Mapeamento da transferência de energia de ressonância förster: uma nova metodologia para elucidar características estruturais globais

Summary

O estudo detalha a metodologia do mapeamento da FRET, incluindo a seleção de sites de rotulagem, escolha de corantes, aquisição e análise de dados. Essa metodologia é eficaz na determinação de locais de ligação, alterações conformais e movimentos dinâmicos em sistemas proteicos e é mais útil se realizada em conjunto com as informações estruturais 3D existentes.

Abstract

A transferência de energia de ressonância förster (FRET) é um método baseado em fluorescência estabelecido usado para medir com sucesso distâncias dentro e entre biomoléculas in vitro , bem como dentro das células. No FRET, a eficiência da transferência de energia, medida por mudanças na intensidade ou na vida útil da fluorescência, relaciona-se à distância entre duas moléculas fluorescentes ou rótulos. A determinação da dinâmica e as mudanças conformais a partir das distâncias são apenas alguns exemplos de aplicações desse método aos sistemas biológicos. Sob certas condições, essa metodologia pode adicionar e aprimorar estruturas de cristal de raios-X existentes, fornecendo informações sobre dinâmica, flexibilidade e adaptação a superfícies de ligação. Descrevemos o uso de FRET e determinações de distância associadas para elucidar propriedades estruturais, através da identificação de um local de ligação ou das orientações de subunidades mais fracas. Através da escolha criteriosa de sites de rotulagem, e muitas vezes emprego de múltiplas estratégias de rotulagem, aplicamos com sucesso esses métodos de mapeamento para determinar propriedades estruturais globais em um complexo de DNA proteico e no sistema de translocação de proteínas SecA-SecYEG. No sistema SecA-SecYEG, usamos métodos de mapeamento FRET para identificar o local de ligação pré-proteína e determinar a conformação local da região de sequência de sinal vinculado. Este estudo descreve as etapas para a realização de estudos de mapeamento de FRET, incluindo identificação de locais de rotulagem adequados, discussão de possíveis rótulos, incluindo resíduos de aminoácidos não nativos, procedimentos de rotulagem, como realizar medições e interpretação dos dados.

Introduction

Para as proteínas, a elucidação da dinâmica juntamente com o conhecimento estrutural tridimensional (3-D) leva a uma compreensão aprimorada das relações estrutura-função dos sistemas biomoleculares. Métodos estruturais, como cristalografia de raios-X e microscopia eletrônica criogênica, capturam uma estrutura estática e muitas vezes requerem a determinação de múltiplas estruturas para elucidar aspectos da ligação biomolécula e da dinâmica¹. Este artigo discute um método baseado em soluções para mapear elementos estruturais globais, como locais de vinculação ou interações vinculativas, que são potencialmente mais transitórios e menos facilmente capturados por métodos estáticos. Sistemas fortes candidatos a essa metodologia são aqueles em que uma estrutura 3D foi previamente determinada por cristalografia de raios-X, espectroscopia de NMR ou outros métodos estruturais. Neste caso, aproveitamos a estrutura de cristal de raios-X do complexo SecA-SecYEG, um player central na via secretary geral da proteína, para mapear a localização de um local de ligação de peptídeo de sinal usando a transferência de energia de ressonância Förster (FRET) antes do transporte da pré-proteína através da membrana². A manipulação do sistema biológico através de modificações genéticas aliadas ao nosso conhecimento da estrutura 3D possibilitou a determinação da conformação da sequência de sinal e da região madura precoce imediatamente antes da inserção no canal ³.

