Förster Resonance Energy Transfer Mapping: Eine neue Methodik zur Aufklärung globaler Strukturmerkmale

Summary

Die Studie beschreibt die Methodik der FRET-Kartierung, einschließlich der Auswahl der Markierungsstellen, der Auswahl der Farbstoffe, der Erfassung und der Datenanalyse. Diese Methodik ist effektiv bei der Bestimmung von Bindungsstellen, Konformationsänderungen und dynamischen Bewegungen in Proteinsystemen und ist am nützlichsten, wenn sie in Verbindung mit vorhandenen 3D-Strukturinformationen durchgeführt wird.

Abstract

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) ist eine etablierte fluoreszenzbasierte Methode, mit der Abstände in und zwischen Biomolekülen sowohl in vitro als auch innerhalb von Zellen erfolgreich gemessen werden. In FRET bezieht sich die Effizienz der Energieübertragung, gemessen an Änderungen der Fluoreszenzintensität oder Lebensdauer, auf den Abstand zwischen zwei fluoreszierenden Molekülen oder Markierungen. Die Bestimmung von Dynamik und Konformationsänderungen aus den Entfernungen sind nur einige Beispiele für die Anwendung dieser Methode auf biologische Systeme. Unter bestimmten Bedingungen kann diese Methodik bestehende Röntgenkristallstrukturen ergänzen und verbessern, indem sie Informationen über Dynamik, Flexibilität und Anpassung an Bindungsoberflächen liefert. Wir beschreiben die Verwendung von FRET und zugehörigen Entfernungsbestimmungen zur Aufklärung struktureller Eigenschaften durch die Identifizierung einer Bindungsstelle oder der Orientierungen von Dimer-Untereinheiten. Durch die umsichtige Auswahl der Markierungsstellen und oft den Einsatz mehrerer Markierungsstrategien haben wir diese Mapping-Methoden erfolgreich angewendet, um globale strukturelle Eigenschaften in einem Protein-DNA-Komplex und dem SecA-SecYEG-Proteintranslokationssystem zu bestimmen. Im SecA-SecYEG-System haben wir FRET-Mapping-Methoden verwendet, um die Präproteinbindungsstelle zu identifizieren und die lokale Konformation der gebundenen Signalsequenzregion zu bestimmen. Diese Studie beschreibt die Schritte zur Durchführung von FRET-Mapping-Studien, einschließlich der Identifizierung geeigneter Markierungsstellen, der Diskussion möglicher Markierungen einschließlich nicht-nativer Aminosäurereste, der Markierungsverfahren, der Durchführung von Messungen und der Interpretation der Daten.

Introduction

Für Proteine führt die Aufklärung der Dynamik zusammen mit 3-dimensionalem (3-D) Strukturwissen zu einem verbesserten Verständnis von Struktur-Funktions-Beziehungen biomolekularer Systeme. Strukturmethoden wie Röntgenkristallographie und kryogene Elektronenmikroskopie erfassen eine statische Struktur und erfordern häufig die Bestimmung mehrerer Strukturen, um Aspekte der Biomolekülbindung und -dynamik aufzuklären¹. In diesem Artikel wird eine lösungsbasierte Methode zum Zuordnen globaler Strukturelemente wie Bindungsstellen oder Bindungsinteraktionen erläutert, die potenziell vorübergehender sind und von statischen Methoden weniger leicht erfasst werden können. Starke Kandidatensysteme für diese Methodik sind solche, bei denen eine 3D-Struktur zuvor durch Röntgenkristallographie, NMR-Spektroskopie oder andere Strukturmethoden bestimmt wurde. In diesem Fall nutzen wir die Röntgenkristallstruktur des SecA-SecYEG-Komplexes, einem zentralen Akteur im allgemeinen Sekretionsweg des Proteins, um die Position einer Signalpeptid-Bindungsstelle mittels Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) vor dem Transport des Präproteins über die Membran^{abzubilden 2}. Die Manipulation des biologischen Systems durch genetische Modifikationen in Verbindung mit unserem Wissen über die 3-D-Struktur ermöglichte die Bestimmung der Konformation der Signalsequenz und der frühen reifen Region unmittelbar vor dem Einfügen in den Kanal ³.

