Summary
Detta protokoll presenterar en detaljerad sammanfattning av strategier för att inokulera växtrötter med jordburna mikrober. Exemplifierat för svamparna Verticillium longisporum och Verticillium dahliae beskrivs tre olika rotinfektionssystem. Potentiella tillämpningar och möjliga nedströmsanalyser lyfts fram, och fördelar eller nackdelar diskuteras för varje system.
Abstract
Rhizosfären hyser ett mycket komplext mikrobiellt samhälle där växtrötterna ständigt utmanas. Rötter är i nära kontakt med en mängd olika mikroorganismer, men studier av jordburna interaktioner ligger fortfarande bakom de som utförs på ovanjordiska organ. Även om vissa ympningsstrategier för att infektera modellväxter med modellrotpatogener beskrivs i litteraturen, är det fortfarande svårt att få en omfattande metodologisk översikt. För att ta itu med detta problem beskrivs tre olika rotinokuleringssystem exakt som kan tillämpas för att få insikt i biologin hos rot-mikrobinteraktioner. Som illustration användes Verticillium-arter (nämligen V. longisporum och V. dahliae) som rotinkräktande modellpatogener. Metoderna kan emellertid enkelt anpassas till andra rotkoloniserande mikrober - både patogena och fördelaktiga. Genom att kolonisera växten xylem uppvisar vaskulära jordburna svampar som Verticillium spp. en unik livsstil. Efter rotinvasion sprids de via xylemkärlen akropetalt, når skottet och framkallar sjukdomssymtom. Tre representativa växtarter valdes som modellvärdar: Arabidopsis thaliana, ekonomiskt viktig raps (Brassica napus) och tomat (Solanum lycopersicum). Steg-för-steg-protokoll ges. Representativa resultat av patogenicitetsanalyser, transkriptionsanalyser av markörgener och oberoende bekräftelser av reporterkonstruktioner visas. Vidare diskuteras fördelarna och nackdelarna med varje ympningssystem grundligt. Dessa beprövade protokoll kan hjälpa till att tillhandahålla metoder för forskningsfrågor om rot-mikrobinteraktioner. Att veta hur växter klarar av mikrober i jorden är avgörande för att utveckla nya strategier för att förbättra jordbruket.
Introduction
Naturliga jordar är bebodda av ett häpnadsväckande antal mikrober som kan vara neutrala, skadliga eller fördelaktiga för växter1. Många växtpatogener är jordburna, omger rötterna och attackerar det underjordiska organet. Dessa mikroorganismer tillhör en mängd olika klader: svampar, oomyceter, bakterier, nematoder, insekter och vissa virus 1,2. När miljöförhållandena gynnar infektion kommer mottagliga växter att bli sjuka och avkastningen minskar. Effekterna av klimatförändringarna, såsom den globala uppvärmningen och extrema väderförhållanden, kommer att öka andelen jordburna växtpatogener3. Därför kommer det att bli allt viktigare att studera dessa destruktiva mikrober och deras inverkan på livsmedels- och foderproduktionen, men också på naturliga ekosystem. Dessutom finns det mikrobiella mutualister i jorden som tätt interagerar med rötter och främjar växttillväxt, utveckling och immunitet. När de konfronteras med patogener kan växter aktivt rekrytera specifika motståndare i rhizosfären som kan stödja värdöverlevnad genom att undertrycka patogener 4,5,6,7. Mekanistiska detaljer och vägar som är involverade i fördelaktiga rot-mikrobinteraktioner är emellertid ofta fortfarande okända6.
Det är därför viktigt att utöka den allmänna förståelsen av rot-mikrobinteraktioner. Tillförlitliga metoder för att inokulera rötter med jordburna mikroorganismer är nödvändiga för att utföra modellstudier och överföra resultaten till jordbruksapplikationer. Gynnsamma interaktioner i jorden studeras till exempel med Serendipita indica (tidigare känd som Piriformospora indica), kvävefixerande Rhizobium spp. eller mykorrhizala svampar, medan kända jordburna växtpatogener inkluderar Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp. och Verticillium spp.1. De två senare är svampsläkten som är globalt fördelade och orsakar kärlsjukdomar2. Verticillium spp. (Ascomycota) kan infektera hundratals växtarter - till stor del dikotyledoner, inklusive örtartade ettåriga, träiga stauder och många grödor 2,8. Hyfer av Verticillium kommer in i roten och växer både intercellulärt och intracellulärt mot den centrala cylindern för att kolonisera xylemkärlen 2,9. I dessa kärl förblir svampen under större delen av sin livscykel. Eftersom xylemsaften är näringsfattig och bär växtförsvarsföreningar måste svampen anpassa sig till denna unika miljö. Detta åstadkoms genom utsöndring av koloniseringsrelaterade proteiner som gör det möjligt för patogenen att överleva i sin värd10,11. Efter att ha nått rotvaskulaturen kan svampen spridas inom xylemkärlen akropetalt till lövverket, vilket leder till systemisk kolonisering av värden 9,12. Vid denna tidpunkt påverkas växten negativt i tillväxt 9,10,13. Till exempel förekommer stunting och gula löv samt för tidig senescens 13,14,15,16.
En medlem av detta släkte är Verticillium longisporum, som är mycket anpassad till brassicaceous värdar, såsom den agronomiskt viktiga oljeväxtrapsen, blomkålen och modellväxten Arabidopsis thaliana12. Flera studier kombinerade V. longisporum och A. thaliana för att få omfattande insikter i jordburna kärlsjukdomar och de resulterande rotförsvarssvaren 13,15,16,17. Enkel känslighetstestning kan realiseras genom att använda V. longisporum / A. thaliana modellsystem och väletablerade genetiska resurser är tillgängliga för båda organismerna. Nära besläktad med V. longisporum är patogenen Verticillium dahliae. Även om båda svamparterna utför en liknande vaskulär livsstil och invasionsprocess, är deras förökningseffektivitet från rötter till löv och de framkallade sjukdomssymtomen i A. thaliana olika: medan V. longisporum vanligtvis inducerar tidig senescens, resulterar V. dahliae-infektion i vissnande18. Nyligen presenterade en metodologisk sammanfattning olika rotinokuleringsstrategier för att infektera A. thaliana med V. longisporum eller V. dahliae, vilket hjälpte till att planera experimentella inställningar19. På fältet orsakar V. longisporum ibland betydande skador i rapsproduktion12, medan V. dahliae har ett mycket brett värdområde som omfattar flera odlade arter, såsom vinrankor, potatis och tomat8. Detta gör båda patogenerna ekonomiskt intressanta modeller att studera.
