JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimie

Kartläggning av Resonansenergiöverföring: En ny metod för att belysa globala strukturella egenskaper

Published: March 16, 2022
doi:
10.3791/63433
, ,
1Molecular Biology and Biochemistry Department,Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program,Wesleyan University

Summary

Studien beskriver metodiken för FRET-kartläggning inklusive val av märkningsställen, val av färgämnen, förvärv och dataanalys. Denna metod är effektiv för att bestämma bindningsställen, konformationsförändringar och dynamiska rörelser i proteinsystem och är mest användbar om den utförs tillsammans med befintlig 3D-strukturell information.

Abstract

Försterresonansenergiöverföring (FRET) är en etablerad fluorescensbaserad metod som används för att framgångsrikt mäta avstånd i och mellan biomolekyler in vitro såväl som inom celler. I FRET relaterar effektiviteten av energiöverföring, mätt genom förändringar i fluorescensintensitet eller livslängd, till avståndet mellan två fluorescerande molekyler eller etiketter. Bestämning av dynamik och konformationsförändringar från avstånden är bara några exempel på tillämpningar av denna metod på biologiska system. Under vissa förhållanden kan denna metod lägga till och förbättra befintliga röntgenkristallstrukturer genom att ge information om dynamik, flexibilitet och anpassning till bindningsytor. Vi beskriver användningen av FRET och tillhörande avståndsbestämningar för att belysa strukturella egenskaper, genom identifiering av ett bindningsställe eller orienteringar av dimerunderenheter. Genom omdömesgilla val av märkningsplatser, och ofta användning av flera märkningsstrategier, har vi framgångsrikt tillämpat dessa kartläggningsmetoder för att bestämma globala strukturella egenskaper i ett protein-DNA-komplex och SecA-SecYEG-proteintranslokationssystemet. I SecA-SecYEG-systemet har vi använt FRET-kartläggningsmetoder för att identifiera preproteinbindningsstället och bestämma den lokala konformationen av den bundna signalsekvensregionen. Denna studie beskriver stegen för att utföra FRET-kartläggningsstudier, inklusive identifiering av lämpliga märkningsställen, diskussion om möjliga etiketter inklusive icke-inhemska aminosyrarester, märkningsprocedurer, hur man utför mätningar och tolkning av data.

Introduction

För proteiner leder belysning av dynamik tillsammans med 3-dimensionell (3-D) strukturell kunskap till en ökad förståelse för struktur-funktionssamband mellan biomolekylära system. Strukturella metoder, såsom röntgenkristallografi och kryogen elektronmikroskopi, fångar en statisk struktur och kräver ofta bestämning av flera strukturer för att belysa aspekter av biomolekylbindning och dynamik1. I den här artikeln beskrivs en lösningsbaserad metod för att mappa globala strukturella element, till exempel bindningsställen eller bindningsinteraktioner, som potentiellt är mer tillfälliga och mindre enkla att fångas upp med statiska metoder. Starka kandidatsystem för denna metodik är sådana där en 3D-struktur tidigare har bestämts genom röntgenkristallografi, NMR-spektroskopi eller andra strukturella metoder. I det här fallet utnyttjar vi röntgenkristallstrukturen i SecA-SecYEG-komplexet, en central aktör i proteinets allmänna sekretoriska väg, för att kartlägga placeringen av ett signalpeptidbindningsställe med hjälp av Förster-resonansenergiöverföring (FRET) före transporten av preproteinet över membranet2. Manipulation av det biologiska systemet genom genetiska modifieringar i kombination med vår kunskap om 3D-strukturen möjliggjorde bestämning av konformationen av signalsekvensen och den tidiga mogna regionen omedelbart före införande i kanal 3.

