Подход к сегментации без меток для прижизненной визуализации микроокружения опухоли молочной железы

Summary

Описанный здесь метод прижизненной визуализации использует вторую гармоническую генерацию коллагена и эндогенную флуоресценцию от метаболического кофактора NAD(P)H до неинвазивного сегментирования немаркированного микроокружения опухоли в опухолевые, стромальные и сосудистые компартменты для углубленного анализа 4D-прижизненных изображений.

Abstract

Способность визуализировать сложные и динамические физиологические взаимодействия между многочисленными типами клеток и внеклеточным матриксом (ECM) в микроокружении живой опухоли является важным шагом на пути к пониманию механизмов, которые регулируют прогрессирование опухоли. Хотя это может быть достигнуто с помощью современных методов прижизненной визуализации, это остается сложным из-за гетерогенной природы тканей и необходимости пространственного контекста в рамках экспериментального наблюдения. С этой целью мы разработали рабочий процесс прижизненной визуализации, который сочетает в себе визуализацию коллагена второй гармонической генерации, эндогенную флуоресценцию из метаболического кофактора NAD(P)H и флуоресцентную пожизненную визуализационную микроскопию (FLIM) в качестве средства неинвазивного разделения микроокружения опухоли на основные домены опухолевого гнезда, окружающей стромы или ECM и сосудистой системы. Этот неинвазивный протокол детализирует пошаговый процесс, начиная от получения покадровых изображений моделей опухолей молочной железы до постобработочного анализа и сегментации изображений. Основным преимуществом этого рабочего процесса является то, что он использует метаболические сигнатуры для контекстуализации динамически изменяющегося микроокружения живой опухоли без использования экзогенных флуоресцентных меток, что делает его выгодным для моделей ксенотрансплантата (PDX), полученных от пациентов, и будущего клинического использования, где внешние флуорофоры не всегда применимы.

Introduction

Известно, что внеклеточный матрикс (ECM) в микроокружении опухоли динамически депонируется и ремоделируется несколькими типами клеток для дальнейшего облегчения прогрессирования заболевания ^1,2,3. Эти изменения матрицы обеспечивают как механические, так и биологические сигналы, которые изменяют поведение клеток и часто приводят к непрерывному циклу ремоделирования^{матрицы 4}. Исследование динамического, реципрокного взаимодействия между опухолевыми клетками и внеклеточным матриксом часто проводится с использованием трехмерной (3D) культуры in vitro или микрофлюидных систем. В то время как эти подходы снизу вверх продемонстрировали механизмы ремоделирования ECM ^5,6,7, увеличения пролиферации⁸, эпителиального перехода в мезенхимальное ^9,10,11,12 и миграции и инвазии опухолевых клеток 7,13,14,15,16 , их внимание было сосредоточено в основном на нескольких типах клеток (например, опухолевых клетках или фибробластах) в однородной 3D-матрице по сравнению с разнообразием и неоднородностью взаимодействий, присутствующих в физиологической ткани. В дополнение к системам in vitro, гистология опухоли ex vivo также может дать некоторое представление об этих взаимодействиях клетка-клетка и клетка-ECM¹⁷. Иммуногистохимия имеет то преимущество, что может анализировать несколько типов клеток относительно пространственно неоднородного состава и архитектуры ECM, но статические конечные точки фиксированной ткани не отражают динамический характер взаимодействий между клетками и микросредой. Прижизненная визуализация открыла дверь для изучения разнообразных и динамических взаимодействий в физиологическом контексте микроокружения нативной опухоли.

Возможности прижизненной визуализации опухоли быстро развиваются. Усовершенствования в конструкции окон визуализации и хирургические методы имплантации окон позволили проводить долгосрочную продольную визуализацию опухоли в различных анатомических местах (т.е. первичная опухоль, лимфатические узлы, метастатические участки 18,19,20). Кроме того, способность оптических приборов визуализировать и собирать данные в нескольких измерениях (т.е. спектральных, пространственных флуоресцентных интенсивностях и сроке службы), а также при высоком разрешении и скорости (скорости видео) становится широко доступной. Усовершенствованная технология дает возможность исследовать быстрые изменения клеточной сигнализации и фенотипической динамики в физиологической среде. Наконец, расширение оптогенетических инструментов и широкий спектр генетических флуоресцентных конструкций позволяют маркировать конкретные типы клеток для захвата миграции клеток в микроокружении опухоли или отслеживания клеточной линии во время развития или прогрессирования заболевания^21,22. Использование этих инструментов в сочетании с технологией CRISPR/Cas9 дает исследователям возможность своевременно генерировать уникальные модели животных.

