Förster Resonance Energy Transfer Mapping: una nuova metodologia per chiarire le caratteristiche strutturali globali
Summary
Lo studio descrive in dettaglio la metodologia della mappatura FRET, compresa la selezione dei siti di etichettatura, la scelta dei coloranti, l’acquisizione e l’analisi dei dati. Questa metodologia è efficace nel determinare i siti di legame, i cambiamenti conformazionali e i movimenti dinamici nei sistemi proteici ed è più utile se eseguita in combinazione con le informazioni strutturali 3D esistenti.
Abstract
Il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) è un metodo consolidato basato sulla fluorescenza utilizzato per misurare con successo le distanze all’interno e tra le biomolecole in vitro e all’interno delle cellule. In FRET, l’efficienza del trasferimento di energia, misurata dalle variazioni dell’intensità di fluorescenza o della durata, si riferisce alla distanza tra due molecole o etichette fluorescenti. Determinazione della dinamica e cambiamenti conformazionali dalle distanze sono solo alcuni esempi di applicazioni di questo metodo ai sistemi biologici. In determinate condizioni, questa metodologia può aggiungere e migliorare le strutture cristalline a raggi X esistenti fornendo informazioni riguardanti la dinamica, la flessibilità e l’adattamento alle superfici di legame. Descriviamo l’uso di FRET e le determinazioni della distanza associate per chiarire le proprietà strutturali, attraverso l’identificazione di un sito di legame o gli orientamenti delle subunità dimeri. Attraverso una scelta giudiziosa dei siti di etichettatura e spesso l’impiego di più strategie di etichettatura, abbiamo applicato con successo questi metodi di mappatura per determinare le proprietà strutturali globali in un complesso proteina-DNA e il sistema di traslocazione proteica SecA-SecYEG. Nel sistema SecA-SecYEG, abbiamo utilizzato metodi di mappatura FRET per identificare il sito di legame preproteico e determinare la conformazione locale della regione della sequenza del segnale legato. Questo studio delinea i passaggi per l’esecuzione di studi di mappatura FRET, tra cui l’identificazione di siti di etichettatura appropriati, la discussione di possibili etichette tra cui residui di amminoacidi non nativi, procedure di etichettatura, come eseguire misurazioni e interpretare i dati.
Introduction
Per le proteine, la delucidazione della dinamica insieme alla conoscenza strutturale tridimensionale (3-D) porta a una migliore comprensione delle relazioni struttura-funzione dei sistemi biomolecolari. I metodi strutturali, come la cristallografia a raggi X e la microscopia elettronica criogenica, catturano una struttura statica e spesso richiedono la determinazione di più strutture per chiarire gli aspetti del legame e della dinamica delle biomolecole1. In questo articolo viene descritto un metodo basato su soluzione per la mappatura di elementi strutturali globali, ad esempio siti di associazione o interazioni di associazione, potenzialmente più transitori e meno facilmente acquisibili con metodi statici. I sistemi candidati forti per questa metodologia sono quelli in cui una struttura 3D è stata precedentemente determinata mediante cristallografia a raggi X, spettroscopia NMR o altri metodi strutturali. In questo caso, sfruttiamo la struttura cristallina a raggi X del complesso SecA-SecYEG, un attore centrale nella via secretoria generale della proteina, per mappare la posizione di un sito di legame peptidico del segnale utilizzando il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) prima del trasporto della preproteina attraverso la membrana2. La manipolazione del sistema biologico attraverso modificazioni genetiche unita alla nostra conoscenza della struttura 3D ha permesso la determinazione della conformazione della sequenza del segnale e della regione precoce matura immediatamente prima dell’inserimento nel canale 3.
FRET comporta il trasferimento di energia senza radiazioni da una molecola (donatore) a un’altra (accettore) in modo dipendente dalla distanza che è attraverso lo spazio 4,5. L’efficienza di questo trasferimento viene monitorata attraverso una diminuzione del donatore o un aumento dell’intensità di fluorescenza dell’accettore. L’efficienza del trasferimento di energia può essere descritta come
E = R06/(R06 + R6)
in cui il valore R0 è la distanza alla quale il trasferimento è efficiente al 50%6. La tecnica è stata precedentemente descritta come un righello molecolare ed è efficace nel determinare distanze nell’intervallo 2,5-12 nm, a seconda dell’identità dei coloranti donatore-accettore 4,7,8,9. Le intensità di fluorescenza del donatore e la durata di vita con o senza accettore consentono di determinare le efficienze di trasferimento e, di conseguenza, le distanze 5,8. A causa della disponibilità della tecnologia, della sensibilità del metodo e della facilità d’uso, FRET ha anche trovato ampia applicazione in settori come la spettroscopia di fluorescenza a singola molecola e la microscopia confocale6. L’avvento di proteine fluorescenti come la proteina fluorescente verde ha reso l’osservazione della dinamica intracellulare e l’imaging delle cellule vive relativamente facile10,11. Molte applicazioni FRET come queste sono discusse in dettaglio in questo numero virtuale.
In questo studio, ci concentriamo in particolare sull’uso delle misurazioni FRET per produrre valori di distanza per determinare i dettagli strutturali. In precedenza, le misurazioni FRET sono state efficacemente utilizzate per determinare la conformazione delle molecole di DNA quando legate alla proteina 12,13,14, la dinamica interna delle proteine e le interazioni di legame proteico 15,16,17. I vantaggi di questo metodo risiedono nella capacità di determinare elementi strutturali flessibili e dinamici in una soluzione con quantità relativamente basse di materiale. Significativamente, questo metodo è particolarmente efficace se utilizzato in combinazione con le informazioni strutturali esistenti e non può essere utilizzato come mezzo di determinazione della struttura 3D. Il metodo fornisce la migliore comprensione e perfezionamento della struttura se il lavoro si basa su informazioni strutturali esistenti spesso accoppiate con la simulazione computazionale18,19. Qui, l’uso di distanze ottenute da misure FRET allo stato stazionario e risolte nel tempo è descritto per mappare un sito di legame, la cui posizione non era nota, su una struttura cristallografica esistente del complesso SecA-SecYEG, le principali proteine nella via secretoria generale3.
