Cuantificación del transporte de hierro a través de la placenta del ratón in vivo utilizando isótopos de hierro no radiactivos
Summary
Este artículo demuestra cómo preparar y administrar hierro isotópico no radiactivo unido a transferrina para estudios de transporte de hierro en el embarazo de ratón. También se describe el enfoque para cuantificar el hierro isotópico en compartimentos fetoplacentarios.
Abstract
El hierro es esencial para la salud materna y fetal durante el embarazo, con aproximadamente 1 g de hierro necesario en los seres humanos para mantener un embarazo saludable. La dotación de hierro fetal depende completamente de la transferencia de hierro a través de la placenta, y las perturbaciones de esta transferencia pueden conducir a resultados adversos del embarazo. En ratones, la medición de los flujos de hierro a través de la placenta tradicionalmente se basó en isótopos radiactivos de hierro, un enfoque altamente sensible pero oneroso. Los isótopos estables de hierro (57Fe y 58Fe) ofrecen una alternativa no radiactiva para su uso en estudios de embarazo humano.
En condiciones fisiológicas, el hierro unido a transferrina es la forma predominante de hierro absorbido por la placenta. Por lo tanto, 58Fe-transferrina se preparó e inyectó por vía intravenosa en madres embarazadas para evaluar directamente el transporte de hierro placentario y evitar la absorción intestinal materna de hierro como una variable de confusión. El hierro isotópico se cuantificó en la placenta y los tejidos embrionarios de ratón mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). Estos métodos también se pueden emplear en otros sistemas modelo animales de fisiología o enfermedad para cuantificar la dinámica del hierro in vivo .
Introduction
El hierro es crítico para diversos procesos metabólicos, incluyendo el crecimiento y el desarrollo, la producción de energía y el transporte de oxígeno1. El mantenimiento de la homeostasis del hierro es un proceso dinámico y coordinado. El hierro se absorbe de los alimentos en el duodeno y se transporta por todo el cuerpo en la circulación unida a la proteína transportadora de hierro transferrina (Tf). Es utilizado por cada célula para procesos enzimáticos, incorporado a la hemoglobina en eritrocitos nacientes, y reciclado de eritrocitos envejecidos por macrófagos. El hierro se almacena en el hígado cuando está en exceso y se pierde del cuerpo a través de hemorragia o desprendimiento celular. La cantidad de hierro en circulación es el resultado del equilibrio entre el consumo y el suministro de hierro, este último estrechamente regulado por la hormona hepática hepcidina (HAMP), el regulador central de la homeostasis del hierro1. La hepcidina funciona para limitar la biodisponibilidad del hierro en la sangre al ocluir o inducir ubiquitinación y degradar el ferroportina exportadora de hierro (FPN)2. La reducción de la FPN funcional conduce a una disminución de la absorción de hierro en la dieta, el secuestro de hierro en el hígado y la disminución del reciclaje de hierro de los macrófagos1.
La hepcidina está regulada por el estado del hierro, la inflamación, el impulso eritropoyético y el embarazo (revisado en 3). Dado que la homeostasis del hierro es altamente dinámica, es importante comprender y medir la reserva total de hierro y la distribución y rotación del hierro. Los estudios en animales tradicionalmente se basaban en isótopos radiactivos de hierro, un enfoque altamente sensible pero oneroso para medir la dinámica del hierro. Sin embargo, en estudios más recientes, incluyendo el estudio presentado aquí4, se utilizan isótopos de hierro estables y no radiactivos (58Fe) para medir el transporte de hierro durante el embarazo 5,6,7,8,9. Los isótopos estables son herramientas valiosas para estudiar el metabolismo de los nutrientes (revisado en 10). El uso de isótopos estables de hierro en estudios en humanos demostró que i) la absorción de hierro aumenta hacia el final de la gestación5,6, ii) la transferencia de hierro en la dieta al feto depende del estado de hierro materno7, iii) el hierro hemo ingerido maternamente es más fácilmente incorporado por el feto que el hierro no hemo 8, y iv) la transferencia de hierro al feto se correlaciona negativamente con los niveles de hepcidina materna 8, 9. Estos experimentos midieron isótopos de hierro en sueros o su incorporación en glóbulos rojos; sin embargo, la medición del hierro incorporado en los glóbulos rojos por sí sola puede subestimar la verdadera absorción de hierro9. En el estudio actual, tanto el hierro hemo como el no hemo se miden en los tejidos.
Durante el embarazo, el hierro es necesario para apoyar la expansión del volumen de glóbulos rojos maternos y para la transferencia a través de la placenta para apoyar el crecimiento y desarrollo del feto11. La dotación de hierro fetal depende totalmente del transporte de hierro a través de la placenta. Durante el embarazo humano 12 y roedor 4,13, los niveles de hepcidina disminuyen drásticamente, aumentando la disponibilidad de hierro plasmático para la transferencia al feto.
