Ein markierungsfreier Segmentierungsansatz für die intravitale Bildgebung von Brusttumor-Mikroumgebungen

Summary

Das hier beschriebene intravitale Bildgebungsverfahren nutzt die zweite harmonische Kollagenerzeugung und die endogene Fluoreszenz aus dem metabolischen Co-Faktor NAD(P)H, um eine nicht markierte Tumormikroumgebung nicht-invasiv in Tumor-, Stroma- und Gefäßkompartimente für eine eingehende Analyse von intravitalen 4D-Bildern zu segmentieren.

Abstract

Die Fähigkeit, komplexe und dynamische physiologische Interaktionen zwischen zahlreichen Zelltypen und der extrazellulären Matrix (ECM) innerhalb einer lebenden Tumormikroumgebung zu visualisieren, ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis von Mechanismen, die das Fortschreiten von Tumoren regulieren. Während dies durch aktuelle intravitale Bildgebungsverfahren erreicht werden kann, bleibt es aufgrund der heterogenen Natur der Gewebe und der Notwendigkeit eines räumlichen Kontexts innerhalb der experimentellen Beobachtung eine Herausforderung. Zu diesem Zweck haben wir einen intravitalen Bildgebungs-Workflow entwickelt, der Kollagen-Bildgebung der zweiten harmonischen Generation, endogene Fluoreszenz aus dem metabolischen Co-Faktor NAD (P) H und Fluoreszenz-Lifetime-Imaging-Mikroskopie (FLIM) kombiniert, um die Tumormikroumgebung nicht-invasiv in grundlegende Domänen des Tumornestes, des umgebenden Stromas oder ECM und des Gefäßsystems zu unterteilen. Dieses nicht-invasive Protokoll beschreibt den schrittweisen Prozess, der von der Aufnahme von Zeitrafferbildern von Brusttumormodellen bis hin zur Nachbearbeitungsanalyse und Bildsegmentierung reicht. Der Hauptvorteil dieses Workflows besteht darin, dass er metabolische Signaturen nutzt, um die sich dynamisch verändernde Mikroumgebung von lebenden Tumoren ohne die Verwendung exogener fluoreszierender Markierungen zu kontextualisieren, was ihn für PDX-Modelle (Human Patient-derived Xenograft) und den zukünftigen klinischen Einsatz, bei dem extrinsische Fluorophore nicht ohne weiteres anwendbar sind, vorteilhaft macht.

Introduction

Es ist bekannt, dass die extrazelluläre Matrix (ECM) in der Tumormikroumgebung von mehreren Zelltypen dynamisch abgelagert und ummodelliert wird, um das Fortschreiten der Krankheit weiter zu erleichtern ^1,2,3. Diese Matrixveränderungen liefern sowohl mechanische als auch biologische Hinweise, die das Zellverhalten verändern und oft zu einem kontinuierlichen Zyklus der Matrixumgestaltung^{führen 4}. Die Untersuchung des dynamischen, wechselseitigen Zusammenspiels zwischen Tumorzellen und der extrazellulären Matrix erfolgt häufig mittels dreidimensionaler (3D) In-vitro-Kultur oder mikrofluidischer Systeme. Während diese Bottom-up-Ansätze Mechanismen der ECM-Remodellierung ^5,6,7, der erhöhten Proliferation 8, des epithelialen zu mesenchymalen Übergangs ^9,10,11,12 und der Tumorzellmigration und -invasion^{7,13,14,15,16} gezeigt haben lag ihr Fokus in erster Linie auf einigen wenigen Zelltypen (z. B. Tumorzellen oder Fibroblasten) innerhalb einer homogenen 3D-Matrix im Vergleich zur Vielfalt und Heterogenität der Interaktionen innerhalb eines physiologischen Gewebes. Neben In-vitro-Systemen kann auch die Ex-vivo-Tumorhistologie einen Einblick in diese Zell-Zell- und Zell-ECM-Interaktionen^{geben 17}. Die Immunhistochemie hat den Vorteil, dass sie mehrere Zelltypen in Bezug auf die räumlich heterogene Zusammensetzung und Architektur der EZM analysieren kann, aber die statischen Endpunkte von fixiertem Gewebe erfassen nicht die dynamische Natur der Wechselwirkungen zwischen Zellen und der Mikroumgebung. Die intravitale Bildgebung hat die Tür geöffnet, um vielfältige und dynamische Interaktionen im physiologischen Kontext der nativen Tumormikroumgebung zu hinterfragen.

