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Biochimie

フェルスター共鳴エネルギー伝達マッピング:全球構造特徴を解明する新しい方法論

Published: March 16, 2022
doi:
10.3791/63433
, ,
1Molecular Biology and Biochemistry Department,Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program,Wesleyan University

Summary

この研究は、標識部位の選択、色素の選択、取得、およびデータ分析を含むFRETマッピングの方法論を詳述している。この方法論は、タンパク質系における結合部位、立体構造変化、および動的運動を決定するのに有効であり、既存の3D構造情報と組み合わせて実行される場合に最も有用である。

Abstract

Förster共鳴エネルギー移動(FRET)は、 インビトロ および細胞内の生体分子間および生体分子間の距離を首尾よく測定するために使用される確立された蛍光ベースの方法です。FRETにおいて、蛍光強度または寿命の変化によって測定されるエネルギー移動の効率は、2つの蛍光分子または標識間の距離に関する。距離からのダイナミクスと立体構造変化の決定は、この方法の生物学的システムへの応用の一例にすぎません。特定の条件下では、この方法論は、ダイナミクス、柔軟性、および結合表面への適応に関する情報を提供することにより、既存のX線結晶構造に追加し、強化することができる。我々は、結合部位または二量体サブユニットの配向の同定を通じて、構造特性を解明するためのFRETおよび関連する距離決定の使用について記述する。標識部位の賢明な選択、および多くの場合、複数の標識戦略の採用を通じて、タンパク質-DNA複合体およびSecA-SecEGタンパク質転座システムにおけるグローバルな構造特性を決定するために、これらのマッピング法を首尾よく適用しました。SecA-SecYEGシステムでは、FRETマッピング法を使用して、プレタンパク質結合部位を同定し、結合したシグナル配列領域の局所立体構造を決定しました。この研究は、適切な標識部位の同定、非天然アミノ酸残基を含む可能な標識の議論、標識手順、測定の実施方法、およびデータの解釈を含む、FRETマッピング研究を実施するためのステップを概説する。

Introduction

タンパク質については、3次元(3次元)構造知識とともにダイナミクスを解明することで、生体分子系の構造と機能の関係の理解を深めることができます。X線結晶学や極低温電子顕微鏡などの構造的方法は、静的構造を捉え、生体分子結合やダイナミクスの側面を解明するために複数の構造の決定を必要とすることが多い1。この記事では、結合部位や結合相互作用など、静的な方法ではキャプチャしにくい可能性のあるグローバル構造要素をマッピングするためのソリューションベースの方法について説明します。この方法論の有力な候補系は、X線結晶学、NMR分光法、または他の構造法によって3次元構造が以前に決定されたものである。この場合、タンパク質一般分泌経路の中心プレーヤーであるSecA-SecYEG複合体のX線結晶構造を利用して、膜2を横切るプレタンパク質の輸送の前にフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)を用いてシグナルペプチド結合部位の位置をマッピングする。遺伝子改変による生体系の操作と3次元構造に関する我々の知識を組み合わせることで、チャネル 3への挿入直前のシグナル配列と早期成熟領域の立体構造の決定が可能となった。

FRETは、空間4,5を通る距離依存的な方法で、ある分子(ドナー)から別の分子(アクセプター)へのエネルギーの放射線のない移動を含む。この転送の効率は、ドナーの減少またはアクセプター蛍光強度の増加のいずれかによってモニターされます。エネルギー移動の効率は、次のように記述できます。

E = R 0 6/(R0 6 + R 6)

ここで、R0値は、転送が50%効率的である距離である6。この技術は、以前に分子定規として記載されており、ドナー – アクセプター色素4,7,8,9の同一性に応じて、2.5〜12nmの範囲の距離を決定するのに有効である。ドナーの蛍光強度および寿命は、アクセプターの有無にかかわらず、転写効率の決定を可能にし、その結果、距離5,8である。この技術の利用可能性、方法の感度、および使いやすさにより、FRETは、単一分子蛍光分光法および共焦点顕微鏡6などの分野でも幅広い用途を見出しました。緑色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質の出現により、細胞内動態の観察および生細胞イメージングが比較的容易になった10,11。このような多くのFRETアプリケーションについては、この仮想問題で詳しく説明します。

この研究では、構造の詳細を決定するための距離値を得るためにFRET測定を使用することに特に焦点を合わせています。これまで、FRET測定は、タンパク質12、13、14に結合したときのDNA分子の立体構造、タンパク質の内部動態、およびタンパク質結合相互作用15、16、17を決定するために効果的に使用されてきた。この方法の利点は、比較的少量の材料を含むソリューション中で柔軟で動的な構造要素を決定する能力にあります。重要なことに、この方法は、既存の構造情報と組み合わせて使用する場合に特に効果的であり、3次元構造決定の手段として使用することはできません。この方法は、作業がしばしば計算シミュレーションと組み合わされた既存の構造情報に基づいて構築されている場合、構造の最良の洞察と洗練を提供する18,19。ここでは、定常状態および時間分解FRET測定から得られた距離を使用して、SecA-SecYEG複合体の既存の結晶学的構造上の結合部位を、一般分泌経路3の主要なタンパク質上に位置が知られていなかった。