Хотя все эти достижения делают прижизненную визуализацию все более мощным методом изучения динамических и физиологических клеточных взаимодействий, по-прежнему существует важная необходимость в разработке стратегий, которые обеспечивают пространственный, временный и структурный контекст на тканевом уровне для этих биологических взаимодействий. В настоящее время многие исследования прижизненной визуализации компенсируют отсутствие визуальных ориентиров, таких как кровеносные сосуды, путем введения флуоресцентных красителей в сосудистую систему или использования мышиных моделей, которые экзогенно экспрессируют флуоресцентные белки для очерчивания физических особенностей. Инъекционные красители и субстраты, такие как флуоресцентный декстранс, широко используются для успешной маркировки сосудистой системы в прижизненных коллекциях^{19, 23, 24}. Однако такой подход не лишен ограничений. Во-первых, он требует дополнительных манипуляций с мышью, и его полезность ограничена краткосрочными экспериментами. Для продольных исследований флуоресцентный декстран может быть проблематичным, поскольку мы наблюдаем накопление декстрана в фагоцитарных клетках или диффузию в окружающие ткани с течением времени²⁵. Включение экзогенного флуоресцентного белка в модель мыши было представлено в качестве альтернативы флуоресцентному декстрансу, но имеет свои собственные ограничения. Доступность и разнообразие экзогенных флуорофоров в мышиных моделях по-прежнему ограничены и дороги в создании. Кроме того, в конкретных моделях, таких как модели PDX, генетические манипуляции нежелательны или невозможны. Также было показано, что присутствие флуоресцентных или биолюминесцентных белков в клетках распознается как чужеродное внутри мыши, а в иммунокомпетентных мышиных моделях это уменьшает количество метастазов из-за реакции иммунной системы хозяина^26,27. Наконец, экзогенные флуоресцентные белки или флуоресцентные красители, используемые для пространственного контекста или для сегментации последующих данных, часто занимают основные диапазоны светового спектра, которые в противном случае могли бы быть использованы для исследования физиологических взаимодействий, представляющих интерес.

Использование внутреннего сигнала от ECM или эндогенной флуоресценции от клеток внутри ткани представляет собой потенциальное универсальное средство без меток для сегментации прижизненных данных для более глубокого клеточного и пространственного анализа. Второе поколение гармоник (SHG) уже давно используется для визуализации ECM²⁸. С последующей разработкой важных инструментов, помогающих в характеристике организации волокон 29,30,31, можно охарактеризовать поведение клеток относительно локальной структуры ECM. Кроме того, аутофлуоресценция из эндогенного метаболита NAD(P)H обеспечивает еще один инструмент без меток для разделения микроокружения опухоли in vivo. NAD(P)H ярко флуоресцирует в опухолевых клетках и может быть использован для различения границ растущего опухолевого гнезда от окружающей его^{стромы 21,32}. Наконец, сосудистая система является важной физиологической структурой в микроокружении опухоли и местом ключевых клеточных специфических взаимодействий 33,34,35. Возбуждение эритроцитов (эритроцитов) или плазмы крови было использовано для визуализации сосудистой системы опухоли, и с помощью двух- или трехфотонного возбуждения (2P; 3P) было показано, что измерение скорости кровотока возможно³⁶. Однако, в то время как более крупные кровеносные сосуды легко идентифицируются по их эндогенным флуоресцентным сигнатурам, идентификация тонких, переменных и менее флуоресцентных мелких кровеносных сосудов требует большего опыта. Эти неотъемлемые трудности препятствуют оптимальной сегментации изображения. К счастью, эти источники эндогенной флуоресценции (т.е. эритроциты и плазма крови) также могут быть измерены с помощью флуоресцентной визуализации³⁷, которая извлекает выгоду из уникальных фотофизических свойств сосудистой системы и представляет собой полезное дополнение к растущему набору инструментов прижизненного нерва.

