En etikettfri segmenteringsmetod för intravital avbildning av brösttumörmikromiljö

Summary

Den intravitala avbildningsmetoden som beskrivs här använder kollagen andra harmoniska generationen och endogen fluorescens från den metaboliska samfaktorn NAD (P) H för att icke-invasivt segmentera en omärkt tumörmikromiljö i tumör-, stromala och vaskulära fack för djupgående analys av 4D-intravitala bilder.

Abstract

Förmågan att visualisera komplexa och dynamiska fysiologiska interaktioner mellan många celltyper och den extracellulära matrisen (ECM) inom en levande tumörmikromiljö är ett viktigt steg mot att förstå mekanismer som reglerar tumörprogression. Även om detta kan åstadkommas genom nuvarande intravitala avbildningstekniker, är det fortfarande utmanande på grund av vävnadernas heterogena natur och behovet av rumsligt sammanhang inom den experimentella observationen. För detta ändamål har vi utvecklat ett intravitalt bildarbetsflöde som parar kollagen andra harmoniska generationens bildbehandling, endogen fluorescens från den metaboliska samfaktorn NAD (P) H och fluorescens livstidsavbildningsmikroskopi (FLIM) som ett sätt att icke-invasivt dela upp tumörmikromiljön i grundläggande domäner i tumörboet, den omgivande stroma eller ECM och vaskulaturen. Detta icke-invasiva protokoll beskriver steg-för-steg-processen som sträcker sig från förvärv av time-lapse-bilder av brösttumörmodeller till efterbehandlingsanalys och bildsegmentering. Den främsta fördelen med detta arbetsflöde är att det utnyttjar metaboliska signaturer för att kontextualisera den dynamiskt föränderliga levande tumörmikromiljön utan användning av exogena fluorescerande etiketter, vilket gör det fördelaktigt för humana patient-härledda xenograftmodeller (PDX) och framtida klinisk användning där yttre fluoroforer inte är lätt tillämpliga.

Introduction

Den extracellulära matrisen (ECM) i tumörmikromiljön är känd för att vara dynamiskt deponerad och ombyggd av flera celltyper för att ytterligare underlätta sjukdomsprogression ^1,2,3. Dessa matrisförändringar ger både mekaniska och biologiska signaler som förändrar cellbeteendet och resulterar ofta i en fortsatt cykel av matrisombyggnad⁴. Undersökning av det dynamiska, ömsesidiga samspelet mellan tumörceller och den extracellulära matrisen utförs ofta med hjälp av tredimensionell (3D) in vitro-odling eller mikrofluidiska system. Medan dessa bottom-up-metoder har visat mekanismer för ECM-ombyggnad ^5,6,7, ökad proliferation⁸, epitel till mesenkymal övergång ^9,10,11,12 och tumörcellmigration och invasion ^{7,13,14,15,16} har deras fokus främst legat på ett fåtal celltyper (t.ex. tumörceller eller fibroblaster) inom en homogen 3D-matris jämfört med mångfalden och heterogeniteten hos interaktioner som finns i en fysiologisk vävnad. Förutom in vitro-system kan ex vivo tumör histologi också ge viss inblick i dessa cell-cell- och cell-ECM-interaktioner¹⁷. Immunohistokemi har fördelen att kunna analysera flera celltyper med avseende på ECM: s rumsligt heterogena sammansättning och arkitektur, men de statiska slutpunkterna för fast vävnad fångar inte den dynamiska karaktären av interaktioner mellan celler och mikromiljön. Intravital avbildning har öppnat dörren för att förhöra olika och dynamiska interaktioner inom det fysiologiska sammanhanget för den inhemska tumörmikromiljön.

Kapaciteten hos intravital tumöravbildning utvecklas snabbt. Förbättringar i utformningen av bildfönster och kirurgiska tekniker för att implantera fönstren har möjliggjort långsiktig longitudinell tumöravbildning på en mängd olika anatomiska platser (dvs. primär tumör, lymfkörtlar, metastatiska platser 18,19,20). Dessutom blir kapaciteten hos optisk instrumentering att visualisera och samla in data i flera dimensioner (dvs. spektral, rumslig fluorescensintensitet och livslängd) och vid hög upplösning och hastighet (videohastighet) allmänt tillgänglig. Den förbättrade tekniken ger en möjlighet att utforska snabba förändringar i cellsignalering och fenotypisk dynamik inom en fysiologisk miljö. Slutligen möjliggör expansionen av optogenetiska verktyg och det stora utbudet av genetiska fluorescerande konstruktioner märkning av specifika celltyper för att fånga cellmigration i tumörmikromiljön eller cellspårning under utveckling eller sjukdomsprogression ^21,22. Användningen av dessa verktyg i kombination med CRISPR/Cas9-teknik ger forskare möjlighet att generera unika djurmodeller i tid.