FRET innebär strålningsfri överföring av energi från en molekyl (givare) till en annan (acceptor) på ett avståndsberoende sätt som är genom rymden 4,5. Effektiviteten av denna överföring övervakas antingen genom en minskning av givaren eller en ökning av acceptorns fluorescensintensitet. Energiöverföringens effektivitet kan beskrivas som

E = R06/(R06 + R6)

där R0-värdet är det avstånd på vilket överföringen är 50% effektiv6. Tekniken har tidigare beskrivits som en molekylär linjal och är effektiv för att bestämma avstånd i intervallet 2,5-12 nm, beroende på identiteten hos donator-acceptorfärgerna 4,7,8,9. Givarens fluorescensintensiteter och livslängder med eller utan acceptor gör det möjligt att bestämma överföringseffektivitet och följaktligen avstånd 5,8. På grund av teknikens tillgänglighet, metodens känslighet och användarvänlighet har FRET också funnit bred tillämpning inom områden som enmolekylär fluorescensspektroskopi och konfokalmikroskopi6. Tillkomsten av fluorescerande proteiner såsom grönt fluorescerande protein har gjort observationen av intracellulär dynamik och levande cellavbildning relativt lätt10,11. Många FRET-applikationer som dessa diskuteras i detalj i det här virtuella problemet.

I denna studie fokuserar vi särskilt på användningen av FRET-mätningar för att ge avståndsvärden för att bestämma strukturella detaljer. Tidigare har FRET-mätningar effektivt använts för att bestämma konformationen av DNA-molekyler när de är bundna till protein 12,13,14, proteinernas inre dynamik och proteinbindningsinteraktioner 15,16,17. Fördelarna med denna metod ligger i förmågan att bestämma flexibla och dynamiska strukturella element i en lösning med relativt låga mängder material. Signifikant är denna metod särskilt effektiv när den används tillsammans med befintlig strukturell information och kan inte användas som ett medel för 3D-strukturbestämning. Metoden ger den bästa insikten och förfining av struktur om arbetet bygger på befintlig strukturell information ofta i kombination med beräkningssimulering18,19. Här beskrivs användningen av avstånd erhållna från steady-state och tidsupplösta FRET-mätningar för att kartlägga ett bindningsställe, vars placering inte var känd, på en befintlig kristallografisk struktur av SecA-SecYEG-komplexet, stora proteiner i den allmänna sekretoriska vägen3.

Den allmänna sekretoriska vägen, ett mycket bevarat system från prokaryoter till eukaryoter till arkéer, förmedlar transporten av proteiner antingen över eller in i membranet till deras funktionella plats i cellen. För gramnegativa bakterier, såsom E. coli, organismen som används i vår studie, sätts proteiner in i eller translokeras över det inre membranet till periplasman. Det bakteriella SecY-kanalkomplexet (kallat translocon) koordinerar med andra proteiner för att translokera det nyligen syntetiserade proteinet, vilket riktas till dess korrekta plats i cellen genom en signalsekvens som vanligtvis ligger vid N-terminalen20,21. För proteiner bundna till periplasman associerar ATPase SecA-proteinet med ribosomens utgångstunnel och med preproteinet efter att cirka 100 rester har översatts22. Tillsammans med SecB-chaperonproteinet upprätthåller det preproteinet i ett utfällt tillstånd. SecA binder till SecYEG-translokonet, och genom många cykler av ATP-hydrolys underlättar proteintransporten över membranet 23,24.

SecA är ett multidomänprotein som finns i cytosoliska och membranbundna former. Ett homodimeriskt protein i cytosolen, SecA består av en preproteinbindning eller tvärbindningsdomän25, två nukleotidbindande domäner, en spiralformad vingdomän, en spiralformad ställningsdomän och de två helixfingerna (THF) 26,27,28,29 (figur 1). I tidigare kristallografiska studier av SecA-SecYEG-komplexet föreslog placeringen av THF att den var aktivt involverad i proteintranslokation och efterföljande tvärbindningsexperiment med signalpeptid fastställde ytterligare betydelsen av denna region vid proteintranslokation 30,31. Tidigare studier, med hjälp av FRET-kartläggningsmetoden, visade att exogena signalpeptider binder till denna region av SecA 2,32. För att fullt ut förstå konformationen och placeringen av signalsekvensen och den tidiga mogna regionen av preproteinet före införande i SecYEG-kanalen skapades en proteinchimär där signalsekvensen och resterna av den tidiga mogna regionen fästes till SecA genom en Ser-Gly-länkare (Figur 1). Med hjälp av denna biologiskt livskraftiga konstruktion visades det vidare att signalsekvensen och den tidiga mogna regionen av preproteinet binder till THF på ett parallellt sätt2. Därefter användes FRET-kartläggningsmetoden för att belysa konformationen och placeringen av signalsekvensen och den tidiga mogna regionen i närvaro av SecYEG enligt beskrivningen nedan3.