Således använder följande protokoll både V. longisporum och V. dahliae som modellrotpatogener för att exemplifiera möjliga metoder för rotinokulationer. Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), raps (Brassica napus) och tomat (Solanum lycopersicum) valdes som modellvärdar. Detaljerade beskrivningar av metoderna finns i texten nedan och den medföljande videon. Fördelar och nackdelar för varje ympningssystem diskuteras. Sammantaget kan denna protokollsamling hjälpa till att identifiera en lämplig metod för specifika forskningsfrågor i samband med rot-mikrobinteraktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Media för svampkulturer och växtinokuleringssystem
- Flytande potatisdextrosbuljong (PDB): Förbered 21 g / L PDB i ultrarent vatten i en värmestabil kolv.
- Flytande Czapek dextrosbuljong (CDB): Förbered 42 g / L CDB i ultrarent vatten i en värmestabil kolv.
- Medium för petriskålens ympningssystem: Förbered en värmestabil kolv med 1,5 g /L Murashige och Skoog medium (MS) och 8 g/L agar i ultrarent vatten.
OBS: Undvik socker i detta medium eftersom det kommer att leda till överdriven svamptillväxt efter ympning. - Medium för det plastkoppbaserade ympningssystemet: Förbered en värmestabil kolv med 4,4 g/l MS, 0,2 g/L MgSO4, 1 g/LKNO3, 0,5 g/L2-(N-morpholino)etansulfonsyra (MES) och 6,0 g/L agar i ultrarent vatten och justera pH till 5,7 med 5 M KOH.
OBS: Undvik socker i detta medium eftersom det kommer att leda till överdriven svamptillväxt efter ympning. - 1/4 MS medium: Förbered 1,2 g / L MS i ultrarent vatten.
- Använd autoklaven för att sterilisera alla ovanstående lösningar. Lägg glasflaskorna i korgen, stäng locket och sterilisera i 15 minuter vid 121 °C och 98,9 kPa.
2. Sterilisering av ytan på växtfrön
OBS: Använd alltid nedanstående protokoll för att sterilisera ytan av frön från Arabidopsis, raps och tomat före sådd.
- Överför fröna till ett 2 ml reaktionsrör. Placera röret i en exsiccator med en inre kapacitet på 5,8 L.
- Generera klorgas i exsiccatorn genom att tillsätta 6 ml 33% saltsyra (HCl) till 100 ml 12% vattenhaltig natriumhypoklorit (NaClO).
- Stäng omedelbart locket på exsicatorn och inkubera fröna i 3 timmar i gasen.
3. Förbereda ympningen med Verticilliumsporer (asexuell härledd konidi)
OBS: Odla V. dahliae (stam JR2) på samma sätt som V. longisporum (stam Vl43)17,18,19. Se till att all utrustning och media är bakteriefria och att alla steg utförs i en laminär flödeshuva för att hålla inoculum axenic.
- Fyll 150 ml flytande PDB (steg 1.1) i en 500 ml chicanerykolv och komplettera mediet med 500 mg / L cefotaxim.
- Tillsätt Verticillium conida från glycerollagring till PDB-mediet. Stäng kolven med ett sterilt skumpropp.
- Inkubera kulturen i 7-10 dagar i en mörk låda vid rumstemperatur (RT) under kontinuerlig, horisontell skakning (roterande shaker; 60 rpm). Detta resulterar i små, vita mycelisfärer.
- Ta bort och kassera PDB-supernatanten försiktigt. Det mesta av mycelierna bör förbli i kolven.
- Tillsätt 100 ml flytande CDB (steg 1.2) på mycelien i chicanerykolven och komplettera mediet med 500 mg/L cefotaxim.
- Inkubera ytterligare 4-5 dagar i en mörk låda vid RT under kontinuerlig, horisontell skakning (roterande shaker, 60 rpm) för att inducera sporulering. Supernatanten blir gulgråaktig när konidier släpps.
- Filtrera en del (5-10 ml) av den konidiainnehållande vätskan genom ett filterpapper (partikelretentionsnivå på 8-12 μm) i ett sterilt 50 ml uppsamlingsrör. Detta skiljer sporer från myceli.
- Bestäm sporkoncentrationen med hjälp av en cellräkningskammare och ett mikroskop. Späd med bakteriefritt 1/4 MS-medium i ultrarent vatten tills de sporkoncentrationer som anges nedan erhålls.
OBS: Under mikroskopet är konidierna från V. longisporum mestadels långdragna och 7,1-8,8 μm i storlek, medan V. dahliae conidia är kortare (3,5-5,5 μm) och ganska sfäriska20. - Använd dessa nyskördade konidier som ympning. Se till att utföra experimenten alltid med nyskördade konidier och inte med frysta bestånd, eftersom frysning avsevärt minskar antalet livskraftiga sporer19.
- För långvarig lagring, frys sporerna som högkoncentrerad sporlösning (cirka 1 x 108 sporer/ml) i 25 % glycerol vid -80 °C (lagringsbar upp till 1 år). För nästa experiment, använd dessa glycerolbestånd för att inokulera PDB-mediet i steg 3.2.
4. Ett sterilt in vitro-inokuleringssystem baserat på petriskålar
OBS: För Petriskålssystem17, se till att all utrustning och media är bakteriefria och att alla steg utförs i en laminär flödeshuv.
- Häll mediet (se steg 1.3) i petriskålar efter autoklavering.
- Efter härdning av mediet, packa om petriskålarna i en steril plastpåse och förvara dem upp och ner över natten i kylen (4-10 ° C). Ett kylt medium hjälper till att förhindra glidning av mediet i nästa steg.
- Skär och ta bort en infektionskanal och den övre tredjedelen av det stelnade mediet med en skalpell (figur 1A). Undvik att få vätska eller luft under agarmediet under skärning; annars kommer mediet att glida och stänga infektionskanalen.
- Fördela 50-100 ytsteriliserade Arabidopsis frön med en steril pipettspets på den skurna övre ytan. Sätt fröna i vinkeln där den skurna agarytan kommer i kontakt med petriskålens vägg så att rötter kan växa mellan mediet och petriskålväggen. Detta kommer att underlätta ympningen senare.
- Stäng petriskålarna och försegla dem med luftgenomsläpplig tejp för att möjliggöra gasutbyte.
- Efter stratifiering i 2 dagar i mörkret vid 4 ° C, placera plattorna vertikalt i ett lämpligt rack och odla växterna vid 22 ° C ± 1 ° C under långa dagsförhållanden (16 h ljus / 8 h mörker) i en tillväxtkammare.