FRET beinhaltet die strahlungslose Übertragung von Energie von einem Molekül (Donor) zu einem anderen (Akzeptor) in einer entfernungsabhängigen Weise, die durch Raum ^4,5 erfolgt. Die Effizienz dieses Transfers wird entweder durch eine Abnahme des Spenders oder eine Erhöhung der Akzeptorfluoreszenzintensität überwacht. Die Effizienz der Energieübertragung kann wie folgt beschrieben werden:

E = R 0 6/(R₀ 6 + R ⁶)

wobei der_R0-Wert der Abstand ist, bei dem die Übertragung einen Wirkungsgrad^{von 50 % aufweist 6}. Die Technik wurde zuvor als molekulares Lineal beschrieben und ist wirksam bei der Bestimmung von Abständen im Bereich von 2,5-12 nm, abhängig von der Identität der Spender-Akzeptor-Farbstoffe ^4,7,8,9. Die Fluoreszenzintensitäten und Lebensdauern des Spenders mit oder ohne Akzeptor ermöglichen die Bestimmung der Transfereffizienzen und folglich der Abstände ^5,8. Aufgrund der Verfügbarkeit der Technologie, der Empfindlichkeit der Methode und der Benutzerfreundlichkeit hat FRET auch breite Anwendung in Bereichen wie der Einzelmolekül-Fluoreszenzspektroskopie und der konfokalen Mikroskopie^{gefunden 6}. Das Aufkommen fluoreszierender Proteine wie grün fluoreszierendes Protein hat die Beobachtung der intrazellulären Dynamik und der Lebendzellbildgebung relativ einfach gemacht^10,11. Viele FRET-Anwendungen wie diese werden in dieser virtuellen Ausgabe ausführlich diskutiert.

In dieser Studie konzentrieren wir uns insbesondere auf die Verwendung von FRET-Messungen, um Abstandswerte zur Bestimmung struktureller Details zu erhalten. Bisher wurden FRET-Messungen effektiv verwendet, um die Konformation von DNA-Molekülen zu bestimmen, wenn sie an Protein 12,13,14, die interne Dynamik von Proteinen und Proteinbindungsinteraktionen 15,16,17 gebunden sind. Die Vorteile dieser Methode liegen in der Fähigkeit, flexible und dynamische Strukturelemente in einer Lösung mit relativ geringen Materialmengen zu bestimmen. Bezeichnenderweise ist diese Methode besonders effektiv, wenn sie in Verbindung mit vorhandenen Strukturinformationen verwendet wird, und kann nicht als Mittel zur 3D-Strukturbestimmung verwendet werden. Die Methode bietet den besten Einblick und die beste Verfeinerung der Struktur, wenn die Arbeit auf vorhandenen Strukturinformationen aufbaut, die häufig mit einer computergestützten Simulation gekoppelt sind^18,19. Hierbei wird die Verwendung von Abständen beschrieben, die aus stationären und zeitaufgelösten FRET-Messungen gewonnen werden, um eine Bindungsstelle, deren Lage nicht bekannt war, auf einer bestehenden kristallographischen Struktur des SecA-SecYEG-Komplexes, Hauptproteinen im allgemeinen sekretorischen Weg³, abzubilden.

Der allgemeine sekretorische Weg, ein hochkonserviertes System von Prokaryoten über Eukaryoten bis hin zu Archaeen, vermittelt den Transport von Proteinen entweder über oder in die Membran zu ihrem funktionellen Ort in der Zelle. Für gramnegative Bakterien, wie E. coli, den in unserer Studie verwendeten Organismus, werden Proteine in das Periplasma eingeführt oder über diese transloziert. Der bakterielle SecY-Kanalkomplex (Translokon genannt) koordiniert sich mit anderen Proteinen, um das neu synthetisierte Protein zu translozieren, das durch eine Signalsequenz, die sich typischerweise am N-Terminus^20,21 befindet, zu seiner korrekten Position in der Zelle geleitet wird. Für Proteine, die für das Periplasma gebunden sind, assoziiert das ATPase SecA-Protein mit dem Austrittstunnel des Ribosoms und mit dem Präprotein, nachdem etwa 100 Reste transzitiert wurden²². Zusammen mit dem SecB-Chaperonprotein hält es das Präprotein in einem entfalteten Zustand. SecA bindet an den SecYEG-Translokon und erleichtert durch viele Zyklen der ATP-Hydrolyse den Proteintransport über die Membran^23,24.