Kunskap om 3D-strukturen i SecA-SecYEG-komplexet33,34,35 och den möjliga platsen för bindningsstället gjorde det möjligt för oss att på ett klokt sätt placera givaracceptoretiketter på platser där skärningspunkten mellan enskilda FRET-avstånd identifierar bindningsställets plats. Dessa FRET-kartläggningsmätningar avslöjade att signalsekvensen och den tidiga mogna regionen av preproteinet bildar en hårnål med spetsen belägen vid mynningen av SecYEG-kanalen, vilket visar att hårnålsstrukturen är mallad före kanalinsättning.

Protocol

1. Val av märkningswebbplatser Identifiera minst tre potentiella märkningsställen för att triangulera det förmodade bindningsstället på de befintliga proteinstrukturerna. I detta fall identifierades SecA, SecYEG och preprotein bundet till SecA genom genetisk fusion2. Välj märkningsställen inom 25-75 Å från det förmodade bindningsstället och i relativt statiska områden av proteinet bestämmer avståndet det specifika FRET-färgparet som ska använda…

Representative Results

Denna studie fokuserade på att bestämma placeringen av preproteinbindningsstället på SecA före införande av preproteinet i SecYEG-kanalen. För att kartlägga bindningsstället utfördes FRET-experiment mellan olika regioner av preproteinet och tre distinkta platser på SecA- och SecYEG-proteinerna (figur 1A-D). Från de erhållna avstånden och tredimensionella strukturerna av SecA, SecYEG och preproteinet förutspåddes placeringen av preproteinbindn…

Discussion

Genom att använda FRET-kartläggningsmetoden identifierade vi signalsekvensbindningsstället på SecA-proteinet. Det är viktigt att närvaron av en 3D-kristallstruktur av komplexet underlättade vår studie. Styrkan i denna kartläggningsmetodik ligger i förmågan att använda en befintlig struktur för att identifiera platser för märkning. Denna metod kan inte användas för att bestämma en 3D-struktur; Bestämning av strukturella element56, förfining av en befintlig struktur<sup class="xr…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health-bidrag R15GM135904 (tilldelat IM) och National Institutes of Health Grant GM110552 (tilldelat DBO).