- När majoriteten av rötterna når infektionskanalen (ca 9-11 dagar gamla plantor), lägg plattorna horisontellt, öppna dem och tillsätt 500 μL nyskördade Verticillium conidia med en koncentration av 4 x 105 sporer / ml direkt i infektionskanalen, se till att vätskan är jämnt fördelad i kanalen.
- På samma sätt bereda kontrollplattor genom att tillsätta 500 μL av en mock lösning istället för sporer (bakteriefritt 1/4 MS medium).
- Inkubera plattorna horisontellt i ett par minuter tills vätskan har blött in och inte kan läcka ut när plattorna sätts upp vertikalt igen. Stäng sedan locket och försegla plattorna med luftgenomsläpplig tejp.
- Inkubera plattorna vertikalt i tillväxtkammaren. Eventuellt kan du täcka rotdelarna med svarta papperslådor för att mörka rötter och jordburen svamp (se19).
- Utför analyserna vid de föredragna tidpunkterna efter ympning beroende på forskningsfrågan (se figurlegenderna för de exakta tidpunkterna som används här). Nedan följer några förslag.
- Skär bladen från rötterna och skörda båda separat. Ta ut agarremsorna ur petriskålarna för att enkelt komma åt rötterna och dra dem försiktigt ur agaren med pincett. Frys allt växtmaterial omedelbart i flytande kväve.
- Mal proverna i flytande kväve. Extrahera totalt DNA från 100 mg bladmaterial för att via en kvantitativ PCR (qPCR) bestämma mängden svamp-DNA i förhållande till växt-DNA (se19).
- Mal proverna i flytande kväve. Ta 100 mg växtmaterial och extrahera totalt RNA. Genomföra kvantitativ omvänd transkription PCR (qRT-PCR) för att bestämma uttrycket av växtgener (eller svampgener) under angrepp (se19).
- Ta försiktigt bort rötterna från agaren och undvik skador och undersök dem under det fluorescerande mikroskopet.
- Bestäm induktion av markörgener i växtreporterlinjer (t.ex. luciferas, β-glukuronidas eller fluorescerande reportrar 17,19,21).
- Visualisera svampförökning vid roten genom att använda svampreporterlinjer (t.ex. V. longisporum som konstitutivt uttrycker förbättrat grönt fluorescerande protein, Vl-sGFP9) eller genom färgningstekniker (t.ex. genom 5-brom-4-klor-3-indoxyl-N-acetyl-beta-d-glukosaminid (X-beta-D-Glc-Nac)18).
- Skär bladen från rötterna och skörda båda separat. Ta ut agarremsorna ur petriskålarna för att enkelt komma åt rötterna och dra dem försiktigt ur agaren med pincett. Frys allt växtmaterial omedelbart i flytande kväve.
5. Ett sterilt in vitro-inokuleringssystem organiserat med plastkoppar
OBS: Som noterats i den första beskrivningen av denna teknik19, se till att all utrustning och media är bakteriefria och att alla steg utförs i en laminär flödeshuv.
- Använd transparenta plastkoppar med en total volym på 500 ml och sterilisera dem i ett 70% -75% etanolbad i minst 20 min. Torka kopparna i den laminära flödeshuven.
- Häll det autoklaverade mediet (se steg 1.4) i plastmuggarna. Eventuellt tillsätt cefotaxim (slutlig koncentration på 50 mg / L) till det autoklaverade mediet för att förhindra bakteriella föroreningar. Använd 150 ml medium per kopp för experiment med Arabidopsis eller mer medium (250-300 ml per kopp) för experiment med större växtarter (raps, tomat).
- Placera ett plastskikt (steriliserat tidigare genom inkubation i 70% -75% etanol i 20 min) på mediet innan det stelnar (Figur 1B).
OBS: Detta plastskikt innehåller fyra prefabricerade hål i hörnen för att placera ytsteriliserade frön. Detta gör att fröna kan komma åt mediet. Senare förhindrar detta separerande skikt bladen från att röra vid det svampinnehållande mediet, så att mikroberna inte direkt kan attackera bladen och måste ta rotvägen. Ett annat hål är i mitten, vilket möjliggör skärning av infektionskanalen. - När mediet har stelnat, skär agaren med en skalpell genom det prefabricerade mitthålet till ett djup av ca 1,5 cm. Ta bort den skurna agaren för att skapa en infektionskanal i vilken svampsporerna kan tillsättas senare.
- Skrapa agarmediet något med en pipettspets i de fyra mindre hålen för att avbryta den stelnade huden (detta gör att fröna kan suga upp vatten från det vattniga agarmediet). Placera fröna med en pipettspets i de mindre hålen.
- Stäng plastkoppen med en andra, inverterad plastkopp och försegla med luftgenomsläpplig tejp. Tejpen måste tillåta gasutbyte.
- Efter stratifiering i 3 dagar i mörker vid 4 ° C, inkubera koppsystemen under 12 h ljus / 12 h mörker (Arabidopsis, oljeväxtraps) eller 16 h ljus / 8 h mörkerförhållanden (tomat) i tillväxtkamrar vid en konstant temperatur på 22 ° C och 60% fuktighet.
- Följ den rekommenderade åldern av växter för ympning: 21 dagar för Arabidopsis; 5-7 dagar för raps; 12 dagar för tomat.
- Inokulera plantlets med Verticillium genom att tillsätta 1 ml konidialösning (rekommenderad koncentration: 4 x 105 sporer /ml) i infektionskanalen. För att förbereda kontrollprover, tillsätt 1 ml mock lösning utan sporer (bakteriefritt 1/4 MS medium) i kanalen.
- Utför analyserna vid de föredragna tidpunkterna efter ympning beroende på forskningsfrågan (se figurlegenderna för de exakta tidpunkterna som används här). Nedan följer några förslag.
- Ta fotografier av växterna med en digitalkamera ovanifrån och håll avståndet detsamma för varje foto. Kvantifiera bladarean (t.ex. med ImageJ22 eller BlattFlaeche17,19; använd kopparnas längd för att ställa in skalan) och jämför infekterade och kontrollgrupper. Kategorisera utvecklingen av sjukdomssymtom (t.ex. mindre, mer gulaktiga eller nekrotiska blad).
OBS: Om det finns några stjälkar på Arabidopsis, ta bort dem för att få bättre bilder av rosetterna. - Ta bort rötterna och definiera biomassan (färskvikt) av skott från infekterade och kontrollera prover genom att väga. Bestäm den relativa färskvikten19.