O FRET envolve a transferência de energia sem radiação de uma molécula (doador) para outra (aceitadora) de forma dependente da distância que é através do espaço ^4,5. A eficiência dessa transferência é monitorada através de uma diminuição do doador ou um aumento na intensidade de fluorescência aceitadora. A eficiência da transferência de energia pode ser descrita como

E = R₀⁶/(R₀⁶ + R⁶)

em que o valor R₀ é a distância em que a transferência é 50% eficiente⁶. A técnica já foi descrita como uma régua molecular e é eficaz na determinação de distâncias na faixa de 2,5-12 nm, dependendo da identidade dos corantes aceitadores de doadores 4,7,8,9. As intensidades de fluorescência do doador e as vidas com ou sem aceitação permitem a determinação da eficiência de transferência e, consequentemente, distâncias ^5,8. Devido à disponibilidade da tecnologia, sensibilidade do método e facilidade de uso, a FRET também encontrou ampla aplicação em áreas como espectroscopia de fluorescência de molécula única e microscopia confocal⁶. O advento de proteínas fluorescentes como a proteína fluorescente verde tornou a observação da dinâmica intracelular e da imagem de células vivas relativamente fácil^10,11. Muitas aplicações FRET como essas são discutidas detalhadamente nesta questão virtual.

Neste estudo, focamos particularmente no uso de medidas de FRET para produzir valores de distância para determinar detalhes estruturais. Anteriormente, as medidas de FRET têm sido efetivamente utilizadas para determinar a conformação de moléculas de DNA quando ligadas à proteína 12,13,14, a dinâmica interna das proteínas e interações de ligação proteica 15,16,17. As vantagens deste método residem na capacidade de determinar elementos estruturais flexíveis e dinâmicos em uma solução com quantidades relativamente baixas de material. Significativamente, este método é particularmente eficaz quando utilizado em conjunto com as informações estruturais existentes e não pode ser usado como um meio de determinação da estrutura 3D. O método fornece a melhor visão e refinamento da estrutura se o trabalho se baseia em informações estruturais existentes, muitas vezes acoplado à simulação computacional^18,19. Aqui, descreve-se o uso de distâncias obtidas a partir de medições fret de estado estável e tempo resolvidos para mapear um local de ligação, local do qual não se sabia, em uma estrutura cristalográfica existente do complexo SecA-SecYEG, grandes proteínas na via secreta³ geral.

O caminho secreto geral, um sistema altamente conservado de procariotes a eucariotes até arqueias, media o transporte de proteínas através ou para dentro da membrana para sua localização funcional na célula. Para bactérias gram-negativas, como e. coli, o organismo usado em nosso estudo, proteínas são inseridas ou translocadas através da membrana interna para o periplasma. O complexo de canal secy bacteriano (chamado translocon) coordena com outras proteínas para translocar a proteína recém-sintetizada, que é direcionada para sua localização correta na célula através de uma sequência de sinal tipicamente localizada no N-terminus^20,21. Para proteínas destinadas ao periplasma, a proteína ATPase SecA associa-se ao túnel de saída do ribossomo, e com a pré-proteína após aproximadamente 100 resíduos terem sido traduzidos²². Juntamente com a proteína acompanhante da SecB, mantém a pré-proteína em um estado desdobrado. A SecA se liga ao translocon SecYEG, e através de muitos ciclos de hidrólise ATP, facilita o transporte de proteínas através da membrana^23,24.

SecA é uma proteína multi-domínio que existe em formas citosolísticas e ligadas à membrana. Uma proteína homodimemérica no citosol, a SecA consiste em um domínio de ligação pré-proteína ou cross-linking²⁵, dois domínios de ligação de nucleotídeos, um domínio de asa helicoidal, um domínio helicoidal de andaimes e o dedo de duas hélices (THF)26,27,28,29 (Figura 1). Em estudos cristalográficos anteriores do complexo SecA-SecYEG, a localização do THF sugeriu que ele estava ativamente envolvido na translocação de proteínas e subsequentes experimentos de ligação cruzada com o peptídeo de sinal estabeleceu ainda mais a importância desta região na translocação de proteínas^30,31. Estudos anteriores, utilizando a metodologia de mapeamento DA FRET, demonstraram que peptídeos de sinal exógenos se ligam a esta região da SecA ^2,32. Para compreender completamente a conformação e localização da sequência de sinal e a região madura precoce da pré-proteína antes da inserção no canal SecYEG, foi criada uma quimera proteica na qual a sequência de sinal e resíduos da região madura precoce foram anexados à SecA através de um linker Ser-Gly (Figura 1). Usando essa construção biologicamente viável, foi demonstrado ainda que a sequência de sinal e a região madura precoce da pré-proteína se ligam ao THF de forma paralela². Posteriormente, utilizou-se a metodologia de mapeamento DO FRET para elucidar a conformação e a localização da sequência de sinal e da região madura precoce na presença de SecYEG conforme descrito abaixo de³.