Die Fähigkeiten der intravitalen Tumorbildgebung entwickeln sich rasant weiter. Verbesserungen im Design von Bildgebungsfenstern und chirurgischen Techniken zur Implantation der Fenster haben eine langfristige longitudinale Tumorbildgebung an einer Vielzahl von anatomischen Stellen (d.h. Primärtumor, Lymphknoten, metastasierende Stellen^18,19,20) ermöglicht. Darüber hinaus wird die Fähigkeit optischer Instrumente, Daten in mehreren Dimensionen (d. h. spektrale, räumliche Fluoreszenzintensität und Lebensdauer) sowie mit hoher Auflösung und Geschwindigkeit (Videorate) zu visualisieren und zu sammeln, immer zugänglicher. Die verbesserte Technologie bietet die Möglichkeit, schnelle Veränderungen der Zellsignalisierung und der phänotypischen Dynamik in einer physiologischen Umgebung zu untersuchen. Schließlich ermöglichen die Erweiterung optogenetischer Werkzeuge und die breite Palette genetischer Fluoreszenzkonstrukte die Markierung spezifischer Zelltypen, um die Zellmigration in der Tumormikroumgebung oder die Zelllinienverfolgung während der Entwicklung oder des Krankheitsverlaufs zu erfassen^21,22. Der Einsatz dieser Werkzeuge in Kombination mit der CRISPR/Cas9-Technologie bietet Forschern die Möglichkeit, zeitnah einzigartige Tiermodelle zu generieren.

Während all diese Fortschritte die intravitale Bildgebung zu einer immer leistungsfähigeren Methode zur Erforschung dynamischer und physiologischer zellulärer Interaktionen machen, besteht immer noch ein wichtiger Bedarf, Strategien zu entwickeln, die diesen biologischen Interaktionen einen räumlichen, zeitlichen und strukturellen Kontext auf Gewebeebene bieten. Derzeit kompensieren viele intravitale Bildgebungsstudien den Mangel an visuellen Landmarken wie Blutgefäßen, indem sie fluoreszierende Farbstoffe in das Gefäßsystem injizieren oder Mausmodelle verwenden, die exogen fluoreszierende Proteine exogen exprimieren, um physikalische Merkmale abzugrenzen. Injizierbare Farbstoffe und Substrate wie fluoreszierendes Dextrans werden breit eingesetzt, um das Gefäßsystem in intravitalen Sammlungen^{19, 23, 24} erfolgreich zu beschriften. Dieser Ansatz ist jedoch nicht ohne Einschränkungen. Zum einen erfordert es zusätzliche Mausmanipulationen und sein Nutzen beschränkt sich auf kurzfristige Experimente. Für Längsschnittstudien kann fluoreszierendes Dextran problematisch sein, da wir die Ansammlung von Dextran in phagozytären Zellen oder die Diffusion in das umgebende Gewebe im Laufe der Zeit beobachten²⁵. Die exogene fluoreszierende Proteinintegration in das Mausmodell wurde als Alternative zu fluoreszierendem Dextrans vorgestellt, weist jedoch eigene Einschränkungen auf. Die Verfügbarkeit und Vielfalt exogener Fluorophore in Mausmodellen ist immer noch begrenzt und teuer in der Herstellung. Darüber hinaus sind genetische Manipulationen in bestimmten Modellen, wie z. B. PDX-Modellen, nicht wünschenswert oder möglich. Es wurde auch gezeigt, dass das Vorhandensein von fluoreszierenden oder biolumineszierenden Proteinen in Zellen innerhalb der Maus als fremd erkannt wird, und in immunkompetenten Mausmodellen reduziert dies die Menge an Metastasen aufgrund der Reaktion des Immunsystems des Wirts^26,27. Schließlich belegen exogene fluoreszierende Proteine oder fluoreszierende Farbstoffe, die für den räumlichen Kontext oder zur Segmentierung nachfolgender Daten verwendet werden, häufig Primbereiche des Lichtspektrums, die sonst zur Untersuchung der physiologischen Wechselwirkungen von Interesse verwendet werden könnten.