- Samla in proverna för molekylära analyser enligt följande.
- Arabidopsis: Ta bort stjälkar om det finns några. Skär rosetterna vid basen från rötterna. Se till att utesluta allt rotmaterial från provet och skörda hela rosetter. Kombinera 4-5 rosetter från olika växter i ett prov och frys bladmaterialet i flytande kväve.
- Dra rötterna försiktigt ur mediet med pincett, tryck och dutta dem med en pappershandduk för att ta bort agarrester och kombinera 4-5 rötter från olika växter till ett prov. Frys omedelbart i flytande kväve.
- Raps/tomat: Skär stamsegment från hypokotylen (t.ex. 1 cm i längd; ta alltid samma stamregion). Kombinera material från 4-5 växter i varje prov och frys in flytande kväve.
- Mal proverna i flytande kväve. Extrahera totalt DNA från 100 mg av blad- eller stammaterialet för att via qPCR bestämma mängden svamp-DNA i förhållande till växt-DNA (se19).
- Mala proverna i flytande kväve, ta 100 mg växtmaterial och extrahera totalt RNA. Utför qRT-PCR för att bestämma uttrycket av växtgener (eller svampgener) vid angrepp (se19).
- Ta fotografier av växterna med en digitalkamera ovanifrån och håll avståndet detsamma för varje foto. Kvantifiera bladarean (t.ex. med ImageJ22 eller BlattFlaeche17,19; använd kopparnas längd för att ställa in skalan) och jämför infekterade och kontrollgrupper. Kategorisera utvecklingen av sjukdomssymtom (t.ex. mindre, mer gulaktiga eller nekrotiska blad).
6. Ett jordbaserat ympningssystem i krukor
- Blanda noggrant jord och sand i ett 3: 1 (jord: sand) volymetriskt förhållande för att underlätta tvättning av substratet från rötterna. Häll blandningen i en autoklavpåse. Om blandningen är för torr, tillsätt en lämplig mängd vatten och blanda den i substratet. Ånga vid 80 ° C i 20 minuter i en autoklav för att minimera mikrobiella föroreningar.
OBS: Undvik uppvärmning till över 80 ° C, eftersom detta kan påverka organiska jordnäringsämnen. - Fyll krukor med jord-sandblandningen och överför dem till brickor. Tillsätt vatten i brickorna ca 1/3 höjden på en kruka, så att jord-sandblandningen blir ordentligt blöt med vatten. Dessutom vattenspraya substratet med en sprayflaska för att säkerställa våta startförhållanden.
- Så 3-4 frön i varje kruka (figur 1C) så att fröna har tillräckligt med avstånd från varandra. Förvara dem i 3 dagar i mörker vid 4 ° C för stratifiering för att synkronisera spiring.
OBS: Förodlar ett överskott av växter, vilket möjliggör ett urval av växter av liknande storlek för ympningsexperimenten och minskar avvikelser på grund av individuella skillnader. - Låt plantorna växa under långa dagsförhållanden (16 h ljus / 8 h mörker; konstant temperatur på 22 ° C; 60% fuktighet) med regelbunden vattning.
- Följ den rekommenderade åldern för växter för ympning: 21 dagar för Arabidopsis, 7 dagar för raps och 10 dagar för tomat. Välj växter av liknande storlek för att utföra "rotdoppinokulering"15,17,23,24. Ta jorden ur krukorna och gräv försiktigt rötterna.
- Tvätta försiktigt bara rötterna i en vattenbehållare och håll rosetterna ur vattnet. Inkubera de tvättade rötterna i 60 min i en petriskål innehållande Verticillium-sporlösningen (rekommenderad koncentration: 2 x 106 sporer / ml). För den icke-infekterade kontrollgruppen, inkubera rötterna i 60 minuter i mocklösningen utan sporer (bakteriefritt 1/4 MS-medium).
- Förbered nya krukor med fuktig, ångsteriliserad jord (80 ° C i 20 min) utan sand. Använd en pipettspets för att göra ett hål i mitten av jorden i varje kruka.
- Placera rötterna direkt i hålet (överför endast en växt per kruka). När du har satt in rötterna, se till att fylla på hålen försiktigt med jord. Undvik att pressa jorden, annars kan repotting orsaka stressymptom som lila löv.
- Odla infekterade och kontrollera grupper under långa dagsförhållanden (16 h ljus / 8 h mörker; en konstant temperatur på 22 ° C; 60% fuktighet) med regelbunden vattning.
- Utför analyserna vid de föredragna tidpunkterna efter ympning beroende på forskningsfrågan (se figurlegenderna för de exakta tidpunkterna som används här). Nedan följer några förslag.
- Ta fotografier av växterna med en digitalkamera ovanifrån och håll avståndet detsamma för varje foto. Kvantifiera bladarean (t.ex. med ImageJ22 eller BlattFlaeche17,19; använd krukans diameter för att ställa in skalan) och jämför infekterade och kontrollgrupper. Kategorisera utvecklingen av sjukdomssymtom (t.ex. mindre, mer gulaktiga eller nekrotiska blad)13.
OBS: Att ta bort stjälkar av Arabidopsis underlättar att ta bilder av rosetterna. - Ta bort rötterna och definiera biomassan (färskvikt) av skott från infekterade och kontrollera prover genom att väga. Bestäm den relativa färskvikten19.
- Alternativt kan du mäta växthöjden eller kategorisera svampväxt från stamsegment för att utvärdera sjukdomens svårighetsgrad13.
- Samla in prover för molekylära analyser enligt följande.
- Arabidopsis: Ta bort stjälkarna. Skär rosetterna vid rotkronan. Kombinera 4-5 rosetter från olika växter till ett prov. Frys bladmaterialet i flytande kväve.
OBS: När det gäller rötter är det svårt att rengöra dem tillräckligt från jorden utan att omprogrammera genuttryck genom tvättning. - Raps/tomat: Skär stamsegment från hypokotylen (t.ex. 1 cm i längd; ta alltid samma stamregion). Kombinera material från 4-5 växter i ett prov och frys det i flytande kväve.
- Mal proverna i flytande kväve. Extrahera totalt DNA från 100 mg blad- eller stammaterial för att via qPCR bestämma mängden svamp-DNA i förhållande till växt-DNA (se19).
- Mala proverna i flytande kväve, ta 100 mg växtmaterial och extrahera totalt RNA. Utför qRT-PCR för att bestämma uttrycket av växtgener (eller svampgener) vid angrepp (se19).