Medan alla dessa framsteg gör intravital avbildning till en allt kraftfullare metod för att utforska dynamiska och fysiologiska cellulära interaktioner, finns det fortfarande ett viktigt behov av att utveckla strategier som ger rumsligt, tidsmässigt och strukturellt sammanhang på vävnadsnivå till dessa biologiska interaktioner. För närvarande kompenserar många intravitala avbildningsstudier för bristen på visuella landmärken som blodkärl genom att injicera fluorescerande färgämnen i vaskulaturen eller använda musmodeller som exogent uttrycker fluorescerande proteiner för att avgränsa fysiska egenskaper. Injicerbara färgämnen och substrat som fluorescerande dextrans används i stor utsträckning för att framgångsrikt märka vaskulaturen i intravitala samlingar^{19, 23, 24}. Detta tillvägagångssätt är dock inte utan begränsningar. För det första kräver det ytterligare musmanipuleringar och dess användbarhet är begränsad till kortsiktiga experiment. För longitudinella studier kan fluorescerande dextran vara problematiskt eftersom vi observerar ackumulering av dextran i fagocytiska celler eller diffusion i den omgivande vävnaden över tid²⁵. Exogen fluorescerande proteininkorporering i musmodellen har presenterats som ett alternativ till fluorescerande dextrans men presenterar egna begränsningar. Tillgängligheten och mångfalden av exogena fluoroforer inom musmodeller är fortfarande begränsad och dyr att skapa. Dessutom, i specifika modeller, såsom PDX-modeller, är genetiska manipuleringar inte önskvärda eller möjliga. Det har också visats att närvaron av fluorescerande eller bioluminescerande proteiner i celler erkänns som främmande i musen, och inom immunkompetenta musmodeller minskar detta mängden metastasering på grund av svaret från värdimmunsystemet^26,27. Slutligen upptar exogena fluorescerande proteiner eller fluorescerande färgämnen som används för rumslig kontext eller för att segmentera efterföljande data ofta primområden av ljusspektrumet som annars skulle kunna användas för att undersöka de fysiologiska interaktionerna av intresse.

Användningen av den inneboende signalen från ECM eller endogen fluorescens från celler i vävnaden representerar ett potentiellt universellt etikettfritt sätt att segmentera intravitala data för mer djupgående cellulär och rumslig analys. Andra harmoniska generationen (SHG) har länge använts för att visualisera ECM²⁸. Med den efterföljande utvecklingen av viktiga verktyg för att hjälpa till vid karakteriseringen av fiberorganisationen ^29,30,31 är det möjligt att karakterisera cellbeteende i förhållande till lokal ECM-struktur. Dessutom ger autofluorescens från den endogena metaboliten, NAD (P) H, ett annat etikettfritt verktyg för att dela upp tumörmikromiljön in vivo. NAD(P)H fluorescerar starkt i tumörceller och kan användas för att diskriminera gränserna för det växande tumörboet från dess omgivande stroma ^21,32. Slutligen är vaskulaturen en viktig fysiologisk struktur i tumörmikromiljön och platsen för viktiga celltypsspecifika interaktioner 33,34,35. Excitationen av röda blodkroppar (RBC) eller blodplasma har använts för att visualisera tumörkärlen, och med hjälp av två- eller trefotonexcitation (2P; 3P) har mätningen av blodflödeshastigheter visat sig vara möjlig³⁶. Men medan större blodkärl lätt kan identifieras med sina endogena fluorescenssignaturer, kräver identifieringen av subtila, variabla och mindre fluorescerande små blodkärl mer expertis. Dessa inneboende svårigheter hindrar optimal bildsegmentering. Lyckligtvis kan dessa källor till endogen fluorescens (dvs. röda blodkroppar och blodplasma) också mätas genom fluorescens livstidsavbildning³⁷, som utnyttjar vaskulaturens unika fotofysiska egenskaper och representerar ett användbart tillskott till den växande intravitala verktygslådan.