В этом протоколе описан рабочий процесс сегментации четырехмерной (4D) прижизненной визуализации с явным использованием внутренних сигналов, таких как эндогенная флуоресценция и SHG, от сбора до анализа. Этот протокол особенно актуален для продольных исследований через окно визуализации молочной железы, где экзогенная флуоресценция может быть непрактичной или невозможной, как в случае с моделями PDX. Однако принципы сегментации, изложенные здесь, широко применимы к прижизненным пользователям, изучающим биологию опухоли, развитие тканей или даже нормальную физиологию тканей. Представленный набор подходов к анализу позволит пользователям дифференцировать клеточное поведение между областями выровненных или случайных конфигураций коллагеновых волокон, сравнивать количество или поведение клеток, проживающих в определенных областях микроокружения опухоли, и сопоставлять сосудистую систему с микроокружением опухоли, используя только безмечажный или внутренний сигнал. Вместе эти методы создают операционную основу для максимизации глубины информации, получаемой от 4D-прижизненной визуализации молочной железы, сводя к минимуму необходимость в дополнительных экзогенных метках.

Protocol

Все описанные эксперименты были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Висконсин-Мэдисон. Благополучие и лечение боли во всех экспериментах на животных имеет первостепенное значение. Таким образом, прилагаются все усилия, чтобы убедить?…

Representative Results

Установка MIW и базовое экспериментальное планирование являются первыми шагами в этом процессе. Эта конкретная конструкция и протокол MIW более поддаются продольным исследованиям19 и успешно используются как с вертикальными, так и с инвертированными микроскопами. В этом слу…

Discussion

4D-прижизненная визуализация является мощным инструментом для исследования динамических физиологических взаимодействий в пространственном и временном контексте микроокружения нативной опухоли. Эта рукопись обеспечивает очень простую и адаптируемую операционную структуру для разд…

Materials

#1.5 12mm round cover glass	Warner Instruments	# 64-0712	MIW construction
1.0 mL syringe for SQ injection	BD	309659	Syringe
20x objective	Zeiss	421452-988	Water immersion
27G needle for SQ injection	Covidien	1188827012	Needle
40x objective	Nikon	MRD77410	Water immersion
5-0 silk braided suture	Ethicon	K870	Suture for MIW implantation
Artificial tears gel	Akorn	NDC 59399-162-35	Eye gel
Betadine solution, 5%	Fisher Scientific	NC1558063	Surgery antiseptic
cotton-tipped applicator	Fisher Scientific	23-400-101
Cyanoacrylate adhesive	Loctite	1365882	MIW construction
fluorescent dextran	Sigma	T1287-50mg	intravenous labelling of vasculature
forceps	Mckesson.com	Miltex #18-782	stainless, 4 inch, curved
GaAsP photomultiplier tube	Hamamatsu
heating blanket	CARA 72 heating pad	038056000729	Temperature selectable
heating chamber	home built
Fluorescent lifetime handbook	Becker and Hickl		https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
inverted microscope base	Nikon
Isoflurane	Akorn	NDC 59399-106-01	Anesthesia
Liqui-Nox	Fisher Scientific	16-000-125	MIW cleaning
Meloxicam	Norbrook	NDC 55529-040-10	Analgesic
Micro Hose	Scientific Commodities INC.	BB31695-PE/1
multiphoton scan head	Bruker Ultima II		Multiphoton scanhead and imaging platform
NADH FLIM filter	Chroma	284994	ET 440/80 m-2P
Nair	CVS	339826	Depilatory cream
objective heater	Tokai Hit	STRG-WELSX-SET
SHG/FAD filter	Chroma	320740	ET450/40m-2P
Sparkle glass cleaner	Amazon.com	B00814ME24	Glass Cleaner for implanted MIW
SPC-150 photon counting board	Becker and Hickl
surgical light	FAJ	B06XV1VQVZ	Magnetic LED gooseneck light
surgical micro-scissors	Excelta	366	stainless, 3 inch
Triple antibiotic ointment	Actavis Pharma	NDC 0472-0179-34	Antibiotic
TV catheter	Custom	BD 30G needle: 305106	Catheter for TV injection
Two photon filter	Chroma	320282	ET585/65m-2P
two-photon laser	Coherent charmeleon		Tunable multiphoton laser
ultrasound gel	Parker	PKR-03-02	Water immersion gel
Urea crystals	Sigma	U5128-5G	Optional: FLIM IRF