- Ta fotografier av växterna med en digitalkamera ovanifrån och håll avståndet detsamma för varje foto. Kvantifiera bladarean (t.ex. med ImageJ22 eller BlattFlaeche17,19; använd krukans diameter för att ställa in skalan) och jämför infekterade och kontrollgrupper. Kategorisera utvecklingen av sjukdomssymtom (t.ex. mindre, mer gulaktiga eller nekrotiska blad)13.
7. Analysera data
- Beräkna medelvärdet och standardavvikelsen (± SD) baserat på de biologiska replikaten.
- Beräkna de relativa värdena genom att dividera alla resultat från den infekterade gruppen med resultatet av kontrollen. Visa genomsnittet som till exempel "relativt till mock" eller "relativt vildtyp".
- Bestäm statistisk signifikans mellan grupper.
Figur 1: Sammanställning av de tre ympningssystemen och enskilda steg i protokollen. Dessa siffror illustrerar systemen med modellväxten Arabidopsis thaliana. För andra växtarter måste tidpunkten justeras. Orange rutor markeras, för vilka efterföljande analyser rekommenderas mest med respektive system. (A) Häll mediet för ympningssystemet i petriskålar17 och låt det stelna. Förvara tallrikarna i kylen över natten. Skär sedan och ta bort den övre tredjedelen samt infektionskanalen (IC) med en skalpell (vita områden i illustrationen togs bort från agaren, medan blåaktiga områden representerar agar). Placera fröna på skärytan och stäng petriskålarna. Efter stratifiering, placera plattorna vertikalt och låt växterna växa. När de flesta rötterna har nått infektionskanalen, tillsätt sporlösningen med en pipett direkt i kanalen. Se till att lösningen är jämnt fördelad. Stäng petriskålarna och inkubera dem vertikalt i en tillväxtkammare. Tillvägagångssätt som kan följa är expressionsanalys med kvantitativ omvänd transkription PCR (qRT-PCR), mikroskopi med reporterlinjer och kvantifiering av mikrobiellt DNA. (B) Häll mediet för ympningssystemet i plastkoppar19 och överför det separerande plastskiktet med de prefabricerade hålen (fyra små hål i hörnen för att placera fröna och ett stort hål i mitten för infektionskanalen). Låt mediet stelna. Skär och ta bort agarmediet i mitthålet med en skalpell för att få infektionskanalen (IC). Skrapa mediet i de mindre hålen och överför fröna. Stäng koppen med en inverterad kopp och försegla med luftgenomsläpplig tejp (symboliserad i gult). Låt växterna växa. För ympning, tillsätt sporlösningen med en pipett direkt i infektionskanalen. Stäng systemet och fortsätt odlingen i tillväxtkammaren. Tillvägagångssätt som kan följa är expressionsanalys med qRT-PCR, kvantifiering av mikrobiellt DNA och bestämning av färskvikt, bladarea eller andra sjukdomsegenskaper. (C) "Rotdoppinokulering"15,17,23,24: För det jordbaserade ympningssystemet, fyll krukorna med en jord:sandblandning. Överför fröna och låt plantorna växa. Gräva växter av liknande storlek och tvätta rötterna i vatten. Placera de tvättade rötterna i en petriskål som håller lösningen med sporerna. Efter inkubation, sätt in enskilda växter i krukor med jord. Tillvägagångssätt som kan följa är expressionsanalys i löv med qRT-PCR, kvantifiering av mikrobiellt DNA och bestämning av färsk vikt, bladarea eller andra sjukdomsegenskaper. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enligt protokollet odlades och ympades växterna med V. longisporum (stam Vl4325) eller V. dahliae (isolera JR218). Olika scenarier utformades för att bevisa effektiviteten och för att lyfta fram vissa funktioner i de givna protokollen. Representativa resultat visas.
Expressionell induktion av gener som är involverade i den antimikrobiella indol-glukosinolat (IG) biosyntesen är en tillförlitlig indikator för utvärdering av en Verticillium-infektion 17,19,26. I Arabidopsis, MYB51 (MYB-domänprotein 51; AT1G18570) kodar för en transkriptionsfaktor som är involverad i aktiveringen av gener som är nödvändiga för IG-biosyntes27. MYB51 kan fungera som en markörgen som indikerar framgångsrikt angrepp eftersom det konsekvent induceras i rötter av V. longisporum26 eller andra jordburna svampar som Phytophthora parasitica26 och Fusarium oxysporum21. Två dagar efter ympning (2 dpi) i det petriskålbaserade systemet visualiserades induktion av MYB51 i arabidopsis rötter. Reporterväxtlinjen PromMYB51: : YFP21 avslöjade en promotoraktivering och en qRT-PCR-analys bekräftade en signifikant transkriptionsinduktion av denna gen (Figur 2A-B). Sådana experiment syftar till att bestämma uttrycksförändringar i rötter under infektion.
Eftersom Verticillium-arterna som används i denna studie utför en vaskulär livsstil och sprider sig från roten till skottet via xylemkärlen, kan mängden svamp-DNA bestämmas i löv som en parameter för graden av svampförökning. Arabidopsis rotinokulerades i in vitro-systemet i plastkoppar och rosetterna skördades 12 dagar senare. Jämfört med det bakgrundsvärde som detekterats i mockkontrollen har betydande mängder svamp-DNA hittats i löv från infekterade växter (Figur 2C). Detta visar att infektionen har utvecklats framgångsrikt. För ytterligare undersökningar kan mängden svamp-DNA kvantifieras i olika växtgenotyper för att få insikt i rotförsvarssvar. Dessutom samlades rötter vid denna tidpunkt för att testa induktionen av markörgenen via qRT-PCR. MYB51-transkriptöverflöden berikades signifikant (figur 2D). Detta illustrerar att känslighetstester och uttrycksanalyser enkelt kan utföras parallellt med koppsystemet, vilket understryker den stora fördelen med denna procedur.
För att inkludera bevis för att andra modellväxtarter också kan introduceras, infekterades raps med V. longisporum och tomat med V. dahliae i systemet i plastkoppar. På dag 12 efter ympning vid rötterna kvantifierades mängden svamp-DNA i stamsegment som skars vid basen av plantorna (figur 2E-F). Svamp-DNA var detekterbart i båda växtarterna vilket indikerar förökning av patogenerna i växten. Återigen kan olika växtgenotyper testas för att få kunskap om försvarsmekanismer.