SecA ist ein Multi-Domain-Protein, das in zytosolischer und membrangebundener Form vorkommt. SecA ist ein homodimeres Protein im Zytosol und besteht aus einer Präproteinbindungs- oder Vernetzungsdomäne²⁵, zwei Nukleotid-bindenden Domänen, einer helikalen Flügeldomäne, einer spiralförmigen Gerüstdomäne und dem Zwei-Helix-Finger (THF) ^26,27,28,29 (Abbildung 1). In früheren kristallographischen Studien des SecA-SecYEG-Komplexes deutete die Lage des THF darauf hin, dass er aktiv an der Proteintranslokation beteiligt war, und nachfolgende Vernetzungsexperimente mit dem Signalpeptid belegten die Bedeutung dieser Region bei der Proteintranslokation^30,31. Frühere Studien unter Verwendung der FRET-Mapping-Methodik zeigten, dass exogene Signalpeptide an diese Region von SecA ^2,32 binden. Um die Konformation und Lage der Signalsequenz und der frühen reifen Region des Präproteins vor dem Einfügen in den SecYEG-Kanal vollständig zu verstehen, wurde eine Proteinchimäre erstellt, in der die Signalsequenz und die Reste der früh reifen Region durch einen Ser-Gly-Linker an SecA gebunden wurden (Abbildung 1). Unter Verwendung dieses biologisch lebensfähigen Konstrukts wurde weiter gezeigt, dass die Signalsequenz und die früh reife Region des Präproteins parallel an den THF binden². Anschließend wurde die FRET-Mapping-Methodik verwendet, um die Konformation und Position der Signalsequenz und der frühen reifen Region in Gegenwart von SecYEG aufzuklären, wie unten^{beschrieben 3}.

Die Kenntnis der 3D-Struktur des SecA-SecYEG-Komplexes^33,34,35 und der möglichen Lage der Bindungsstelle ermöglichte es uns, Spender-Akzeptor-Etiketten umsichtig an Orten zu platzieren^, an denen der Schnittpunkt einzelner FRET-Entfernungen den Standort der Bindungsstelle identifiziert. Diese FRET-Mapping-Messungen zeigten, dass die Signalsequenz und die früh reife Region des Präproteins eine Haarnadel bilden, wobei sich die Spitze an der Mündung des SecYEG-Kanals befindet, was zeigt, dass die Haarnadelstruktur vor dem Einfügen des Kanals mit einer Vorlage versehen ist.

Protocol

1. Auswahl der Kennzeichnungsstellen Identifizieren Sie mindestens drei potenzielle Markierungsstellen, um die mutmaßliche Bindungsstelle auf den vorhandenen Proteinstrukturen zu triangulieren. In diesem Fall wurden SecA, SecYEG und Präprotein, die durch genetische Fusion an SecA gebunden sind, identifiziert2. Wählen Sie Markierungsstellen innerhalb von 25-75 Å der mutmaßlichen Bindungsstelle und in relativ statischen Regionen des Proteins bestimmt der Absta…

Representative Results

Diese Studie konzentrierte sich auf die Bestimmung der Position der Präproteinbindungsstelle auf SecA vor dem Einfügen des Präproteins in den SecYEG-Kanal. Um die Bindungsstelle zu kartieren, wurden FRET-Experimente zwischen verschiedenen Regionen des Präproteins und drei verschiedenen Stellen an den Proteinen SecA und SecYEG durchgeführt (Abbildung 1A-D). Aus den erhaltenen Entfernungen und dreidimensionalen Strukturen von SecA, SecYEG und dem Präprot…

Discussion

Durch die Verwendung der FRET-Mapping-Methodik identifizierten wir die Signalsequenz-Bindungsstelle auf dem SecA-Protein. Wichtig ist, dass das Vorhandensein einer 3D-Kristallstruktur des Komplexes unsere Studie erheblich erleichtert hat. Die Stärke dieser Mapping-Methodik liegt in der Fähigkeit, eine vorhandene Struktur zu verwenden, um Standorte für die Kennzeichnung zu identifizieren. Diese Methodik kann nicht verwendet werden, um eine 3D-Struktur zu bestimmen; Die Bestimmung der Strukturelemente 56, die Verfeineru…

Materials

490 nm LED laser	Horiba	1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne	Life Technologies	A20347
Agar	Difco	DF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne	Life Technologies	A10254
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne	Life Technologies	S10904
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne	Life Technologies	S10906
Amicon Ultra­4 Centrifugal filter (50kDa MWCO)	Sigma	UFC805008
Dodecylmaltoside (DDM)	Anatrace	D310
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22	Biomolecules Midwest	N/A	Synthesized custom item
extended signal peptide SP41	Biomolecules Midwest	N/A	Synthesized custom item
FluorEssence	Horiba	version 2.4	spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer
Fluoromax 4 spectrofluorometer	Horiba	N/A
GlobalsWE	Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine		spectral analysis program for time-resolved decays
H­4­Azido­Phe­OH	BACHEM	4020250.0001
LB (Miller) Broth	Fisher Scientific	BP9723
Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O)	Sigma-Aldrich	420816	dilution is needed to make a proper scattering solution
PTI Felix GX	Horiba	version 4.1.0.4096	spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument
PTI Time Master Instrument	Horiba	NA
Pymol Molecular Graphics Program	Schrodinger	version 2.4
Water bath	Thermo Scientific	NESLAB RTE 10