Die Verwendung des intrinsischen Signals aus dem ECM oder der endogenen Fluoreszenz von Zellen innerhalb des Gewebes stellt ein potenzielles universelles markierungsfreies Mittel zur Segmentierung intravitaler Daten für eine eingehendere zelluläre und räumliche Analyse dar. Die zweite harmonische Generation (SHG) wird seit langem zur Visualisierung des ECM²⁸ verwendet. Mit der anschließenden Entwicklung wichtiger Werkzeuge zur Charakterisierung der Faserorganisation 29,30,31 ist es möglich^, das Zellverhalten relativ zur lokalen ECM-Struktur zu charakterisieren. Darüber hinaus bietet die Autofluoreszenz des endogenen Metaboliten NAD(P)H ein weiteres markierungsfreies Werkzeug, um die Tumormikroumgebung in vivo zu kompartimentieren. NAD(P)H fluoresziert hell in Tumorzellen und kann verwendet werden, um die Grenzen des wachsenden Tumornestes von seinem umgebenden Stroma^21,32 zu unterscheiden. Schließlich ist das Gefäßsystem eine wichtige physiologische Struktur in der Tumormikroumgebung und der Ort der wichtigsten zelltypspezifischen Interaktionen^33,34,35. Die Anregung von roten Blutkörperchen (RBC) oder Blutplasma wurde verwendet, um das Tumorgefäßsystem sichtbar zu machen, und unter Verwendung der Zwei- oder Drei-Photonen-Anregung (2P; 3P) hat sich die Messung der Blutflussraten als möglich^{erwiesen 36}. Während größere Blutgefäße jedoch leicht durch ihre endogenen Fluoreszenzsignaturen identifizierbar sind, erfordert die Identifizierung subtiler, variabler und weniger fluoreszierender kleiner Blutgefäße mehr Fachwissen. Diese inhärenten Schwierigkeiten behindern eine optimale Bildsegmentierung. Glücklicherweise können diese Quellen der endogenen Fluoreszenz (d. H. Rote Blutkörperchen und Blutplasma) auch durch Fluoreszenzlebensdauerbildgebung³⁷ gemessen werden, die die einzigartigen photophysikalischen Eigenschaften des Gefäßsystems nutzt und eine nützliche Ergänzung der wachsenden intravitalen Toolbox darstellt.

In diesem Protokoll wird ein Workflow zur Segmentierung der vierdimensionalen (4D) intravitalen Bildgebung beschrieben, der explizit intrinsische Signale wie endogene Fluoreszenz und SHG von der Erfassung bis zur Analyse verwendet. Dieses Protokoll ist besonders relevant für Längsschnittstudien durch ein Brustbildgebungsfenster, in dem exogene Fluoreszenz möglicherweise nicht praktikabel oder möglich ist, wie dies bei PDX-Modellen der Fall ist. Die hier beschriebenen Segmentierungsprinzipien sind jedoch weitgehend auf intravitale Anwender anwendbar, die Tumorbiologie, Gewebeentwicklung oder sogar normale Gewebephysiologie untersuchen. Die berichtete Suite von Analyseansätzen wird es den Benutzern ermöglichen, das zelluläre Verhalten zwischen Regionen ausgerichteter oder zufälliger Kollagenfaserkonfigurationen zu unterscheiden, die Anzahl oder das Verhalten von Zellen zu vergleichen, die sich in bestimmten Regionen der Tumormikroumgebung befinden, und das Gefäßsystem der Tumormikroumgebung zuzuordnen, wobei nur markierungsfreie oder intrinsische Signale verwendet werden. Zusammen schaffen diese Methoden einen operativen Rahmen für die Maximierung der Informationstiefe aus der intravitalen 4D-Bildgebung der Brustdrüse bei gleichzeitiger Minimierung des Bedarfs an zusätzlichen exogenen Markierungen.