Om den rotkoloniserande mikroben av intresse inte sprider sig från rötter till löv, är det inte möjligt att kvantifiera mängden mikrobiellt DNA i löv som en parameter för sjukdomens svårighetsgrad. Ett annat alternativ för att mäta sjukdomens svårighetsgrad är bedömning och extrapolering av symtom hos värden. För att exemplifiera detta ympades Arabidopsis rotdopp med V. dahliae i det jordbaserade systemet och grönbladsområdet utvärderades (figur 2G-H). Medan rosetterna av mock-behandlade växter såg friska och gröna ut, hade patogeninfekterade växter en minskad bladstorlek och gulaktiga eller till och med nekrotiska blad. På detta sätt kan känsligheten hos olika växtgenotyper analyseras och bekräftas, till exempel genom att kvantifiera färskvikten.
Figur 2: Representativa resultat erhållna genom att följa protokollen. (A,B) Arabidopsis rötter ympades med V. longisporum i petriskålsystemet. Reporterlinjen PromMYB51::YFP21 avslöjade en stark aktivering av MYB51-promotorn i infekterade rötter jämfört med mockkontrollen (mikroskopi vid 2 dpi; skalstång: 50 μm). Transkriptionsinduktion av MYB51 i wildtype (WT) rötter bekräftades ytterligare med qRT-PCR-analys (2 dpi). Värden för infekterade prover ges i förhållande till mockprover (inställda på 1) (n = 5; ± SD). (C) Systemisk kolonisering genom V. longisporum: Efter ympning av Arabidopsis rötter i koppsystemet bestämdes den relativa mängden svamp-DNA i löv med kvantitativ PCR (qPCR; 12 dpi). Värden för infekterade prover ges i förhållande till bakgrundsnivå i skenprover (inställda på 1) (n = 3; ± SD). (D) V. longisporum infekterade och mock-behandlade rötter skördades från koppsystemet och qRT-PCR-analys utfördes. Värden på infekterade prover ges i förhållande till mockprover (inställda på 1) (n = 3; ± SD). MYB51 visade sig vara transkriptionsinducerad (12 dpi). (E) Raps inokulerades i koppsystemet med V. longisporum och den relativa mängden svamp-DNA kvantifierades genom qPCR i stamsegment (12 dpi). Värden för infekterade prover ges i förhållande till bakgrundsnivå i skenprover (inställda på 1) (n = 3; ± SD). (F) Tomat ympades i koppsystemet med V. dahliae och den relativa mängden svamp-DNA kvantifierades genom qPCR i stamsegment (12 dpi). Värden för infekterade prover ges i förhållande till bakgrundsnivå i skenprover (inställda på 1) (n = 5; ± SD). (G,H) Arabidopsis var rotdopp inokulerad med V. dahliae i det jordbaserade systemet och representativa bilder av infekterade och mockbehandlade växter visas (21 dpi). Det gröna bladområdet undersöktes. I förhållande till mock (inställd på 1) hade infekterade växter mindre grönt bladområde (n = 5; ± SD). (B-F,H) För grundpar se19; statistik: studentens t-test i förhållande till mock, * p≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund av de enorma avkastningsförluster som orsakas av jordburna fytopatogener1 krävs en förbättring av jordbruksstrategier eller grödor. Den begränsade insikten i patogenesen av jordburna sjukdomar hindrar utvecklingen av mer resistenta växter. Underliggande patomekanismer måste undersökas, för vilka en robust metodologisk plattform krävs. Rapporterade inokuleringsförfaranden har visat att multifaktoriella händelser i rot-mikrobinteraktioner kan dissekeras väl genom att kombinera olika system19. Protokollen som beskrivs ovan är avsedda att ge ett rutinmässigt arbetsflöde för både experter och forskare som är nya inom detta område. Hanteringen är enkel, möjliggör oberoende replikering och den nödvändiga tekniska utrustningen finns i vanliga växtvetenskapliga laboratorier.
Tidiga Verticilliuminfektionshändelser (timmar efter ympning till 6 dpi) kan undersökas i petriskålsystemet, sena händelser (>21 dpi) i det jordbaserade systemet och i koppsystemet temporärt däremellan (4 till 21 dpi). Efter tillsats av sporerna till infektionskanalen i Petri-skålsystemet är de i direkt kontakt med rötterna. Detta möjliggör granskning av tidiga försvarssvar. Som exemplifierat med MYB51-induktionen kan uttrycksförändringar enkelt studeras med genreporterkonstruktioner, qRT-PCR eller till och med genomomfattande "-omics" -metoder17,26. Jämfört med de andra två infektionssystemen är försvarssvaren mer kraftfulla i petriskålarna. På grund av sin lilla storlek i petriskålarna är planterna snabbt övervuxna av svampen och intensiteten i försvarssvaren kan vara ganska onaturlig i sådana analyser19. Uttrycksförändringar kan också studeras i rötter i plastkoppsystemet vilket leder till resultat jämförbara med petriskålsystemet, men med lägre induktionsvärden för markörgener. I den experimentella installationen i koppar är ympningen inte i omedelbar kontakt med rötterna, sporerna måste gro och patogenen måste växa genom mediet mot rötterna. Progression av infektion är långsammare jämfört med Petri-skålsystemet och därför närmare naturliga förhållanden. När det gäller rötter har det jordbaserade systemet snarare en nackdel, eftersom de måste rensas tillräckligt från jorden för analys utan att omprogrammera genuttryck genom tvättning. Således är det mer komplicerat att studera uttrycksförändringar i rötter i jorden. Det är dock möjligt att testa i löv om rotangreppet utlöser svar där.
I både in vitro-inokuleringssystem (petriskålar och plastkoppar) kan yttre föroreningar förhindras så länge varje steg utförs under den laminära flödeshuven med steril utrustning. Således kan bilaterala interaktioner undersökas ostört. Omvänt är det jordbaserade systemet bara "halvsterilt" eftersom växterna inte är hermetiskt isolerade i tillväxtkammaren. Ändå kan det betraktas som det som ligger närmast naturliga förhållanden när växter växer i jord. Rötterna skadas dock i det jordbaserade systemet på grund av upprotning, vilket ger mikrobiell tillgång till vävnaderna. Även om detta kan vara lite artificiellt, kan detta efterlikna naturliga förhållanden som skadar rötter, såsom nematodmatning28.