一般分泌経路は、原核生物から真核生物、古細菌まで高度に保存された系であり、細胞内の機能的位置への膜を横切ってまたは膜内へのタンパク質の輸送を媒介する。我々の研究で使用された生物である大腸菌などのグラム陰性菌の場合、タンパク質は内膜を横切ってペリプラズムに挿入または転座する。細菌のSecYチャネル複合体(トランスロコンと呼ばれる)は、他のタンパク質と協調して、新たに合成されたタンパク質を転座させ、これは、典型的にはN末端に位置するシグナル配列を介して細胞内のその正しい位置に向けられる20,21。ペリプラズムに結合したタンパク質の場合、ATPase SecAタンパク質はリボソームの出口トンネルと会合し、約100残基が翻訳された後のプレタンパク質と会合する22。SecBシャペロンタンパク質とともに、プレタンパク質を折り畳まれていない状態に維持する。SecAは、SecYEGトランスロコンに結合し、そしてATP加水分解の多くのサイクルを経て、膜を横切るタンパク質輸送を促進する23、24。

SecAは、細胞質ゾルおよび膜結合形態で存在するマルチドメインタンパク質である。細胞質ゾル中のホモ二量体タンパク質であるSecAは、プレタンパク質結合または架橋ドメイン25、2つのヌクレオチド結合ドメイン、ヘリカルウィングドメイン、ヘリカルスキャフォールドドメイン、および2つのヘリックスフィンガー(THF)26、27、28、29からなる(図1)。SecA-SecYEG複合体の以前の結晶学的研究において、THFの位置は、それがタンパク質転座に積極的に関与していることを示唆し、その後のシグナルペプチドとの架橋実験は、タンパク質転座におけるこの領域の重要性をさらに確立した30,31。FRETマッピング方法論を用いた以前の研究では、外因性シグナルペプチドがSecA2,32のこの領域に結合することが実証された。SecYEGチャネルへの挿入前のプレタンパク質のシグナル配列と初期成熟領域の立体構造と位置を完全に理解するために、初期成熟領域のシグナル配列と残基がSer-Glyリンカーを介してSecAに結合したタンパク質キメラを作成した(図1)。この生物学的に生存可能な構築物を用いて、プレタンパク質のシグナル配列および早期成熟領域が並行してTHFに結合することをさらに実証した2。続いて、FRETマッピング方法論を用いて、下記3のようにSecYEG存在下におけるシグナル配列および初期成熟領域の立体構造および位置を解明した。

SecA-SecYEG複合体33,34,35の3次元構造と結合部位の可能な位置に関する知識により、個々のFRET距離の交点が結合部位の位置を特定する場所にドナー-アクセプター標識を慎重に配置することができました。これらのFRETマッピング測定は、プレタンパク質のシグナル配列および早期成熟領域が、先端がSecEGチャネルの口に位置するヘアピンを形成することを明らかにし、ヘアピン構造がチャネル挿入前にテンプレート化されることを実証した。

Protocol

1. ラベリングサイトの選択 既存のタンパク質構造上の推定結合部位を三角測量するための少なくとも3つの潜在的な標識部位を同定する。このとき、遺伝子融合によりSecA、SecYEG、およびSecAに結合したプレタンパク質が同定された2。 推定結合部位の25〜75Å以内およびタンパク質の比較的静的な領域における標識部位を選択し、その距離は、使用す?…

Representative Results

この研究は、SecYEGチャネルへのプレタンパク質の挿入前に、SecA上のプレタンパク質結合部位の位置を決定することに焦点を当てた。結合部位をマッピングするために、プレタンパク質の異なる領域と、SecAおよびSecYEGタンパク質上の3つの異なる位置との間でFRET実験を行った(図1A−D)。得られた距離とSecA、SecYEG、およびプレタンパク質の三次元?…

Discussion

FRETマッピング方法論を用いて、我々はSecAタンパク質上のシグナル配列結合部位を同定した。重要なことに、複合体の3次元結晶構造の存在は、我々の研究を大いに促進した。このマッピング手法の強みは、既存の構造を使用してラベル付けする場所を特定できることにあります。この方法論を使用して 3-D 構造を決定することはできません。しかしながら、構造要素56の決定…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、米国国立衛生研究所助成金R15GM135904(IMに授与)および国立衛生研究所助成金GM110552(DBOに授与)によって支援されました。

Materials

490 nm LED laser Horiba 1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne Life Technologies A20347
Agar Difco DF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne Life Technologies A10254
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne Life Technologies S10904
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne Life Technologies S10906
Amicon Ultra­4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) Sigma UFC805008
Dodecylmaltoside (DDM) Anatrace D310
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
extended signal peptide SP41 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
FluorEssence Horiba version 2.4 spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer
Fluoromax 4 spectrofluorometer Horiba N/A
GlobalsWE Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine spectral analysis program for time-resolved decays
H­4­Azido­Phe­OH BACHEM 4020250.0001
LB (Miller) Broth Fisher Scientific BP9723
Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) Sigma-Aldrich 420816 dilution is needed to make a proper scattering solution
PTI Felix GX Horiba version 4.1.0.4096 spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument
PTI Time Master Instrument Horiba NA
Pymol Molecular Graphics Program Schrodinger version 2.4
Water bath Thermo Scientific NESLAB RTE 10
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Citer Cet Article
Northrop, J., Oliver, D. B., Mukerji, I. Förster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features. J. Vis. Exp. (181), e63433, doi:10.3791/63433 (2022).
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