FPN ، الموضعي على السطح القاعدي أو المواجه للجنين من الأرومة المخلوية (تمت مراجعته في27).
لفهم كيفية تأثير التنظيم الفسيولوجي والمرضي ل TfR1 و FPN والهيبسيدين على نقل الحديد المشيمي ، تم استخدام نظائر الحديد المستقرة لتحديد كمية نقل الحديد من الدورة الدموية للأم إلى المشيمة والجنين في الجسم الحي4. تقدم هذه الورقة طرق تحضير وإعطاء ترانسفيرين الحديد النظيري للفئران الحوامل، ومعالجة الأنسجة من أجل ICP-MS، وحساب تركيزات الحديد في الأنسجة. يمكن تكييف استخدام نظائر الحديد المستقرة في الجسم الحي للتحقيق في تنظيم الحديد وتوزيعه في نماذج حيوانية مختلفة للتحقيق في تنظيم الحديد الفسيولوجي والمرضي.
Protocol
Representative Results
Discussion
الحديد مهم للعديد من العمليات البيولوجية ، وحركته وتوزيعه داخل الجسم ديناميكي للغاية ومنظم. توفر نظائر الحديد المستقرة بديلا ثابتا ومناسبا للنظائر المشعة لتقييم ديناميات توازن الحديد. الخطوة الحاسمة في البروتوكول هي تتبع جميع أوزان الأنسجة وأحجامها. الحديد عنصر وبالتالي لا يمكن تصنيعه …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقر المؤلفون باستخدام مرفق ICP-MS داخل مركز UC للآثار البيئية لتكنولوجيا النانو في CNSI في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس لمساعدتهم في تحسين البروتوكول لقياسات 58Fe. تم دعم الدراسة من قبل المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (NIDDK) (K01DK127004 ، إلى VS) والمعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (NICHD) (R01HD096863 ، إلى EN).
Materials
| 58Fe-iron metal | Trace Sciences International | Fe-58 | |
| Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC903024 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Millipore Sigma | CLS430829 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002432 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend RT | |||
| Delicate task wipers | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Diet: iron-deficient (4 ppm iron) | Envigo Teklad | TD.80396 | |
| Diet: standard chow (185 ppm iron) | PicoLab | 5053 | |
| Dissecting scissor with 30 mm cutting edge | VWR | 25870-002 | |
| Forceps 4-1/2 inch length | McKesson | 157-469 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Homogenizer, Bio-Gen PRO200 | PROScientific | 01-01200 | |
| Human apo-transferrin (apo-Tf) | Celliance | 4452-01 | no longer available, alternative: Millipore 616419 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in water | Cole-Parmer | EW-88216-36 | |
| Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100 | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Isoflurane | VETone | 502017 | |
| Isoflurane vaporizor | Summit Anesthesia Solutions | ||
| Metal heat block | Fisher Scientific | ||
| Micro centrifuge tube with flat screw-cap | VWR | 16466-064 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilized | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Nitrilotriacetic acid (NTA) | Sigma | 72560-100G | |
| Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general use | Fisher Scientific | 14-826AA | |
| pH Strips, plastic pH5.0-9.0 | Fisher Scientific | 13-640-519 | |
| Razor blades 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Scale (g) | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| Scale (mg) | Mettler Toledo | Balance XS204 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761-500G | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Sterile syringe, slip tip (1 mL) | Fisher Scientific | 309659 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-500 | |
| Software | |||
| ImageLab | Bio-Rad | ||
| SigmaPlot | Systat |
References
- Ganz, T. Systemic iron homeostasis. Physiological Reviews. 93 (4), 1721-1741 (2013).
- Aschemeyer, S., et al. Structure-function analysis of ferroportin defines the binding site and an alternative mechanism of action of hepcidin. Blood. 131 (8), 899-910 (2018).
- Sangkhae, V., Nemeth, E. Regulation of the iron homeostatic hormone hepcidin. Advances in Nutrition. 8 (1), 126-136 (2017).
- Sangkhae, V., et al. Effects of maternal iron status on placental and fetal iron homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 625-640 (2020).
- Whittaker, P. G., Lind, T., Williams, J. G. Iron absorption during normal human pregnancy: a study using stable isotopes. British Journal of Nutrition. 65 (3), 457-463 (1991).
- Whittaker, P. G., Barrett, J. F., Lind, T. The erythrocyte incorporation of absorbed non-haem iron in pregnant women. British Journal of Nutrition. 86 (3), 323-329 (2001).
- O’Brien, K. O., Zavaleta, N., Abrams, S. A., Caulfield, L. E. Maternal iron status influences iron transfer to the fetus during the third trimester of pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 77 (4), 924-930 (2003).
- Young, M. F., et al. Maternal hepcidin is associated with placental transfer of iron derived from dietary heme and nonheme sources. Journal of Nutrition. 142 (1), 33-39 (2012).