Protocol

Alle beschriebenen Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Wisconsin-Madison genehmigt. Das Wohlbefinden und die Schmerztherapie in allen Tierversuchen stehen im Vordergrund. Daher werden alle Anstrengungen unternommen, um sicherzustellen, dass sich das Tier bei jedem Schritt des Eingriffs wohl fühlt und gut versorgt ist. 1. Generierung des Mammary Imaging Window (MIW) Um das Brustbildgebungsfenster zu konstruieren, ferti…

Representative Results

Die Installation des MIW und die grundlegende experimentelle Planung sind die ersten Schritte in diesem Prozess. Dieses spezielle MIW-Design und -Protokoll sind für Längsschnittstudienbesser geeignet 19 und wurden sowohl mit aufrechten als auch mit inversen Mikroskopen erfolgreich eingesetzt. In diesem Fall wurde ein inverses Mikroskop verwendet, da dies zu einer größeren Bildstabilität der Brustdrüse mit weniger Atemartefakten geführt hat. In Abbildung 1A stel…

Discussion

Die intravitale 4D-Bildgebung ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung dynamischer physiologischer Wechselwirkungen im räumlichen und zeitlichen Kontext der nativen Tumormikroumgebung. Dieses Manuskript bietet einen sehr grundlegenden und anpassungsfähigen Betriebsrahmen, um dynamische Zellinteraktionen innerhalb der Tumormasse, des benachbarten Stromas oder in der Nähe des Gefäßnetzwerks zu unterteilen, wobei nur endogene Signale aus der zweiten harmonischen Erzeugung oder der NAD(P)H-Autofluoreszenz ver…

Materials

#1.5 12mm round cover glass	Warner Instruments	# 64-0712	MIW construction
1.0 mL syringe for SQ injection	BD	309659	Syringe
20x objective	Zeiss	421452-988	Water immersion
27G needle for SQ injection	Covidien	1188827012	Needle
40x objective	Nikon	MRD77410	Water immersion
5-0 silk braided suture	Ethicon	K870	Suture for MIW implantation
Artificial tears gel	Akorn	NDC 59399-162-35	Eye gel
Betadine solution, 5%	Fisher Scientific	NC1558063	Surgery antiseptic
cotton-tipped applicator	Fisher Scientific	23-400-101
Cyanoacrylate adhesive	Loctite	1365882	MIW construction
fluorescent dextran	Sigma	T1287-50mg	intravenous labelling of vasculature
forceps	Mckesson.com	Miltex #18-782	stainless, 4 inch, curved
GaAsP photomultiplier tube	Hamamatsu
heating blanket	CARA 72 heating pad	038056000729	Temperature selectable
heating chamber	home built
Fluorescent lifetime handbook	Becker and Hickl		https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
inverted microscope base	Nikon
Isoflurane	Akorn	NDC 59399-106-01	Anesthesia
Liqui-Nox	Fisher Scientific	16-000-125	MIW cleaning
Meloxicam	Norbrook	NDC 55529-040-10	Analgesic
Micro Hose	Scientific Commodities INC.	BB31695-PE/1
multiphoton scan head	Bruker Ultima II		Multiphoton scanhead and imaging platform
NADH FLIM filter	Chroma	284994	ET 440/80 m-2P
Nair	CVS	339826	Depilatory cream
objective heater	Tokai Hit	STRG-WELSX-SET
SHG/FAD filter	Chroma	320740	ET450/40m-2P
Sparkle glass cleaner	Amazon.com	B00814ME24	Glass Cleaner for implanted MIW
SPC-150 photon counting board	Becker and Hickl
surgical light	FAJ	B06XV1VQVZ	Magnetic LED gooseneck light
surgical micro-scissors	Excelta	366	stainless, 3 inch
Triple antibiotic ointment	Actavis Pharma	NDC 0472-0179-34	Antibiotic
TV catheter	Custom	BD 30G needle: 305106	Catheter for TV injection
Two photon filter	Chroma	320282	ET585/65m-2P
two-photon laser	Coherent charmeleon		Tunable multiphoton laser
ultrasound gel	Parker	PKR-03-02	Water immersion gel
Urea crystals	Sigma	U5128-5G	Optional: FLIM IRF