Los fundamentos del transporte de hierro placentario se caracterizaron inicialmente en los años 1950-70 utilizando trazadores radiactivos (59Fe y 55Fe). Estos estudios determinaron que el transporte de hierro a través de la placenta es unidireccional 14,15 y que la transferrina diférrica es una fuente importante de hierro para la placenta y el feto 16,17. La comprensión actual del transporte de hierro placentario es más completa, aunque algunos transportadores de hierro clave y mecanismos reguladores siguen siendo desconocidos. Los modelos de ratón han sido esenciales para comprender la regulación y el transporte del hierro18 porque los transportadores y mecanismos clave son notablemente similares. Tanto la placenta humana como la del ratón son hemocoriales, es decir, la sangre materna está en contacto directo con el corion fetal19. Sin embargo, hay algunas diferencias estructurales notables.
El sincitiotrofoblasto es la capa celular placentaria que separa la circulación materna y fetal y transporta activamente hierro y otros nutrientes20. En los seres humanos, el sincitiotrofoblasto es una sola capa de células fusionadas. En contraste, la placenta del ratón consiste en dos capas21 de sincitiotrofoblasto, Syn-I y Syn-II. Sin embargo, las uniones de brecha en la interfaz de Syn-I y Syn-II permiten la difusión de nutrientes entre las capas22,23. Por lo tanto, estas capas funcionan como una sola capa sincitial similar al sincitiotrofoblasto humano. Las similitudes y diferencias adicionales entre la placenta humana y la de ratón son revisadas por Rossant y Cross21. El transporte placentario de hierro es desencadenado por la unión de hierro-Tf de la sangre materna al receptor de transferrina (TfR1) localizado en el lado apical del sincitiotrofoblasto24. Esa interacción induce la internalización hierro-Tf/TfR1 por vía endocitosis mediada por clatrina25. El hierro se libera de Tf en el endosomaácido 26, se reduce a hierro ferroso por una ferrireductasa indeterminada, y se exporta del endosoma al citoplasma por un transportador aún por determinar. También queda por describir cómo se acompaña el hierro dentro del sincitiotrofoblasto. El hierro es finalmente transportado al lado fetal por el exportador de hierro, FPN, localizado en la superficie basal o fetal del sincitiotrofoblasto (revisado en27).
Para comprender cómo la regulación fisiológica y patológica de TfR1, FPN y hepcidina afecta el transporte de hierro placentario, se utilizaron isótopos estables de hierro para cuantificar el transporte de hierro desde la circulación materna hasta la placenta y el embrión in vivo4. Este artículo presenta los métodos para preparar y administrar transferrina de hierro isotópica a ratones preñados, procesamiento de tejidos para ICP-MS y cálculo de concentraciones de hierro en tejidos. El uso de isótopos estables de hierro in vivo se puede adaptar para investigar la regulación y distribución del hierro en diferentes modelos animales para investigar la regulación fisiológica y patológica del hierro.
Protocol
Representative Results
Discussion
El hierro es importante para muchos procesos biológicos, y su movimiento y distribución dentro del cuerpo son altamente dinámicos y regulados. Los isótopos estables de hierro proporcionan una alternativa consistente y conveniente a los isótopos radiactivos para la evaluación de la dinámica de la homeostasis del hierro. Un paso crítico en el protocolo es realizar un seguimiento de todos los pesos y volúmenes de los tejidos. El hierro es un elemento y, por lo tanto, no se puede sintetizar ni descomponer. Por lo ta…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen el uso de la instalación ICP-MS dentro del Centro de Implicaciones Ambientales de la Nanotecnología de la UC en CNSI en UCLA por su asistencia con la optimización del protocolo para mediciones de 58Fe. El estudio fue apoyado por el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK) de los NIH (K01DK127004, a VS) y el Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano (NICHD) de los NIH (R01HD096863, a EN).
Materials
| 58Fe-iron metal | Trace Sciences International | Fe-58 | |
| Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC903024 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Millipore Sigma | CLS430829 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002432 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend RT | |||
| Delicate task wipers | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Diet: iron-deficient (4 ppm iron) | Envigo Teklad | TD.80396 | |
| Diet: standard chow (185 ppm iron) | PicoLab | 5053 | |
| Dissecting scissor with 30 mm cutting edge | VWR | 25870-002 | |
| Forceps 4-1/2 inch length | McKesson | 157-469 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Homogenizer, Bio-Gen PRO200 | PROScientific | 01-01200 | |
| Human apo-transferrin (apo-Tf) | Celliance | 4452-01 | no longer available, alternative: Millipore 616419 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in water | Cole-Parmer | EW-88216-36 | |
| Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100 | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Isoflurane | VETone | 502017 | |
| Isoflurane vaporizor | Summit Anesthesia Solutions | ||
| Metal heat block | Fisher Scientific | ||
| Micro centrifuge tube with flat screw-cap | VWR | 16466-064 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilized | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Nitrilotriacetic acid (NTA) | Sigma | 72560-100G | |
| Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general use | Fisher Scientific | 14-826AA | |
| pH Strips, plastic pH5.0-9.0 | Fisher Scientific | 13-640-519 | |
| Razor blades 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Scale (g) | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| Scale (mg) | Mettler Toledo | Balance XS204 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761-500G | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Sterile syringe, slip tip (1 mL) | Fisher Scientific | 309659 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-500 | |
| Software | |||
| ImageLab | Bio-Rad | ||
| SigmaPlot | Systat |
References
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