- Delaney, K. M., et al. Iron absorption during pregnancy is underestimated when iron utilization by the placenta and fetus is ignored. American Journal of Clinical Nutrition. 112 (3), 576-585 (2020).
- Klatt, K. C., Smith, E. R., Barberio, M. D. Toward a more stable understanding of pregnancy micronutrient metabolism. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 321 (2), 260-263 (2021).
- Fisher, A. L., Nemeth, E. Iron homeostasis during pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 106, 1567-1574 (2017).
- van Santen, S., et al. The iron regulatory hormone hepcidin is decreased in pregnancy: a prospective longitudinal study. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 51 (7), 1395-1401 (2013).
- Millard, K. N., Frazer, D. M., Wilkins, S. J., Anderson, G. J. Changes in the expression of intestinal iron transport and hepatic regulatory molecules explain the enhanced iron absorption associated with pregnancy in the rat. Gut. 53 (5), 655-660 (2004).
- Bothwell, T. H., Pribilla, W. F., Mebust, W., Finch, C. A. Iron metabolism in the pregnant rabbit; iron transport across the placenta. American Journal of Physiology. 193 (3), 615-622 (1958).
- Dyer, N. C., Brill, A. B., Raye, J., Gutberlet, R., Stahlman, M. Maternal-fetal exchange of 59 Fe: radiation dosimetry and biokinetics in human and sheep studies. Radiation Research. 53 (3), 488-495 (1973).
- Contractor, S. F., Eaton, B. M. Role of transferrin in iron transport between maternal and fetal circulations of a perfused lobule of human placenta. Cell Biochemistry & Function. 4 (1), 69-74 (1986).
- Baker, E., Morgan, E. H. The role of transferrin in placental iron transfer in the rabbit. Quartly Jounrnal of Experimental Physiolology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 173-186 (1969).
- Fleming, R. E., Feng, Q., Britton, R. S. Knockout mouse models of iron homeostasis. Annual Review of Nutrition. 31, 117-137 (2011).
- Soares, M. J., Varberg, K. M., Iqbal, K. Hemochorial placentation: development, function, and adaptations. Biology of Reproduction. 99 (1), 196-211 (2018).
- Jones, H. N., Powell, T. L., Jansson, T. Regulation of placental nutrient transport–a review. Placenta. 28 (8-9), 763-774 (2007).
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Takata, K., Kasahara, T., Kasahara, M., Ezaki, O., Hirano, H. Immunolocalization of glucose transporter GLUT1 in the rat placental barrier: possible role of GLUT1 and the gap junction in the transport of glucose across the placental barrier. Cell and Tissue Research. 276 (3), 411-418 (1994).
- Shin, B. C., et al. Immunolocalization of GLUT1 and connexin 26 in the rat placenta. Cell and Tissue Research. 285 (1), 83-89 (1996).
- Bastin, J., Drakesmith, H., Rees, M., Sargent, I., Townsend, A. Localisation of proteins of iron metabolism in the human placenta and liver. British Journal of Haematology. 134 (5), 532-543 (2006).
- Klausner, R. D., Ashwell, G., van Renswoude, J., Harford, J. B., Bridges, K. R. Binding of apotransferrin to K562 cells: explanation of the transferrin cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (8), 2263-2266 (1983).
- Tsunoo, H., Sussman, H. H. Characterization of transferrin binding and specificity of the placental transferrin receptor. Archives of Biochemistry and Biophysics. 225 (1), 42-54 (1983).
- Sangkhae, V., Nemeth, E. Placental iron transport: The mechanism and regulatory circuits. Free Radical Biology and Medicine. 133, 254-261 (2019).
- McCarthy, R. C., Kosman, D. J. Mechanistic analysis of iron accumulation by endothelial cells of the BBB. Biometals. 25 (4), 665-675 (2012).
- Donovan, A., et al. The iron exporter ferroportin/Slc40a1 is essential for iron homeostasis. Cell Metabolism. 1 (3), 191-200 (2005).
- Stefanova, D., et al. Endogenous hepcidin and its agonist mediate resistance to selected infections by clearing non-transferrin-bound iron. Blood. 130 (3), 245-257 (2017).
- Ramos, E., et al. Evidence for distinct pathways of hepcidin regulation by acute and chronic iron loading in mice. Hepatology. 53 (4), 1333-1341 (2011).
- Kulandavelu, S., Qu, D., Adamson, S. L. Cardiovascular function in mice during normal pregnancy and in the absence of endothelial NO synthase. Hypertension. 47 (6), 1175-1182 (2006).
- Lu, C. C., Matsumoto, N., Iijima, S. Placental transfer and body distribution of nickel chloride in pregnant mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 59 (3), 409-413 (1981).
- Gunshin, H., et al. Slc11a2 is required for intestinal iron absorption and erythropoiesis but dispensable in placenta and liver. Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1258-1266 (2005).