La via secretoria generale, un sistema altamente conservato dai procarioti agli eucarioti agli archaea, media il trasporto delle proteine attraverso o nella membrana fino alla loro posizione funzionale nella cellula. Per i batteri Gram-negativi, come E. coli, l’organismo utilizzato nel nostro studio, le proteine vengono inserite o traslocate attraverso la membrana interna al periplasma. Il complesso di canali SecY batterici (chiamato translocon) si coordina con altre proteine per traslocare la proteina appena sintetizzata, che viene diretta alla sua posizione corretta nella cellula attraverso una sequenza di segnali tipicamente situata al N-terminus20,21. Per le proteine legate al periplasma, la proteina ATPasi SecA si associa al tunnel di uscita del ribosoma e alla preproteina dopo che circa 100 residui sono stati tradotti22. Insieme alla proteina chaperone SecB, mantiene la preproteina in uno stato spiegato. SecA si lega al translocon SecYEG e, attraverso molti cicli di idrolisi dell’ATP, facilita il trasporto delle proteine attraverso la membrana23,24.
SecA è una proteina multi-dominio che esiste in forme citosoliche e legate alla membrana. Una proteina omodimerica nel citosol, SecA è costituita da un dominio di legame preproteico o cross-linking25, due domini leganti nucleotidi, un dominio alare elicoidale, un dominio elicoidale scaffold e il dito a due eliche (THF) 26,27,28,29 (Figura 1). In precedenti studi cristallografici del complesso SecA-SecYEG, la posizione del THF suggeriva che fosse attivamente coinvolto nella traslocazione delle proteine e nei successivi esperimenti di cross-linking con il peptide segnale ha ulteriormente stabilito il significato di questa regione nella traslocazione proteica30,31. Studi precedenti, utilizzando la metodologia di mappatura FRET, hanno dimostrato che i peptidi di segnale esogeni si legano a questa regione di SecA 2,32. Per comprendere appieno la conformazione e la posizione della sequenza del segnale e della regione precoce matura della preproteina prima dell’inserimento nel canale SecYEG, è stata creata una chimera proteica in cui la sequenza del segnale e i residui della regione della prima maturità sono stati attaccati alla SecA attraverso un linker Ser-Gly (Figura 1). Usando questo costrutto biologicamente vitale, è stato ulteriormente dimostrato che la sequenza del segnale e la regione precoce matura della preproteina si legano al THF in modo parallelo2. Successivamente, la metodologia di mappatura FRET è stata utilizzata per chiarire la conformazione e la posizione della sequenza del segnale e della regione di maturazione precoce in presenza di SecYEG come descritto di seguito3.
La conoscenza della struttura 3D del complesso SecA-SecYEG 33,34,35 e la possibile posizione del sito di legame ci hanno permesso di posizionare giudiziosamente le etichette donatore-accettore in luoghi in cui l’intersezione delle singole distanze FRET identifica la posizione del sito di legame. Queste misurazioni della mappatura FRET hanno rivelato che la sequenza del segnale e la regione precoce matura della preproteina formano una forcina con la punta situata alla bocca del canale SecYEG, dimostrando che la struttura della forcina è modellata prima dell’inserimento del canale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Attraverso l’uso della metodologia di mappatura FRET, abbiamo identificato il sito di legame della sequenza di segnale sulla proteina SecA. È importante sottolineare che la presenza di una struttura cristallina 3D del complesso ha notevolmente facilitato il nostro studio. La forza di questa metodologia di mappatura risiede nella capacità di utilizzare una struttura esistente per identificare le posizioni per l’etichettatura. Questa metodologia non può essere utilizzata per determinare una struttura 3D; tuttavia, la de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione R15GM135904 del National Institutes of Health (assegnata all’IM) e dalla sovvenzione GM110552 del National Institutes of Health (assegnata al DBO).
Materials
| 490 nm LED laser | Horiba | 1684-LED | |
| Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne | Life Technologies | A20347 | |
| Agar | Difco | DF0812 | |
| Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne | Life Technologies | A10254 | |
| Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne | Life Technologies | S10904 | |
| Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne | Life Technologies | S10906 | |
| Amicon Ultra4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) | Sigma | UFC805008 | |
| Dodecylmaltoside (DDM) | Anatrace | D310 | |
| E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 | Biomolecules Midwest | N/A | Synthesized custom item |
| extended signal peptide SP41 | Biomolecules Midwest | N/A | Synthesized custom item |
| FluorEssence | Horiba | version 2.4 | spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer |
| Fluoromax 4 spectrofluorometer | Horiba | N/A | |
| GlobalsWE | Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine | spectral analysis program for time-resolved decays | |
| H4AzidoPheOH | BACHEM | 4020250.0001 | |
| LB (Miller) Broth | Fisher Scientific | BP9723 | |
| Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) | Sigma-Aldrich | 420816 | dilution is needed to make a proper scattering solution |
| PTI Felix GX | Horiba | version 4.1.0.4096 | spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument |
| PTI Time Master Instrument | Horiba | NA | |
| Pymol Molecular Graphics Program | Schrodinger | version 2.4 | |
| Water bath | Thermo Scientific | NESLAB RTE 10 |
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