I detta protokoll beskrivs ett arbetsflöde för segmentering av fyrdimensionell (4D) intravital avbildning som uttryckligen använder inneboende signaler som endogen fluorescens och SHG från förvärv till analys. Detta protokoll är särskilt relevant för longitudinella studier genom ett bröstavbildningsfönster där exogen fluorescens kanske inte är praktisk eller möjlig, vilket är fallet med PDX-modeller. Segmenteringsprinciperna som beskrivs här är dock i stort sett tillämpliga på intravitala användare som undersöker tumörbiologi, vävnadsutveckling eller till och med normal vävnadsfysiologi. Den rapporterade sviten av analysmetoder gör det möjligt för användarna att skilja cellulärt beteende mellan regioner med inriktade eller slumpmässiga kollagenfiberkonfigurationer, jämföra antal eller beteenden hos celler som bor i specifika regioner i tumörmikromiljön och kartlägga vaskulaturen till tumörmikromiljön med endast etikettfri eller inneboende signal. Tillsammans skapar dessa metoder en operativ ram för att maximera djupet av information som erhållits från 4D intravital avbildning av bröstkörteln samtidigt som behovet av ytterligare exogena etiketter minimeras.

Protocol

Alla experiment som beskrivs godkändes av University of Wisconsin-Madisons institutionella djurvårds- och användningskommitté. Välbefinnande och smärtlindring i alla djurförsök är av största vikt. Således görs alla ansträngningar för att se till att djuret är bekvämt och välskött vid varje steg i proceduren. 1. Generering av fönstret för bröstavbildning (MIW) För att konstruera bröstbildsfönstret, tillverka en 14 mm ring av rostfritt stål av …

Representative Results

Installationen av MIW och grundläggande experimentell planering är de första stegen i denna process. Denna speciella MIW-design och protokoll är mer mottagliga för longitudinella studier19 och har framgångsrikt använts med både upprättstående och inverterade mikroskop. I detta fall användes ett inverterat mikroskop eftersom det har resulterat i större bildstabilitet hos bröstkörteln med färre andningsartefakter. I figur 1A ger vi dimensionerna på den s…

Discussion

4D intravital avbildning är ett kraftfullt verktyg för att undersöka dynamiska fysiologiska interaktioner inom det rumsliga och tidsmässiga sammanhanget för den ursprungliga tumörmikromiljön. Detta manuskript ger en mycket grundläggande och anpassningsbar operativ ram för att dela upp dynamiska cellinteraktioner inom tumörmassan, den intilliggande stroma eller i närheten av det vaskulära nätverket med endast endogena signaler från andra harmoniska generationen eller NAD (P) H autofluorescens. Detta protokol…

Materials

#1.5 12mm round cover glass	Warner Instruments	# 64-0712	MIW construction
1.0 mL syringe for SQ injection	BD	309659	Syringe
20x objective	Zeiss	421452-988	Water immersion
27G needle for SQ injection	Covidien	1188827012	Needle
40x objective	Nikon	MRD77410	Water immersion
5-0 silk braided suture	Ethicon	K870	Suture for MIW implantation
Artificial tears gel	Akorn	NDC 59399-162-35	Eye gel
Betadine solution, 5%	Fisher Scientific	NC1558063	Surgery antiseptic
cotton-tipped applicator	Fisher Scientific	23-400-101
Cyanoacrylate adhesive	Loctite	1365882	MIW construction
fluorescent dextran	Sigma	T1287-50mg	intravenous labelling of vasculature
forceps	Mckesson.com	Miltex #18-782	stainless, 4 inch, curved
GaAsP photomultiplier tube	Hamamatsu
heating blanket	CARA 72 heating pad	038056000729	Temperature selectable
heating chamber	home built
Fluorescent lifetime handbook	Becker and Hickl		https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
inverted microscope base	Nikon
Isoflurane	Akorn	NDC 59399-106-01	Anesthesia
Liqui-Nox	Fisher Scientific	16-000-125	MIW cleaning
Meloxicam	Norbrook	NDC 55529-040-10	Analgesic
Micro Hose	Scientific Commodities INC.	BB31695-PE/1
multiphoton scan head	Bruker Ultima II		Multiphoton scanhead and imaging platform
NADH FLIM filter	Chroma	284994	ET 440/80 m-2P
Nair	CVS	339826	Depilatory cream
objective heater	Tokai Hit	STRG-WELSX-SET
SHG/FAD filter	Chroma	320740	ET450/40m-2P
Sparkle glass cleaner	Amazon.com	B00814ME24	Glass Cleaner for implanted MIW
SPC-150 photon counting board	Becker and Hickl
surgical light	FAJ	B06XV1VQVZ	Magnetic LED gooseneck light
surgical micro-scissors	Excelta	366	stainless, 3 inch
Triple antibiotic ointment	Actavis Pharma	NDC 0472-0179-34	Antibiotic
TV catheter	Custom	BD 30G needle: 305106	Catheter for TV injection
Two photon filter	Chroma	320282	ET585/65m-2P
two-photon laser	Coherent charmeleon		Tunable multiphoton laser
ultrasound gel	Parker	PKR-03-02	Water immersion gel
Urea crystals	Sigma	U5128-5G	Optional: FLIM IRF