Materials

490 nm LED laser Horiba 1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne Life Technologies A20347
Agar Difco DF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne Life Technologies A10254
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne Life Technologies S10904
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne Life Technologies S10906
Amicon Ultra­4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) Sigma UFC805008
Dodecylmaltoside (DDM) Anatrace D310
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
extended signal peptide SP41 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
FluorEssence Horiba version 2.4 spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer
Fluoromax 4 spectrofluorometer Horiba N/A
GlobalsWE Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine spectral analysis program for time-resolved decays
H­4­Azido­Phe­OH BACHEM 4020250.0001
LB (Miller) Broth Fisher Scientific BP9723
Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) Sigma-Aldrich 420816 dilution is needed to make a proper scattering solution
PTI Felix GX Horiba version 4.1.0.4096 spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument
PTI Time Master Instrument Horiba NA
Pymol Molecular Graphics Program Schrodinger version 2.4
Water bath Thermo Scientific NESLAB RTE 10
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
  2. Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Conserved SecA signal peptide-binding site revealed by engineered protein chimeras and Forester resonance energy transfer. Biochimie. 55 (9), 1291-1300 (2016).
  3. Zhang, Q., et al. Alignment of the protein substrate hairpin along the SecA two-helix finger primes protein transport in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9343-9348 (2017).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
  6. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool – understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  7. Magde, D., Wong, R., Seybold, P. G. Fluorescence quantum yields and their relation to lifetimes of rhodamine 6G and fluorescein in nine solvents: improved absolute standards for quantum yields. Photochemistry and Photobiology. 75 (4), 327-334 (2002).
  8. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in Enzymology. 211, 353-388 (1992).
  9. . R0 Values from Some Alexa Fluor Dyes – Table 1.6 Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/r0-values-for-some-alexa-fluor-dyes.html (2021)
  10. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors. 16 (9), 1488 (2016).
  11. Day, R. N., Davidson, M. W. Fluorescent proteins for FRET microscopy: monitoring protein interactions in living cells. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular, and Developmental Biology. 34 (5), 341-350 (2012).
  12. Lee, S. J., Syed, S., Ha, T. Single-Molecule FRET Analysis of Replicative Helicases. Methods in Molecular Biology. 1805, 233-250 (2018).
  13. Uhm, H., Hohng, S. Single-Molecule FRET Assay for Studying Cotranscriptional RNA Folding. Methods in Molecular Biology. 2106, 271-282 (2020).
  14. Globyte, V., Joo, C. Single-molecule FRET studies of Cas9 endonuclease. Methods in Enzymology. 616, 313-335 (2019).
  15. Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-Molecular Förster Resonance Energy Transfer Measurement on Structures and Interactions of Biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492 (2021).
  16. Catipovic, M. A., Bauer, B. W., Loparo, J. J., Rapoport, T. A. Protein translocation by the SecA ATPase occurs by a power-stroke mechanism. The EMBO Journal. 38 (9), 101140 (2019).
  17. Seinen, A. B., Spakman, D., van Oijen, A. M., Driessen, A. J. M. Cellular dynamics of the SecA ATPase at the single molecule level. Scientific Reports. 11 (1), 1433 (2021).
  18. Dimura, M., et al. Quantitative FRET studies and integrative modeling unravel the structure and dynamics of biomolecular systems. Current Opinion in Structural Biology. 40, 163-185 (2016).
  19. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nature Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  20. Paetzel, M. Structure and mechanism of Escherichia coli type I signal peptidase. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (8), 1497-1508 (2014).
  21. Ng, D., Brown, J., Walter, P. Signal sequences specify the targeting route to the endoplasmic reticulum membrane. The Journal of Cell Biology. 134 (2), 269-278 (1996).
  22. Huber, D., et al. SecA Cotranslationally Interacts with Nascent Substrate Proteins In Vivo. Journal of Bacteriology. 199 (2), 00622 (2017).
  23. Lill, R., et al. SecA protein hydrolyzes ATP and is an essential component of the protein translocation ATPase of Escherichia coli. The EMBO Journal. 8 (3), 961-966 (1989).
  24. Lill, R., Dowhan, W., Wickner, W. The ATPase activity of SecA is regulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. Cell. 60 (2), 271-280 (1990).
  25. Kimura, E., Akita, M., Matsuyama, S., Mizushima, S. Determination of a region of SecA that interacts with presecretory proteins in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6600-6606 (1991).
  26. Hunt, J. F., et al. Nucleotide control of interdomain interactions in the conformational reaction cycle of SecA. Science. 297 (5589), 2018-2026 (2002).
  27. Sharma, V., et al. Crystal structure of Mycobacterium tuberculosis SecA, a preprotein tranlsocating ATPase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2243-2248 (2003).
  28. Vassylyev, D., et al. Crystal structure of the translocation ATPase SecA from Thermus thermophilus reveals a parallel, head-to-head dimer. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 248-258 (2006).