O conhecimento da estrutura 3D do complexo SecA-SecYEG ^33,34,35 e a possível localização do local de ligação nos permitiu colocar criteriosamente rótulos de doadores-aceitadores em locais onde a intersecção de distâncias individuais de FRET identifica a localização do local de vinculação. Estas medidas de mapeamento fret revelaram que a sequência de sinal e a região madura precoce da pré-proteína formam um grampo de cabelo com a ponta localizada na boca do canal SecYEG, demonstrando que a estrutura do grampo de cabelo é modelada antes da inserção do canal.

Protocol

1. Seleção de sites de rotulagem Identifique pelo menos três potenciais locais de rotulagem para triangular o local de ligação putativa nas estruturas proteicas existentes. Neste caso, foram identificadas2 SecA, SecYEG e pré-proteína anexada à SecA através de fusão genética. Escolha locais de rotulagem dentro de 25-75 Å do local de ligação putativa e em regiões relativamente estáticas da proteína, a distância determinará o par de corantes FRET …

Representative Results

Este estudo concentrou-se em determinar a localização do local de ligação pré-proteína na SecA antes da inserção da pré-proteína no canal SecYEG. Para mapear o local de ligação, foram realizados experimentos de FRET entre diferentes regiões da pré-proteína e três locais distintos nas proteínas SecA e SecYEG (Figura 1A-D). Das distâncias obtidas e estruturas tridimensionais da SecA, SecYEG e pré-proteína, a localização do local de ligaç…

Discussion

Através do uso da metodologia de mapeamento FRET, identificamos o local de ligação da sequência de sinal na proteína SecA. É importante ressaltar que a presença de uma estrutura de cristal 3D do complexo facilitou muito nosso estudo. A força dessa metodologia de mapeamento está na capacidade de usar uma estrutura existente para identificar locais para rotulagem. Esta metodologia não pode ser usada para determinar uma estrutura 3D; no entanto, a determinação dos elementos estruturais⁵⁶,…

Materials

490 nm LED laser	Horiba	1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne	Life Technologies	A20347
Agar	Difco	DF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne	Life Technologies	A10254
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne	Life Technologies	S10904
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne	Life Technologies	S10906
Amicon Ultra­4 Centrifugal filter (50kDa MWCO)	Sigma	UFC805008
Dodecylmaltoside (DDM)	Anatrace	D310
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22	Biomolecules Midwest	N/A	Synthesized custom item
extended signal peptide SP41	Biomolecules Midwest	N/A	Synthesized custom item
FluorEssence	Horiba	version 2.4	spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer
Fluoromax 4 spectrofluorometer	Horiba	N/A
GlobalsWE	Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine		spectral analysis program for time-resolved decays
H­4­Azido­Phe­OH	BACHEM	4020250.0001
LB (Miller) Broth	Fisher Scientific	BP9723
Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O)	Sigma-Aldrich	420816	dilution is needed to make a proper scattering solution
PTI Felix GX	Horiba	version 4.1.0.4096	spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument
PTI Time Master Instrument	Horiba	NA
Pymol Molecular Graphics Program	Schrodinger	version 2.4
Water bath	Thermo Scientific	NESLAB RTE 10