Petriskålsystemet är väl lämpat för att visualisera dynamiken i patogenspridning med hjälp av fluorescerande märkta stammar (t.ex. V. longisporum stam Vl-sGFP9). Rotfenotyper som härrör från kolonisering är väl observerbara. Å andra sidan är kvantifiering av sjukdomssymtom vid blad/skott i petriskålar knappast möjlig eftersom systemet är ganska litet. Dessutom kan det inte finnas tillräckligt med utrymme för växtarter som är större än Arabidopsis. Alternativt etablerade Behrens et al.29 ett infektionssystem på plattor som är lämpliga för raps, där en borste doppas i en sporsuspension och används för att fördela ympningen längs rötter som växer på agar. För att bedöma symtom är kopp- och jordbaserade system verkligen att föredra. Här kan utvecklingen av symtom (t.ex. minskad bladarea, förlust i färsk vikt, minskad växthöjd, omfattningen av nekrotisk vävnad) utvärderas vid löv / skott. Undersökning av större växtarter, som raps och tomat, är inte ett problem i kopp- och jordbaserade system, vilket framgår av de representativa resultaten. Om den jordburna mikroben som undersöks sprider sig från rot till skott kan patogenspecifikt DNA PCR-amplifieras i förhållande till växt-DNA i skott/bladvävnad. Detta kan fungera som en markör för att genomföra patogenicitetstester med olika växtgenotyper13,19 och är en fördel vid användning av vaskulära patogener som Verticillium som modell. Vice versa kan olika genotyper av patogener tillämpas för att identifiera virulensgener som är nödvändiga för framgångsrik kolonisering.
I alla fall beror den bästa tidpunkten för analyser på genotyp, växtarter och mikrober. Det mest kritiska steget är att definiera den bästa tidpunkten för varje forskningsfråga genom preliminär testning. Vid användning av andra mikrober än Verticillium bör dessutom tillräckliga koncentrationer för ympning initialt räknas ut.
Förutom de möjligheter som redan nämnts erbjuder koppsystemet potential att utöka det för screening av agrokemikalier som kan tillämpas för att begränsa kolonisering med specifika parasitiska mikrober. Biocidkemikaliers inverkan på växtens mikrobiella kolonisering kan testas genom att tillsätta den förmodade antimikrobiella föreningen direkt i agarmediet före (eller under) ympning och övervakning av symtomutveckling hos värden. Detta kan underlätta genomförandet av screeningar för att påskynda upptäckten av nya behandlingar mot markburna sjukdomar.
Även om flera medlemmar av jordmikrobiomet är patogena, är de allra flesta neutrala eller till och med fördelaktiga för växttillväxt1. Det finns möjlighet att använda protokollen för att inokulera växter med fördelaktiga mikroorganismer. Tidigare tillsattes S. indica-sporer i petriskålsystemet för att undersöka de efterföljande svaren i rötter26. Detta breddar spektrumet av de förklarade infektionssystemen för att studera inte bara patogena utan också fördelaktiga interaktioner.
Eftersom det är känt att mikrober i rhizosfären påverkar varandra6, kan detta simuleras genom en parallell ympning med olika mikrobiella arter (eller behandling av växterna först med en och senare med en annan). Detta möjliggör sam-, trippel- eller till och med multikulturmodeller. En mer avancerad utvidgning till adekvata syntetiska samhällen (SynComs, samlingar av mikroorganismer) är tänkbar eftersom detta hjälper till att förstå påverkan av komplexa mikrobiella kompositioner30.
Sammanfattningsvis möjliggör ympningssystemen flera kombinationer för efterföljande analyser och stöder en rad applikationer. Denna samling av metoder är i stort sett tillämplig på olika rotkoloniserande mikrober (både fördelaktiga och patogena) och erbjuder en robust plattform för analys av rot-mikrobinteraktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner Tim Iven och Jaqueline Komorek för tidigare arbete med dessa metoder, gruppen Wolfgang Dröge-Laser (Institutionen för farmaceutisk biologi, Universitetet i Würzburg, Tyskland) för att tillhandahålla den utrustning och de resurser som behövs för detta arbete, och Wolfgang Dröge-Laser samt Philipp Kreisz (båda university of Würzburg) för kritisk korrekturläsning av manuskriptet. Denna studie stöddes av "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG, DR273/15-1,2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar (Gelrite) | Carl Roth | Nr. 0039 | all systems described require Gelrite |
| Arabidopsis thaliana wild-type | NASC stock | Col-0 (N1092) | |
| Autoclave | Systec | VE-100 | |
| BlattFlaeche | Datinf GmbH | BlattFlaeche | software to determine leaf areas |
| Brassica napus wild-type | see Floerl et al., 2008 | rapid-cycling rape | genome ACaacc |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | |
| Chicanery flask 500 mL | Duran Group / neoLab | E-1090 | Erlenmeyer flask with four baffles |
| Collection tubes 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | 114 x 28 mm |
| Czapek Dextrose Broth medium | Duchefa | C1714 | |
| Digital camera | Nikon | D3100 18-55 VR | |
| Exsiccator (Desiccator ) | Duran Group | 200 DN, 5.8 L | Seal with lid to hold chlorine gas |
| Fluorescence Microscope | Leica | Leica TCS SP5 II | |
| HCl | Carl Roth | P074.3 | |
| KNO3 | Carl Roth | P021.1 | ≥ 99 % |
| KOH | Carl Roth | 6751 | |
| Leukopor | BSN medical GmbH | 2454-00 AP | non-woven tape 2.5 cm x 9.2 m |
| MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) | Carl Roth | 4256.2 | Pufferan ≥ 99 % |
| MgSO4 | Carl Roth | T888.1 | Magnesiumsulfate-Heptahydrate |
| Murashige & Skoog medium (MS) | Duchefa | M0222 | MS including vitamins |
| NaClO | Carl Roth | 9062.1 | |
| Percival growth chambers | CLF Plant Climatics GmbH | AR-66L2 | |
| Petri-dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | size ØxH: 92 × 16 mm |
| Plastic cups (500 mL, transparent) | Pro-pac, salad boxx | 5070 | size: 108 × 81 × 102 mm |
| Pleated cellulose filter | Hartenstein | FF12 | particle retention level 8–12 μm |
| poly klima growth chamber | poly klima GmbH | PK 520 WLED | |
| Potato Dextrose Broth medium | SIGMA Aldrich | P6685 | for microbiology |
| Pots | Pöppelmann GmbH | TO 7 D or TO 9,5 D | Ø 7 cm resp. Ø 9.5 cm |
| PromMYB51::YFP | see Poncini et al., 2017 | MYB51 reporter line | YFP (i.e. 3xmVenus with NLS) |
| Reaction tubes 2 mL | Sarstedt | 72.695.400 | PCR Performance tested |
| Rotary (orbital) shaker | Edmund Bühler | SM 30 C control | |
| Sand (bird sand) | Pet Bistro, Müller Holding | 786157 | |
| Soil | Einheitserde spezial | SP Pikier (SP ED 63 P) | |
| Solanum lycopersicum wild-type | see Chavarro-Carrero et al., 2021 | Type: Moneymaker | |
| Thoma cell counting chamber | Marienfeld | 642710 | depth 0.020 mm; 0.0025 mm2 |
| Ultrapure water (Milli-Q purified water) | MERK | IQ 7003/7005 | water obtained after purification |
| Verticillium dahliae | see Reusche et al., 2014 | isolate JR2 | |
| Verticillium longisporum | Zeise and von Tiedemann, 2002 | strain Vl43 |
References
- Mendes, R., Garbeva, P., Raaijmakers, J. M. The rhizosphere microbiome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and human pathogenic microorganisms. FEMS Microbiology Review. 37 (5), 634-663 (2013).