  29. Zimmer, J., Li, W., Rapoport, T. A. A novel dimer interface and conformational changes revealed by an X-ray structure of B. subtilis SecA. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 259-265 (2006).
  30. Zimmer, J., Rapoport, T. A. Conformational flexibility and peptide interaction of the translocation ATPase SecA. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 606-612 (2009).
  31. Bauer, B. W., Rapoport, T. A. Mapping polypeptide interactions of the SecA ATPase during translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (49), 20800-20805 (2009).
  32. Auclair, S., et al. Mapping of the signal peptide-binding domain of Escherichia coli SecA using Förster resonance energy transfer. Biochimie. 49 (4), 782-792 (2010).
  33. Zimmer, J., Nam, Y., Rapoport, T. A. Structure of a complex of the ATPase SecA and the protein-translocation channel. Nature. 455 (7215), 936-943 (2008).
  34. Li, L., et al. Crystal structure of a substrate-engaged SecY protein-translocation channel. Nature. 531 (7594), 395-399 (2016).
  35. Ma, C., et al. Structure of the substrate-engaged SecA-SecY protein translocation machine. Nature Communications. 10 (1), 2872 (2019).
  36. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  37. Jilaveanu, L. B., Oliver, D. In vivo membrane topology of Escherichia coli SecA ATPase reveals extensive periplasmic exposure of multiple functionally important domains clustering on one face of SecA. The Journal of Biological Chemistry. 282 (7), 4661-4668 (2007).
  38. Ramamurthy, V., Oliver, D. Topology of the integral-membrane form of Escherichiacoli SecA protein. The Journal of Biological Chemistry. 272 (37), 23239-23246 (1997).
  39. Chin, J., et al. Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  40. Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Journal of the American Chemical Society. 125 (39), 11782-11783 (2003).
  41. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Analytical Biochemistry. 100 (1), 95-97 (1979).
  42. Mitchell, C., Oliver, D. B. Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by Escherichia coli SecA ATPase. Molecular Microbiology. 10 (3), 483-497 (1993).
  43. Thiol-reactive Probe Labeling Protocol. Thermo Fischer Scientific Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/thiol-reactive-probe-labeling-protocol.html (2021)
  44. Click Chemistry – Section 3.1. Thermo Fischer Scientific Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/reagents-for-modifying-groups-other-than-thiols-or-amines/click-chemistry.html (2021)
  45. Correction Factor. AAT Bioquest Available from: https://www.aatbio.com/resources/correction-factor/ (2019)
  46. Calculate dye:protein (F/P) molar ratios. Thermo Fischer Scientific Available from: https://tools.thermofischer.com/content/sfs/brochures/TR0031-Calc-FP-rations.pdf (2011)
  47. A Guide to Recording Fluorescence Quantum Yields. Horiba Scientific Available from: https://static.horiba.com/fileadmin/Horiba/Application/Materials/Material_Research/Quantum_Dots/quantumyieldstrad.pdf (2011)
  48. Ivanov, V., Li, M., Mizuuchi, K. Impact of emission anisotropy on fluorescence stectroscopy and FRET distance measurements. Biophysical Journal. 97 (3), 922-929 (2009).
  49. Auclair, S., Oliver, D., Mukerji, I. Defining the solution state dimer structure of Escherichia coli SecA using Forster resonance energy transfer. Biochimie. 52 (14), 2388-2401 (2013).
  50. . The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4 Available from: https://pymol.org/2/ (2021)
  51. Musial-Siwek, M., Rusch, S. L., Kendall, D. A. Selective photoaffinity labeling identifies the signal peptide binding domain on SecA. Journal of Molecular Biology. 365 (3), 637-648 (2007).
  52. Miller, A., Wang, L., Kendall, D. A. Synthetic signal peptides specifically recognize SecA and stimulate ATPase activity in the absence of preprotein. The Journal of Biological Chemistry. 273 (19), 11409-11412 (1998).
  53. Gelis, I., et al. Structural basis for signal-sequence recognition by the translocase motor SecA as determined by NMR. Cell. 131 (4), 756-769 (2007).
  54. Erlandson, K. J., et al. A role for the two-helix finger of the SecA ATPase in protein translocation. Nature. 455 (7215), 984-988 (2008).
  55. Das, S., Oliver, D. Mapping of the SecA-SecY and SecA-SecG interfaces by site-directed in vivo photocross-linking. The Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12371-12380 (2011).
  56. Wheatley, E. G., Pieniazek, S. N., Vitoc, I., Mukerji, I., Beveridge, D. L. Molecular Dynamics Structure Prediction of a Novel Protein-DNA Complex: Two HU Proteins with a DNA Four-way Junction. Innovations in Biomolecular Modeling and Simulations: Volume 2. , 111-128 (2012).
  57. Vitoc, C. I., Mukerji, I. HU binding to a DNA four-way junction probed by Förster resonance energy transfer. Biochimie. 50 (9), 1432-1441 (2011).
  58. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).

Tags

Keywords Extracted From The Given Text: FRET MappingLigand Binding SitesSubunit OrientationConformational ChangesDynamic MotionsBiomolecular SystemLabeling SitesR0 ValuesDonor DyeAcceptor DyeSpectrofluorometerEmission ScanExcitation Wavelength
check_url/fr/63433?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Northrop, J., Oliver, D. B., Mukerji, I. Förster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features. J. Vis. Exp. (181), e63433, doi:10.3791/63433 (2022).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image