- Yadeta, K. A., Thomma, B. P. H. J. The xylem as battleground for plant hosts and vascular wilt pathogens. Frontiers in Plant Science. 4, 97 (2013).
- Delgado-Baquerizo, M., et al. The proportion of soil-borne pathogens increases with warming at the global scale. Nature Climate Change. 10 (6), 550-554 (2020).
- Berendsen, R. L., et al. Disease-induced assemblage of a plant-beneficial bacterial consortium. The ISME Journal. 12 (6), 1496-1507 (2018).
- Yuan, J., et al. Root exudates drive the soil-borne legacy of aboveground pathogen infection. Microbiome. 6 (1), 156 (2018).
- Liu, H., et al. Evidence for the plant recruitment of beneficial microbes to suppress soil-borne pathogens. New Phytologist. 229 (5), 2873-2885 (2021).
- Wang, H., Liu, R., You, M. P., Barbetti, M. J., Chen, Y. Pathogen biocontrol using plant growth-promoting bacteria (PGPR): role of bacterial diversity. Microorganisms. 9 (9), 1988 (2021).
- Inderbitzin, P., Subbarao, K. V. Verticillium systematics and evolution: how confusion impedes Verticillium wilt management and how to resolve it. Phytopathology. 104 (6), 564-574 (2014).
- Eynck, C., Koopmann, B., Grunewaldt-Stoecker, G., Karlowsky, P., von Tiedemann, A. Differential interactions of Verticillium longisporum und V. dahliae with Brassica napus with molecular and histological techniques. European Journal of Plant Pathology. 118 (3), 259-274 (2007).
- Floerl, S., et al. Defence reactions in the apoplastic proteome of oilseed rape (Brassica napus var. napus) attenuate Verticillium longisporum growth but not disease symptoms. BMC Plant Biology. 8, 129 (2008).
- Leonard, M., et al. Verticillium longisporum elicits media-dependent secretome responses with capacity to distinguish between plant-related environments. Frontiers in Microbiology. 11, 1876 (2020).
- Depotter, J. R. L., et al. Verticillium longisporum, the invisible threat to oilseed rape and other brassicaceous plant hosts. Molecular Plant Pathology. 17 (7), 1004-1016 (2016).
- Fröschel, C., et al. A gain-of-function screen reveals redundant ERF transcription factors providing opportunities for resistance breeding toward the vascular fungal pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1095-1109 (2019).
- Zhou, L., Hu, Q., Johansson, A., Dixelius, C. Verticillium longisporum and V. dahliae: infection and disease in Brassica napus. Plant Pathology. 55 (1), 137-144 (2006).
- Ralhan, A., et al. The vascular pathogen Verticillium longisporum requires a jasmonic acid-independent COI1 function in roots to elicit disease symptoms in Arabidopsis shoots. Plant Physiology. 159 (3), 1192-1203 (2012).
- Reusche, M., et al. Stabilization of cytokinin levels enhances Arabidopsis resistance against Verticillium longisporum. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 850-860 (2013).
- Iven, T., et al. Transcriptional activation and production of tryptophan-derived secondary metabolites in Arabidopsis roots contributes to the defense against the fungal vascular pathogen Verticillium longisporum. Molecular Plant. 5 (6), 1389-1402 (2012).
- Reusche, M., et al. Infections with the vascular pathogens Verticillium longisporum and Verticillium dahliae induce distinct disease symptoms and differentially affect drought stress tolerance of Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 108, 23-37 (2014).
- Fröschel, C. In-depth evaluation of root infection systems using the vascular fungus Verticillium longisporum as soil-borne model pathogen. Plant Methods. 17 (1), 57 (2021).
- Karapapa, V. K., Bainbridge, B. W., Heale, J. B. Morphological and molecular characterization of Verticillium longisporum comb, nov., pathogenic to oilseed rape. Mycological Research. 101 (11), 1281-1294 (1997).
- Poncini, L., et al. In roots of Arabidopsis thaliana, the damage-associated molecular pattern AtPep1 is a stronger elicitor of immune signalling than flg22 or the chitin heptamer. PLoS One. 12 (10), 1-21 (2017).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Fradin, E. F., et al. Genetic dissection of Verticillium wilt resistance mediated by tomato Ve1. Plant Physiology. 150 (1), 320-332 (2009).
- Singh, S., et al. The plant host Brassica napus induces in the pathogen Verticillium longisporum the expression of functional catalase peroxidase which is required for the late phase of disease. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (4), 569-581 (2012).
- Zeise, K., von Tiedemann, A. Application of RAPD-PCR for virulence type analysis within Verticillium dahliae and Verticillium longisporum. Journal of Phytopathology. 150 (10), 557-563 (2002).
- Fröschel, C., et al. Plant roots employ cell-layer-specific programs to respond to pathogenic and beneficial microbes. Cell Host & Microbe. 29 (2), 299-310 (2021).
- Gigolashvili, T., et al. The transcription factor HIG1/MYB51 regulates indolic glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 50 (5), 886-901 (2007).
- Back, M. A., Haydock, P. P. J., Jenkinson, P. Disease complexes involving plant parasitic nematodes and soilborne pathogens. Plant Pathology. 51 (6), 683-697 (2002).
- Behrens, F. H., et al. Suppression of abscisic acid biosynthesis at the early infection stage of Verticillium longisporum in oilseed rape (Brassica napus). Molecular Plant Pathology. 20 (12), 1645-1661 (2019).
- Vorholt, J. A., Vogel, C., Carlström, C. I., Müller, D. B. Establishing causality: opportunities of synthetic communities for plant microbiome research. Cell Host & Microbe. 22 (2), 142-155 (2017).
